JP2015509508A - 胎盤性幹細胞、それを単離するための方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

本明細書は、ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の、単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞に関する。本明細書は、ヒト胎盤性多能性幹細胞を単離するための方法をさらに提供する。方法は：ヒト胎盤から細胞を抽出すること；ならびにヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の細胞を単離すること、ならびにその使用を含む。一方、本明細書は霊長類および他の動物に１０応用できると考えられる。

Description

本明細書は、胎盤性胚性幹細胞、それを単離するための方法およびその使用に関する。

再生医療（ＲＭ）は、新たに現れ、急速に発展している研究および治療学の分野である。それは、細胞、組織または器官を修復、置き換えるまたは再生することによって細胞機能を回復させることを目的としている（Daar AS et al. A proposed definition of regenerative medicine J Tissue Eng Regen 2007 p.179-184）。再生医療は、現在の治療が不十分である状態のための治療処置を提供することに最終的には役立つ可能性がある。これらの状態は、多数あり、とりわけ糖尿病、急性肝不全および心不全、筋障害、関節炎、脳損傷および障害、視覚障害、腎障害ならびに造血器および免疫の疾患、ならびに急性白血病およびリンパ腫および多様な固形腫瘍型を含む。ヒト身体は、幹細胞を通じた再生の内在性の系を有する。後者は、ほとんどすべての種類の組織において見出すことができる。

幹細胞は、自己再生可能であり、種々の細胞系列に分化できる。これらの細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および非胚性または成体幹細胞（ＡＳＣ）に分類できる。後者は、すべての種類の組織に分化すること（多能性）はできず、ＥＳＣよりも遅い速度で増殖する。したがってＥＳＣの使用は、ＡＳＣの使用よりも好ましい。

動物およびヒトにおける予備研究は、糖尿病、パーキンソン病、肝不全およびうっ血性心不全などのいくつかの疾患の症状が幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、これらの細胞を移植することによって緩和できること示唆している。しかしこの分野は、ヒトＥＳＣの使用により生じる倫理的問題およびこの分野の知識が非常に限られていることなどの多くの理由により発展が遅い分野である。

上に述べた難点のためにヒト骨髄由来ＡＳＣの使用は、血液がん（白血病）などの特定のがんを処置するために開発されてきた。しかしこの治療は、体系的には行われず、侵襲的手術、広範囲の専門技術および専門センターを必要とすることから数名の臨床医の意欲に依存したままである。一部の研究者らは、臍帯から単離された幹細胞に基づく細胞治療を開発している。しかし、臍帯から抽出できる幹細胞の量は比較的少なく、このアプローチが長く費用のかかる工程になっている。加えて、臍帯から単離される幹細胞は、すべての受取人と免疫適合性とは限らず、移植片拒絶を生じる免疫応答を促進する。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、再生医学についての大きな可能性を提示している。Ｌｉｓｔｅｒら（Hotspots of aberrant epigenomis reprogramming human in human induced pluripotent stem cells, Nature, 471, 2011, p. 68-73）はヒトｉＰＳＣが体細胞記憶および異所性エピゲノミック再プログラミングを含む顕著な再プログラミング多様性を示すことを実証している。

したがって、１）胚に由来しない多量の多能性幹細胞の倫理的回収；２）任意の受取人と免疫適合性の幹細胞の産生；および３）対象の標的に到達する誘導可能な幹細胞の産生を可能にする細胞治療が必要である。

本明細書は、ヒト胎盤から単離された多能性幹細胞を提供する。幹細胞の集団は、少なくとも１つの幹細胞多能性マーカー、ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）および移動マーカーを含む。このように本明細書の幹細胞集団は、任意の受取人と免疫適合性であり、標的組織に移動でき、胎盤が分娩後に処分されることから倫理的問題を生じない。加えて、胎盤によって多量の幹細胞の回収が可能となる。

本明細書は、ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の、単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞を提供する。

本明細書は、
ヒト胎盤から細胞を抽出すること；および
ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の細胞を単離すること
を含む、ヒト胎盤性多能性幹細胞を単離するための方法をさらに提供する。

本明細書は、再生医療、薬物送達、創薬、細胞美容（cell cosmetic）または遺伝子治療における治療目的のためのヒト胎盤性多能性幹細胞の使用であって、前記ヒト胎盤性多能性幹細胞がヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性である使用も提供する。

本明細書は、明細書に記載の方法によって得られるヒト胎盤性多能性幹細胞の医用画像における使用であって、前記ヒト胎盤性多能性幹細胞がヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性である使用も提供する。

本明細書は、ヒト遺伝性障害のためのモデルとしての、または毒性試験のためのモデルとしてのヒト胎盤性多能性幹細胞の使用であって、前記ヒト胎盤性多能性幹細胞がヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性である使用も提供する。

本明細書は、ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性のヒト胎盤性多能性幹細胞を患者に投与することを含む、必要とする患者を処置するための細胞治療法をさらに提供する。

ＳＳＥＡ４、ＨＬＡ−ＧおよびＣＸＣＲ４細胞のＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇを示すグラフである。 ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇおよびＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇを示すグラフである。ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇはＣＸＣＲ４マーカーに対して陽性の細胞を単離するために実施され、ＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇはＳＳＥＡ４およびＨＬＡ−Ｇに対して陽性の細胞を単離するためにＣＸＣＲ４に対して陽性の細胞についてさらに実施される。 ＳＳＥＡ４、ＨＬＡ−ＧおよびＣＸＣＲ４細胞のＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇを示すグラフである。 ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇおよびＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇを示すグラフである。ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇはＣＸＣＲ４マーカーに対して陽性の細胞を単離するために実施され、ＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇはＳＳＥＡ４およびＨＬＡ−Ｇに対して陽性の細胞を単離するためにＣＸＣＲ４に対して陽性の細胞についてさらに実施される。 ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰおよびＯＣＴ−４のＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇを示すグラフである。 細胞生存率を示すグラフである。 ＳＳＥＡ４またはＨＬＡ−Ｇの存在を確認するＦＡＣＳｃａｎ分析の代表的例示である。 対象の幹細胞におけるＣＸＣＲ４免疫染色の代表的例示である。

用語「ヒト胎盤」は、母親の血液供給を介して栄養分の取り込み、老廃物の排出およびガス交換ができるように、発育している胎児を子宮壁に繋いでいる器官を指す。分娩の際に胎盤は通常処分される。胎盤は通常の乳児の分娩後に得られるが、流産の際にも得ることができる。

表現「多能性幹細胞」は、３種の胚葉（内胚葉、中胚葉または外胚葉）のいずれにも分化する潜在力を有する細胞を指す。したがって多能性幹細胞は、任意の胎性のまたは成体の細胞型を生じさせることができる。しかし多能性細胞は、それらが胎盤などの胚体外の組織に寄与するための潜在能力を欠いていることから、それ自体が胎性のまたは成体の生物に発達できないことは周知である。本明細書の多能性幹細胞は、胎盤から単離される。液体の流れに懸濁された細胞に対する酵素消化、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）および磁気活性化セルソーター（ＭＡＣＳ）などの、胎盤由来の多能性幹細胞を単離するための技術は周知である。

表現「に対して陽性」は、マーカーを発現している細胞を指す。一態様ではマーカーは、細胞の表面に発現される。選択されたマーカーに結合できる抗体による技術などのマーカーに対して陽性の細胞を検出するための技術は、周知である。例えば、マーカーに特異的な一次抗体は、細胞とインキュベートされる。抗体は特異的マーカーと結合し、一次抗体に特異的な二次標識抗体が細胞とインキュベートされる。そのように、細胞がマーカーを発現する場合、次いで細胞は標識化され、検出できる。細胞がマーカーを発現しない場合、標識は検出されない。ＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇまたはＥＬＩＳＡなどの方法が使用できる。

表現「ヒト白血球抗原−Ｇ」（ＨＬＡ−Ｇ）は、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子によってコードされることが周知のポリペプチドを指す。このタンパク質は、ＨＬＡ非古典的クラスＩ重鎖パラログに属している。クラスＩ分子は、重鎖および軽鎖からなるヘテロ二量体である（ベータ−２ミクログロブリン）。重鎖は膜に固定されている。ＨＬＡ−Ｇは、胎生期由来の胎盤性細胞で発現されていることが周知であり、妊娠中の免疫寛容において役割を果たしている可能性がある。加えて、ＨＬＡ−Ｇを発現している細胞は、移植の際に免疫寛容である（immunotolerable）特徴を提供し、それにより任意の受取人に免疫適合性である（Le Maux A et al. Soluble human leucocyte antigen-G molecules in peripheral blood haematopoietic stem cell transplantation: a specific role to prevent acute graft-versus-host disease and a link with regulatory T cells. Clin Exp Immunol. 2008 Apr;152(1):50-56）。このように、ＨＬＡ−Ｇに対して陽性の本明細書の多能性幹細胞は、移植の際に免疫寛容を促進し、それにより任意の受取人に免疫適合性である。

一実施形態ではＨＬＡ−Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｇの核酸またはアミノ酸配列の一部または全体と少なくとも６５％から９５％同一、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一の配列を含む。ＨＬＡ−Ｇに同一性の百分率を有するポリペプチドが、移植の際に免疫寛容を促進する活性を保持していることは理解される。ＨＬＡ−Ｇに同一性百分率を有するポリペプチドが、検出されるための抗体結合能力を保持していることも理解される。ＨＬＡ−Ｇに対して陽性の細胞を検出するために使用される抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＭｓ ｍＡｂ ＨＬＡ−Ｇ（ＭＥＭＧ／９）−ＡＰＣなど周知である。

表現「移動マーカー」は、細胞を対象の標的に移動させるために細胞によって発現されるポリペプチドを指す。そのように、移動マーカーを発現している細胞は、対象の特定の位置または標的に到達できる。一実施形態では移動マーカーは、ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＣＲ９、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒα）、ＰＤＧＦ−Ｒβ、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、ＲＡＮＴＥＳ−ＲまたはＭＤＣ−Ｒである。本明細書により使用できる移動マーカーは、Honczarenko M et al. Stem cells 2006;24:1030-1041; Si Y et al. J Clin Invest. 2010;120(4):1192-1203およびPonte AL, et al. Stem Cells 2007 Jul;25(7):1737-45. Epub 2007 Mar 29に記載のものを含む。一実施形態では移動マーカーはＣＸＣＲ４である。

炎症誘発性刺激（創傷組織、リポ多糖、ＴＮＦまたはＩＬ１など）は、ＣＸＣＲ４受容体を発現している細胞を誘引し、それに結合することが周知であるストロマ細胞由来因子１−アルファおよびベータ（ＳＤＦ−１）の産生を誘導する。そのように本発明者は、移動マーカーに対して陽性の本明細書の多能性幹細胞は全身投与で炎症部位に移動できると考えている。加えて局所投与では、局所的標的によって誘引される多能性幹細胞は、局所に留まる。

一実施形態では移動マーカーは、上に述べた移動マーカーの核酸またはアミノ酸配列の一部または全体と少なくとも６５％から９５％同一、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一の配列を含む。移動マーカーに同一性の百分率を有するポリペプチドが、前記ポリペプチドが標的に移動できるような移動ポリペプチドの活性を保持していることは理解される。移動マーカーに同一性の百分率を有するポリペプチドが検出されるための抗体結合能力を保持していることも理解される。ＣＸＣＲ４に対して陽性の細胞を検出するために使用される抗体は、ＡｂｃａｍからのＭｓ ｍＡｂ ＣＸＣＲ４およびＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからのＭｓ ｍＡｂ ＣＸＣＲ４−ＰＥ−Ｃｙ（商標）５など周知である。

表現「少なくとも１つの多能性幹細胞マーカー」は、全能性細胞、多能性細胞、オリゴ能性（oligopotent）細胞、単能性細胞、血液細胞、肝細胞、内皮細胞などの任意の他の細胞型から幹細胞を分化する幹細胞によって発現されるポリペプチドを指す。このように前記ポリペプチドを発現している多能性幹細胞は、任意の他の細胞型から単離できる。周知のとおり、多能性幹細胞は、１つより多い多能性幹細胞マーカーに対して陽性である場合がある。

一実施形態では多能性幹細胞マーカーは、ステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）４、ＳＳＥＡ３、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ヒト胚性幹細胞抗原−１（ＨＥＳＣＡ−１）、発生多能性関連（developmental pluripotency associated）５（ＤＰＰＡ５）、フォークヘッドボックス（forkhead box）Ｄ３（ＧＥＮＥＳＩＳ／ＦＯＸＤ３）、未分化胚細胞転写因子（undifferentiated embryonic cell transcription factor）１（ＵＴＦ１）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３Ｂ）、奇形癌腫由来増殖因子１（ＴＤＧＦ１／ＣＲＩＰＴＯ）、低発現遺伝子１（ＲＥＸ１／ＺＦＰ４２）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、コネキシン−４３、コネキシン−４５、ＧＣＴＭ２、ＧＣＴ３４３、胸腺細胞抗原（Ｔｈｙ１／ＣＤ９０）、ガンマ−アミノ酪酸受容体サブユニットベータ−３（ＧＡＢＲＢ３）、ＣＤ９、増殖分化因子−３（ＧＤＦ３）、ＳＴＥＬＬＡＲまたは線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）である。本明細書により使用できる多能性幹細胞マーカーは、International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnology. 2007;25:803-816に記載のものを含む。

一実施形態では多能性幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰまたはＯＣＴ４である。別の実施形態では多能性幹細胞は、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰおよびＯＣＴ４に対して陽性である。別の実施形態では多能性幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ４である。

一実施形態では多能性幹細胞マーカーは、上に述べた多能性幹細胞マーカーの核酸またはアミノ酸配列の一部または全体と少なくとも６５％から９５％同一、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一の配列を含む。多能性幹細胞マーカーに同一性百分率を有するポリペプチドが検出されるための抗体結合能力を保持していることは理解される。多能性幹細胞マーカーに対して陽性の細胞を検出するために使用される抗体は、Ｒ＆ＤからのＭｓ ｍＡｂ Ａｎｔｉ ｈ／ｍ ＳＳＥＡ４、ＡｂｃａｍからのＭｓ ｍＡｂ ＮＡＮＯＧ（ＮＮＧ−８１１）、Ｍｓ ｍＡｂ ＡＬＰ（ＢＧＮ／０３／６６１）およびＭｓ ｍＡｂ ＯＣＴ４など周知である。

核酸およびアミノ酸「配列同一性」を決定するための技術は、当技術分野において周知である。典型的にはそのような技術は、遺伝子に関してｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。一般に「同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）もそれらの「同一性百分率」を決定することによって比較できる。２個の配列の同一性百分率は（核酸であるかアミノ酸配列であるかにかかわらず）配列比較される２個の配列間の正確なマッチ数を短い方の配列の長さで割り、１００を乗じたものである。核酸配列についてのおよその配列比較は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同アルゴリズムによって提供される、Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)。このアルゴリズムは、Dayhoff Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff, ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって標準化されたスコアリングマトリクスを使用してアミノ酸配列に応用できる。配列の同一性百分率を決定するためのこのアルゴリズムの例示的実行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションでＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって提供される。この方法についての初期設定パラメーターは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual、Version 8 (1995) (Genetics Computer Group、Madison、Wis.から入手可能）に記載されている。本明細書の内容で使用できる同一性百分率を確立する別の方法は、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があり、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）によって配給されているプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージである。このパッケージ一組からＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが初期設定パラメーターがスコアリング表について使用される（例えば、ギャップオープンペナルティー（gap open penalty）１２、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）１、およびギャップ６）場合に使用できる。作成されたデータから「マッチ」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性百分率を算出するための他の好適なプログラムは、一般に当技術分野において周知であり、例えば別の配列比較プログラムは（初期設定パラメーターと共に使用される）ＢＬＡＳＴである。例えばＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次の初期設定パラメーターを使用して使用できる：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両；カットオフ＝６０；予測＝１０；Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；分類＝ＨＩＧＨスコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。

本明細書は、本明細書の多能性幹細胞を単離するための方法も提供する。一態様ではヒト胎盤は、分娩後にまず得られる。次いで細胞は胎盤から抽出される。例えば細胞はトリプシンおよびＤＮａｓｅＩを使用して酵素的に抽出できる（例えば胎盤性絨毛組織およそ３５から４０ｇを３７℃で酵素とインキュベートする）。組織から抽出され上清中に存在する細胞は、次いでナイロンメッシュを通してろ過され、沈殿を得るために遠心分離される。再懸濁した沈殿は次にパーコール非連続密度勾配（５〜７０％）に重層され、４００×ｇで室温、２０分間遠心分離される。４０と５０％の間の細胞バンドは採取され、洗浄および培養される。細胞は胎盤から抽出され、ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の細胞は単離される。選択マーカーに対して陽性の細胞を単離するための技術は、当技術分野において磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇ）および／または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇ）など周知である。周知のとおりこれらの方法は、選択されたマーカーに結合できる抗体に依存する。次いでマーカーに対して陽性である細胞はマーカーを発現していない細胞から選別される。

実施例に記載のとおり本明細書の多能性幹細胞は、ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇを使用して単離された。ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇ技術を使用することによって、単離された細胞の１８．７５％は、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ−ＧおよびＳＳＥＡ４に対して陽性である。同様に実施例に記載のとおり本明細書の多能性幹細胞は、移動マーカー（ＣＸＣＲ４）を発現している細胞を単離するためにＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇ技術を使用して、およびＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇ技術を使用してＨＬＡ−Ｇおよび多能性幹細胞マーカー（ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰまたはＯＣＴ４）を発現している細胞をさらに単離することによって単離された。これら２つの技術を組み合わせて使用することによって、単離された細胞の２０．２５％はＣＸＣＲ４、ＨＬＡ−ＧおよびＳＳＥＡ４に対して陽性である。ＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇ技術と組み合わせたＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇ技術の使用はＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇ単独で使用する場合よりもより良い細胞回収を可能にするが、両技術は単独でも使用できる。

本明細書の方法は、上に記載のとおりＨＬＡ−Ｇ、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の多能性幹細胞も提供する。

本明細書の多能性幹細胞は、再生医療、薬物送達および遺伝子治療などの多種多様な応用において治療目的のために使用できる。本明細書の多能性幹細胞は、医用画像、細胞美容、毒性試験のためにおよび研究ツールとしても使用できる。

表現「治療目的」は、再生医療に関わる状態を罹患している患者を処置するために本明細書の胎盤性幹細胞を使用することを指す。

再生医療
表現「再生医療」は、正常な機能を回復させるまたは確立するためにヒト細胞、組織または器官を置き換えるまたは再生する工程を指す。再生医療の例は、幹細胞の注射、注入された細胞によって投与される生物学的に活性分子による再生の誘導、およびｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖された器官および組織の移植（組織工学）を含む。

本明細書の多能性幹細胞がＨＬＡ−Ｇに対しておよび移動マーカーに対して陽性であることから、それらは局所または全身投与でｉｎ ｖｉｖｏで組織を再生するために使用できる。加えて本明細書の多能性幹細胞は、組織工学によってｉｎ ｖｉｔｒｏで組織を再生するために使用できる。本明細書の幹細胞がＨＬＡ−Ｇに対して陽性であることから、操作された組織は有害な免疫応答を促進することなく移植できる。

遺伝子治療
表現「遺伝子治療」は、疾患を処置するための医薬品としてのＤＮＡの使用を指す。本明細書の多能性幹細胞は、特定のタンパク質をコードしている核酸でｅｘ ｖｉｖｏで遺伝的に操作されてよく、次いで当技術分野において周知のとおり患者に提供されてよい。例えば細胞は、サポニン、カチオン性ポリアミン、リポソーム、マイクロカプセル化またはウイルスを使用して操作されてよい。

創薬および薬剤送達
表現「創薬」は、それにより新規薬物候補化合物が発見される工程を指す。幹細胞創薬アプローチは、臨床応用の可能性を実証できる幹細胞機能を調節する候補を同定することを目的としている。３つの具体的な領域が関与する可能性がある：化合物同定、化合物検証および／または化合物最適化。本明細書の細胞は、そのような化合物同定、検証および／または最適化のために使用できる。この技術は、未だ対処されていない医学的必要性に対処するためにさらに開発される可能性がある新規薬物様分子の同定に応用できる。

表現「薬物送達」は、治療効果を達成するために薬学的化合物を投与する方法を指す。したがって本明細書の細胞は、送達により患者に治療効果を有する具体的なポリペプチドまたは具体的な化合物を発現するように、上に述べたとおりｅｘ ｖｉｖｏで遺伝的に操作できる。この技術は、タンパク質、酵素、ホルモン、またはヒト身体の機能に不可欠である他の構成成分の合成における欠如または不足によって特徴付けられるすべての疾患に応用できる。非限定的例は：がん、アルツハイマー、パーキンソン、糖尿病および遺伝的欠陥から生じるすべての疾患を含む。

医用画像
本明細書の細胞は、医用画像においても使用できる。後者は、疾患を診断または研究するための臨床目的で身体またはその一部の画像を作成するために使用される工程を指す。一態様では、本明細書の多能性幹細胞を標識化することで、細胞は当技術分野において周知のさまざまな技術によって追跡できる。したがって細胞は、身体内で追跡および研究できる。例えば細胞は、金粒子、蛍光分子または鉄で標識されてよく、ＭＲＩ、ＣＴ−走査またはキセノゲン（Xenogen）によって検出できる。

細胞治療
表現「細胞治療」は、疾患を処置するために患者に新規細胞を導入する工程を指す。この表現は、再生医療のサブタイプ治療である。細胞治療は、遺伝子治療の追加を伴ってまたは伴わずに、遺伝性疾患の処置にしばしば重点的に取り組む。周知のとおり細胞治療は、複数の器官での多数の臨床的適用のためにおよび細胞送達のいくつかの形態によって使用されている。したがって、治療に関与する作用の具体的な機序は、広範囲にわたる。具体的な理論に束縛されることなく本発明者は、それにより細胞が治療作用を促進する２つの主な周知の機序があると考えている。

第１に幹細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでおよび（局所または全身投与を介して）傷害の部位に達した際に具体的な細胞型に分化することは周知である。次いでこれらの細胞は、傷害の部位に組み込み、損傷を受けた組織を置き換え、それにより器官または組織の機能を改善する。例えば幹細胞が心筋梗塞後に心筋細胞を置き換えるために使用されることは周知である（Jackson, K. A., S. M. Majka, et al. (2001). "Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells." J Clin Invest 107(11): 1395-402およびKawada, H., J. Fujita, et al. (2004). "Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction." Blood 104(12): 3581-7）。

第２に幹細胞は、パラ分泌または内分泌様式で作用するサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子などの可溶性因子を放出する能力を有する。これらの因子は、器官または領域の自己回復を亢進する。（局所または全身投与を介して）送達される細胞は、比較的短い期間（数日〜数週間）生存可能であり、その後死ぬ。これは、関連する治療因子を天然で分泌するまたは、血管新生、抗炎症および抗アポトーシスを亢進する因子を分泌する細胞などの多量の具体的な分子を放出する細胞を生じさせるエピジェネティックな変更もしくは遺伝子操作（遺伝子治療）を受ける幹細胞を含む（Deuse, T., C. Peter, et al. (2009). "Hepatocyte growth factor or vascular endothelial growth factor gene transfer maximizes mesenchymal stem cell-based myocardial salvage after acute myocardial infarction." Circulation 120(11 Suppl): S247-54, Kelly, M. L., M. Wang, et al. "TNF receptor 2, not TNF receptor 1, enhances mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection following acute ischemia." Shock 33(6): 602-7, Yagi, H., A. Soto-Gutierrez, et al. "Mesenchymal stem cells: Mechanisms of immunomodulation and homing." Cell Transplant 19(6): 667-79）。

臨床研究は、幹細胞が局所的にまたは全身に患者に注射でき、脳損傷、脊髄傷害、脳外傷および虚血性心筋症などの傷害組織を回復させるための有望な細胞治療をもたらすことを示している（Bulte JW In vivo MRI cell tracking: clinical studies, AJR Am J Roentgenol, 2009, p. 314-25, Bolli R et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomized phase 1 trial, The Lancet, 2011, p. 1847-1857）。

そのように本明細書の多能性幹細胞は、心血管損傷、糖尿病、がん（白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、神経膠芽腫もしくは乳がん）、脳損傷（発作もしくは脳外傷によって生じる）、脳変性（パーキンソンもしくはアルツハイマー）、脊髄傷害、筋萎縮性側索硬化症、創傷治癒、不妊症、クローン病または角膜損傷などの細胞治療によって処置できる疾患を処置するために使用できる。

本明細書は、上に記載のとおりヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性であり、局所または全身投与のために適合できる多能性幹細胞の使用も提供する。

表現「全身投与」は、経腸的または非経口的のいずれかである投与の経路を指す。経腸的投与は、胃腸管を通じた構成成分の吸収を含むことが周知である。非経口的とは、消化管以外への投与および例えば静脈内注射を指す。本明細書の細胞が経腸的に投与される場合、当技術分野において周知のとおりそれらはデンドリマー、リポタンパク質に基づく薬物担体重合体またはミセルに挿入されてよい。

表現「局所投与」は、身体の限局化された領域へまたは身体の一部の表面への細胞の適用を指す。そのように、傷害部位が脳内である場合、本明細書の細胞は脳内の傷害部位に適用できる。

本明細書は、必要とする患者を処置するための細胞治療法も提供する。

表現「必要とする患者を処置する」は、症状を緩和または低減できる疾患を罹患しやすいまたは罹患している任意のヒトを指す。より具体的には対象は、ヒトで構成される。

上に述べたとおり幹細胞を使用する細胞治療は、心血管損傷、糖尿病、がん（白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、神経膠芽腫もしくは乳がん）、脳損傷（発作もしくは脳外傷によって生じる）、脳変性（パーキンソンもしくはアルツハイマー）、脊髄傷害、筋萎縮性側索硬化症、創傷治癒、不妊症、クローン病または角膜損傷などの疾患によって生じる症状を緩和できる。そのように、前記疾患を罹患しやすいまたは罹患している患者への幹細胞の局所または全身投与は、症状を緩和できる。

本明細書の方法は、上に記載のとおりヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の多能性幹細胞も提供する。

ＨＬＧ−Ａに対して陽性の本明細書の多能性幹細胞は、免疫寛容性であり、移植片拒絶の危険性無く任意の受取者と免疫適合性であってよい。そのようにヒトから単離された本明細書の細胞は、移植片拒絶の危険性無く任意の動物に注射できる。加えて、移動マーカーに対して陽性の本明細書の多能性幹細胞は傷害部位などの標的に移動できる。加えて本明細書の多能性幹細胞は、胚の操作を必要としない胎盤から単離される。そのように、本明細書の多能性幹細胞を単離する際に倫理的問題は生じない。一態様では胎盤は、多量の幹細胞の回収を可能にする。

細胞美容
本明細書の多能性幹細胞は、胎盤性幹細胞美容（ＰＳＣＣ）または胎盤性幹細胞薬用化粧品（ＰＳＣＣ）などの細胞美容において使用できる。表現「細胞美容」は、器官または組織から抽出された細胞に基づく薬用化粧品を指す。周知の細胞薬用化粧品は、胚組織または胎盤から単離された生化学物質に基づく。したがって本明細書の多能性幹細胞は、凍傷、熱傷、皮膚喪失、皮膚潰瘍、壊疽、瘡蓋、皮膚炎、湿疹、ざ瘡、乾癬および帯状疱疹などの皮膚に影響を与える障害を処置する薬用化粧品のための胎盤性幹細胞の供給源を提供する。加えて本明細書の多能性幹細胞は、女性、男性および乳児のための化粧品で使用できる。

研究ツール
本明細書の多能性幹細胞は、ヒト遺伝性障害のためのモデルとして、または毒性試験のためのモデルとしてなどの研究ツールとして使用できる。

ヒト遺伝性障害のためのモデル
本明細書の多能性幹細胞は、細胞を遺伝的に操作することによって、または疾患の細胞株を導くことによってヒト遺伝性障害のためのモデルとして使用できる。このアプローチは、脆弱−Ｘ症候群、嚢胞性線維症、トリソミーおよび信頼できる研究モデルがない他の遺伝的障害などの障害を研究するために有用である可能性がある。

毒性試験のためのモデル
本明細書の多能性幹細胞は、薬物開発を加速し、新規毒性因子を同定するための新規毒性検査プラットホームの開発を可能にする。この新規毒性検査プラットホームは、動物試験の代替手段を可能にする。本明細書の多能性幹細胞は、標準化された培養および分化プロトコールに供される多能性幹細胞株を使用する毒性試験の開発をさらに可能にする。さまざまな試験が生殖毒性、神経毒性、代謝および毒物動態を網羅し、最終的に「一体型」試験系に統合される可能性がある。多能性幹細胞培養は、開発した毒性試験の将来的な産業利用を可能にするために自動化および大規模化されてよい。

本明細書の細胞は、細胞の有効量と、場合により希釈剤、賦形剤またはビヒクルなどの薬学的に許容される担体を含む他の活性物質とを混合することによって患者に投与されてよい。担体は当技術分野において周知のとおり投与の経路に応じてさまざまな形態であってよい。

注射される細胞の量は、処置が求められる状態の性質および患者の状態によって変化する場合があり、最終的には主治医の裁量にある場合があることは認められる。患者に投与される本明細書の細胞の量は、少なくとも２×１０^３個／ｋｇ；約２×１０^３個／ｋｇから３×１０^６個／ｋｇ、約２×１０^３個／ｋｇから１．６×１０^４個／ｋｇ、約５×１０^４個／ｋｇから５×１０^５個／ｋｇまたは約６×１０^５個／ｋｇから３×１０^６個／ｋｇであってよい（例えば、Kebriaei P et al. (2009). “Adult human mesenchymal stem cells added to corticosteroid therapy for the treatment of acute graft-versus-host disease" Biol Blood Marrow Transplant 15(7): 804-11、Bjorklund LM et al, (2002) “Embryonic stem cells develop into functional dopaminergic neurons after transplantation in a Parkinson rat model" PNAS, 99(4): 2344-2349を参照されたい）。

本明細書は、次の実施例を参照することによってより容易に理解される。特許請求の範囲は、実施例に記載されている好ましい実施形態によって限定されるべきでなく、記載全体と一致する最も広い解釈で与えられるべきである。
［実施例］

細胞の抽出の際に、ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇを実施し、次いで３種すべての表現型を選別する。図１および表１に示すとおり、単離された細胞の４４．２５％はＳＳＥＡ４に対して陽性であり、細胞の２９．０３％はＨＬＡ−Ｇに対して陽性であり、７５．２５％はＣＸＣＲ４に対して陽性である。単離された細胞の１８．７５％はＳＳＥＡ４、ＨＬＡ−ＧおよびＣＸＣＲ４に対して陽性である。

細胞の抽出の際に、ＣＸＣＲ４に対して陽性の細胞を単離するためにＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇを実施し、ＳＳＥＡ４およびＨＬＡ−Ｇに対して陽性の細胞を単離するためにＣＸＣＲ４に対して陽性の細胞にＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇをさらに実施する。図２および表２に示すとおり、単離された細胞の４７．０４％はＳＳＥＡ４に対して陽性であり、３２．７５％はＨＬＡ−Ｇに対して陽性であり、８３．５０％はＣＸＣＲ４に対して陽性である。単離された細胞の２０．２５％はＳＳＥＡ４、ＨＬＡ−ＧおよびＣＸＣＲ４に対して陽性である。

図３および４は、ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇ技術対ＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇ技術を使用して得られた細胞の百分率の間の比較を示す。

図７は、ＳＳＥＡ４またはＨＬＡ−Ｇの存在を確認するＦＡＣＳｃａｎ分析の例示を表す。

ＳＳＥＡ４に対して陽性の幹細胞をそれらがＮＡＮＯＧ、ＡＬＰおよびＯＣＴ−４などの他の多能性幹細胞に対しても陽性であるかを判定するためにＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇによってさらに選別した。図５はこれらの細胞がＮＡＮＯＧ、ＡＬＰおよびＯＣＴ−４に対しても陽性であることを示す。表３は、ＳＳＥＡ４に対して陽性の細胞の６９．５０％、８７．５０％および６２％がＮＡＮＯＧ、ＡＬＰおよびＯＣＴ−４に対してそれぞれさらに陽性であることを示す。

単離された細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生存率も調査した。図６に示すとおり、細胞は培養で２２日間まで生存できた。

図８は、本明細書の幹細胞の代表的ＣＸＣＲ４免疫染色を示す。陰性対照幹細胞（スコア１）（Ａ）よりもより高い免疫蛍光強度（スコア３）がＣＸＣＲ４、ＨＬＡ−ＧおよびＳＳＥＡ４に対して陽性の幹細胞（Ｂ）で検出される。

本明細書の単離された幹細胞は、免疫抑制ヌードマウスで尾静脈に、皮下に、筋肉内にまたは腹腔内に注射された場合に移植片対宿主病、奇形腫または腫瘍を４週間生じない（表４）。これらの結果は、再生医療において使用される幹細胞の集団の準備ができていることを確認している。

材料および方法
ヒト対象
胎盤は正常な妊娠および分娩であった女性から得て、すべての新生児は妊娠期間に相当する大きさである。適格な参加者は、いかなる医学的状態（すなわち糖尿病、高血圧または代謝疾患）も罹患していることが既知でなく、タバコ、アルコールまたは違法薬物の使用がない者である。すべての参加者は、研究に参加するために、臨床研究についてＣＨＵＳ Ｅｔｈｉｃｓ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された承諾書およびインフォームドコンセントを出した。

胎盤試料の採取
胎盤の娩出直後に試料を採取し、総処理時間は１５分間未満である。梗塞および血栓症の領域を避けて胎盤の組織を採取する。

幹細胞単離および培養
胎盤細胞は、妊娠時に合併症がなかった胎盤から分娩直後に、本発明者らの以前の研究に従って精製される（Aris A. et al. Detrimental effects of high levels of antioxidant vitamins C and E on placental function: considerations for the vitamins in preeclampsia (VIP) trial J. Obstet. Gynaecol. Res. 2008, p. 504-511およびBenachour N. et al. Toxic effects of low doses of bisphenol-A on human placental cells Toxicol Appl Pharmacol 2009, p. 322-8）。典型的には、胎盤性絨毛組織３５から４０ｇを２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳ中の０．１５％トリプシンおよび０．０２％ＤＮａｓｅ Ｉで３０分間、３回、３７℃の水浴中で消化する。最後２回の消化について、組織断片を沈ませ、上清を２００μＭポアサイズナイロンメッシュを通してろ過し、細胞懸濁物の４５ｍｌ未満をＦＣＳ血清の５ｍｌ一定分量に重層し、１０００×ｇ、１０分間、室温で遠心分離する。沈殿した細胞を次いで室温でＤＭＥＭに再懸濁する。残りの細胞懸濁物すべてをプールし、１０００×ｇで遠心分離し、ＤＭＥＭ ５ｍｌに再懸濁する。細胞をパーコール非連続密度勾配（５〜７０％、１×ＨＢＳＳ中、各３ｍｌの５％ステップ）に重層し、４００×ｇ、室温、２０分間遠心分離する。４０％と５０％との間の細胞バンドを採取し、１回洗浄し、培養する。ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｍ１９９、ＲＰＭＩ、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ、Ｉｓｃｏｒｅ’ｓ、ＭｃＣｏｙ’ｓおよびこれらの組合せなどの種々の培地をこれらの細胞を培養するために使用できる。これらの培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、全ヒト血清（ＷＨＳ）または胎盤の娩出時に採取するヒト臍帯血清を補充する場合がある。これに１％ＰＳＮ、２ｍＭグルタミンおよび４４ｍＭ炭酸水素ナトリウムがｐＨ７．２、加湿した５％ＣＯ_２／９５％空気インキュベーター、３７℃で添加される。

ＦＢＳの干渉を避けるために、細胞をＦＢＳを含まない培地（すなわちＤＭＥＭ）で洗浄してもよく、次いで生理食塩水で洗浄してよい。

磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳｏｒｔｉｎｇ）
細胞２００億個をＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄する。次いで、細胞を一次抗体（表５および６）と３５分間、４℃、ＭＡＣＳ緩衝液中でインキュベートする。このステップ後、細胞を同じ緩衝液２ｍｌで２回洗浄し、抗マウスＩｇＧ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙ ｂｉｏｔｅｃｈ）と４℃、１７分間、製造者の説明書に従ってインキュベートする。細胞を冷緩衝液で２回洗浄し、次いで冷緩衝液１ｍｌ中に懸濁する。Ｍｓカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙ ｂｉｏｔｅｃｈ）を冷緩衝液５００μｌで準備し、次いで標識化細胞をカラムに通す。カラムを冷緩衝液３×５００μｌで洗浄し、次いで消磁し、冷緩衝液１ｍｌで重力によって、および緩衝液がカラムを通るように製造者の説明書に従ってピストンを押すことによって冷緩衝液１ｍｌで溶出する。

別のＭＡＣＳが同じ細胞に実施される場合これらの細胞は、それらに前の抗体を内部移行させ、消化させるために少なくとも４時間培養に戻すべきである。次いでこれらの細胞を２回洗浄し、冷緩衝液５００μｌに再懸濁する。新たなカラムを懸濁物中の細胞の通過のために準備した。カラムを冷緩衝液２ｍｌで２回洗浄する。この工程を必要とされる選別の数に従って繰り返す。

蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇ）
ＣＸＣＲ４に方向付けられたＭＡＣＳ後に、細胞をＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇ緩衝液（ＰＢＳ Ｃａ／Ｍｇ^＋＋不含有、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７および１％ＦＢＳ、熱不活性化およびろ過により滅菌）で２回洗浄する。次いで細胞をコンジュゲートした抗体（表７）と３０分間、４℃、暗所でインキュベートする。次いで細胞を冷緩衝液で２回洗浄し、６０μｍナイロンメッシュフィルターでろ過する。最後に再懸濁した細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩセルソーターを使用して選別し、５ｍｌチューブに採取し、培養に戻す。

細胞生存率および計数
細胞生存率は、コンフルエンスに依存する。一般に５％未満のコンフルエンスで実験を終了する。

ブルートリパン計数
血球計数器を用いる手動計数。生存率をトリパンブルー排除法によって評価する。

蛍光活性化細胞走査（ＦＡＣＳｃａｎ）
新たに単離された細胞１５００００個をＰＢＳおよび０．５％ＢＳＡを含有するＦＡＣＳｃａｎ緩衝液で２回洗浄する。次いで細胞を一次抗体（表７）と３０分間、４℃でインキュベートする。次いで細胞を冷緩衝液で２回洗浄し、フィコエリトリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）をコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧと冷緩衝液中、３０分間、氷上、暗所でインキュベートする。２回洗浄後、細胞を同緩衝液２００μｌ中に懸濁し（１時間以内に行わなければならない）分析まで暗所に保存した。一次抗体を含まないチューブおよび二次抗体だけを含むチューブを対照として使用する場合がある。

免疫染色
ＣＸＣＲ４の発現を免疫蛍光によって評価した。簡潔には、接着幹細胞を３．７％パラホルムアルデヒド（３７％パラホルムアルデヒド、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）中、２０分間、室温で固定した。ＰＢＳ−０．３％トリトンＸ１００中、４分間の透過処理後、非特異的結合を低減するために細胞をＰＢＳ−１０％ヤギ血清−１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）−０．１％トリトンＸ１００中、３０分間インキュベートした。次いで細胞を３μｇ／ｍｌモノクローナル抗ＣＸＣＲ４（Ｍｓ ｍＡｂ ｔｏ ＣＸＣＲ４、Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）とブロッキング緩衝液中、一晩インキュベートした。次いで細胞をアレクサフルオル５９４抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）と１時間、インキュベートした。対照試料は、一次抗体を含めない場合、または一次抗体を一次抗体と同じ濃度の対応するマッチした陰性対照免疫グロブリンで置きかえた場合の反応物を含む。次いで細胞を洗浄し、ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で１０分間、室温で対比染色した。マウント後、細胞をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１顕微鏡を使用して観察し、顕微鏡写真を統合したコンピューターで撮影した。

免疫寛容および安全性
マウスモデルを使用して２つの評価項目を調査した：１）急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）の発症、ならびに２）奇形腫および腫瘍形成。８〜１０週齢オスＮＵ／ＮＵヌードマウス４匹を使用した（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）。

単離後に本明細書に記載の細胞は、前記細胞から単離するために使用される抗体を単離するためにさらに処置できる。一実施形態では単離された細胞は、約０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで約５分間、約３７℃で、単離のために使用される抗体を前記細胞から分離できるように処置される。

１）ａＧＶＨＤの発症
ＰＢＳ中に懸濁された単離された細胞（５×１０^５個）を免疫抑制ヌードマウス２匹の尾静脈および腹腔内に注射した。マウスを下痢、体重減少、皮膚の変化、呼吸促迫または急性肺水腫に関連する突然死を含むａＧＶＨＤ臨床徴候について毎日４週間モニターした（Filipovich AH et al. National Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in Chronic Graft-versus-Host Disease: I. Diagnosis and Staging Working Group Report. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 2005 December,11(12):945-956）。

２）奇形腫および腫瘍形成
ＰＢＳ中に懸濁した単離された細胞（５×１０^５個）を免疫抑制ヌードマウス２匹の脚の皮下にまたは筋肉内に注射した。動物を移植後４週間で屠殺し、注射部位を奇形腫および腫瘍形成について視覚的に調査した。

Claims (48)

1. ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の、単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞。
2. 前記多能性幹細胞マーカーがステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）４、ＳＳＥＡ３、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ヒト胚性幹細胞抗原−１（ＨＥＳＣＡ−１）、発生多能性関連５（ＤＰＰＡ５）、フォークヘッドボックスＤ３（ＧＥＮＥＳＩＳ／ＦＯＸＤ３）、未分化胚細胞転写因子１（ＵＴＦ１）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３Ｂ）、奇形癌腫由来増殖因子１（ＴＤＧＦ１／ＣＲＩＰＴＯ）、低発現遺伝子１（ＲＥＸ１／ＺＦＰ４２）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、コネキシン−４３、コネキシン−４５、ＧＣＴＭ２、ＧＣＴ３４３、胸腺細胞抗原（Ｔｈｙ１／ＣＤ９０）、ガンマ−アミノ酪酸受容体サブユニットベータ−３（ＧＡＢＲＢ３）、ＣＤ９、増殖分化因子−３（ＧＤＦ３）、ＳＴＥＬＬＡＲまたは線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）である、請求項１に記載の単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞。
3. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰまたはＯＣＴ４である、請求項１または２に記載の単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞。
4. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰおよびＯＣＴ４である、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞。
5. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４である、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞。
6. 前記移動マーカーがケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＣＲ９、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒα）、ＰＤＧＦ−Ｒβ、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、ＲＡＮＴＥＳ−ＲまたはＭＤＣ−Ｒである、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞。
7. 前記移動マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞。
8. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４であり、前記移動マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項１から３および５から７のいずれか一項に記載の単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞の集団または単離されたヒト胎盤性多能性幹細胞。
9. ヒト胎盤から細胞を抽出すること；および
   ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の細胞を単離すること
   を含む、ヒト胎盤性多能性幹細胞を単離するための方法。
10. 前記多能性幹細胞マーカーがステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）４、ＳＳＥＡ３、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ヒト胚性幹細胞抗原−１（ＨＥＳＣＡ−１）、発生多能性関連５（ＤＰＰＡ５）、フォークヘッドボックスＤ３（ＧＥＮＥＳＩＳ／ＦＯＸＤ３）、未分化胚細胞転写因子１（ＵＴＦ１）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３Ｂ）、奇形癌腫由来増殖因子１（ＴＤＧＦ１／ＣＲＩＰＴＯ）、低発現遺伝子１（ＲＥＸ１／ＺＦＰ４２）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、コネキシン−４３、コネキシン−４５、ＧＣＴＭ２、ＧＣＴ３４３、胸腺細胞抗原（Ｔｈｙ１／ＣＤ９０）、ガンマ−アミノ酪酸受容体サブユニットベータ−３（ＧＡＢＲＢ３）、ＣＤ９、増殖分化因子−３（ＧＤＦ３）、ＳＴＥＬＬＡＲまたは線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）である、請求項９に記載の方法。
11. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰまたはＯＣＴ４である、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰおよびＯＣＴ４である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記移動マーカーがケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＣＲ９、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒα）、ＰＤＧＦ−Ｒβ、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、ＲＡＮＴＥＳ−Ｒ、またはＭＤＣ−Ｒである、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記移動マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４であり、前記移動マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項９から１１および１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記細胞がヒト胎盤から酵素的に抽出される、請求項９から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、前記移動マーカーおよび前記少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性の前記細胞が磁気活性化セルソーティングおよび／または蛍光活性化セルソーティングによって単離される、請求項９から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 再生医療、薬物送達、創薬、細胞美容または遺伝子治療における治療目的のためのヒト胎盤性多能性幹細胞の使用であって、前記ヒト胎盤性多能性幹細胞がヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性である使用。
20. 凍傷、熱傷、皮膚喪失、皮膚潰瘍、壊疽、瘡蓋、皮膚炎、湿疹、ざ瘡、乾癬または帯状疱疹を処置するための細胞美容としての、請求項１９に記載の使用。
21. 再生医療が細胞治療または組織工学を含む、請求項１９に記載の使用。
22. 請求項９から１８のいずれか一項に記載の方法によって得られるヒト胎盤性多能性幹細胞の医用画像における使用であって、前記ヒト胎盤性多能性幹細胞がヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性である使用。
23. 前記ヒト胎盤性多能性幹細胞が局所または全身投与のために適合されている、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の使用。
24. ヒト遺伝性障害のためのモデルとしての、または毒性試験のためのモデルとしてのヒト胎盤性多能性幹細胞の使用であって、前記ヒト胎盤性多能性幹細胞がヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性である使用。
25. 心血管損傷、糖尿病、がん、脳損傷、脳変性、脊髄傷害、筋萎縮性側索硬化症、創傷治癒、不妊症、クローン病または角膜損傷を処置するための細胞治療における、請求項１９に記載の使用。
26. 前記がんが白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、神経膠芽腫または乳がんである、請求項２５に記載の使用。
27. 前記脳損傷が発作または脳外傷によって生じる、請求項２５に記載の使用。
28. 前記脳変性がパーキンソンまたはアルツハイマーによって生じる、請求項２５に記載の使用。
29. 前記多能性幹細胞マーカーが、ステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）４、ＳＳＥＡ３、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ヒト胚性幹細胞抗原−１（ＨＥＳＣＡ−１）、発生多能性関連５（ＤＰＰＡ５）、フォークヘッドボックスＤ３（ＧＥＮＥＳＩＳ／ＦＯＸＤ３）、未分化胚細胞転写因子１（ＵＴＦ１）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３Ｂ）、奇形癌腫由来増殖因子１（ＴＤＧＦ１／ＣＲＩＰＴＯ）、低発現遺伝子１（ＲＥＸ１／ＺＦＰ４２）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、コネキシン−４３、コネキシン−４５、ＧＣＴＭ２、ＧＣＴ３４３、胸腺細胞抗原（Ｔｈｙ１／ＣＤ９０）、ガンマ−アミノ酪酸受容体サブユニットベータ−３（ＧＡＢＲＢ３）、ＣＤ９、増殖分化因子−３（ＧＤＦ３）、ＳＴＥＬＬＡＲまたは線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）である、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の使用。
30. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰまたはＯＣＴ４である、請求項１９から２９のいずれか一項に記載の使用。
31. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰおよびＯＣＴ４である、請求項１９から３０のいずれか一項に記載の使用。
32. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４である、請求項１９から３１のいずれか一項に記載の使用。
33. 前記移動マーカーがケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＣＲ９、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒα）、ＰＤＧＦ−Ｒβ、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、ＲＡＮＴＥＳ−ＲまたはＭＤＣ−Ｒである、請求項１９から３２のいずれか一項に記載の使用。
34. 前記移動マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項１９から３３のいずれか一項に記載の使用。
35. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４であり、前記移動マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項１９から３０および３２から３４のいずれか一項に記載の使用。
36. ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、移動マーカーおよび少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーに対して陽性のヒト胎盤性多能性幹細胞を患者に投与することを含む、必要とする患者を処置するための細胞治療法。
37. 前記投与が局所または全身投与である、請求項３６に記載の細胞治療法。
38. 心血管損傷、糖尿病、がん、脳損傷、脳変性、脊髄傷害、筋萎縮性側索硬化症、創傷治癒、不妊症、クローン病または角膜損傷を処置することを含む、請求項３６または３７に記載の細胞治療法。
39. 前記がんが白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、神経膠芽腫または乳がんである、請求項３８に記載の細胞治療法。
40. 前記脳損傷が発作または脳外傷によって生じる、請求項３８に記載の細胞治療法。
41. 前記脳変性がパーキンソンまたはアルツハイマーによって生じる、請求項３８に記載の細胞治療法。
42. 前記多能性幹細胞マーカーがステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）４、ＳＳＥＡ３、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ヒト胚性幹細胞抗原−１（ＨＥＳＣＡ−１）、発生多能性関連５（ＤＰＰＡ５）、フォークヘッドボックスＤ３（ＧＥＮＥＳＩＳ／ＦＯＸＤ３）、未分化胚細胞転写因子１（ＵＴＦ１）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３Ｂ）、奇形癌腫由来増殖因子１（ＴＤＧＦ１／ＣＲＩＰＴＯ）、低発現遺伝子１（ＲＥＸ１／ＺＦＰ４２）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、コネキシン−４３、コネキシン−４５、ＧＣＴＭ２、ＧＣＴ３４３、胸腺細胞抗原（Ｔｈｙ１／ＣＤ９０）、ガンマ−アミノ酪酸受容体サブユニットベータ−３（ＧＡＢＲＢ３）、ＣＤ９、増殖分化因子−３（ＧＤＦ３）、ＳＴＥＬＬＡＲまたは線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）である、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の細胞治療法。
43. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰまたはＯＣＴ４である、請求項３６から４２のいずれか一項に記載の細胞治療法。
44. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＬＰおよびＯＣＴ４である、請求項３６から４３のいずれか一項に記載の細胞治療法。
45. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４である、請求項３６から４４のいずれか一項に記載の細胞治療法。
46. 前記移動マーカーがケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＣＲ９、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒα）、ＰＤＧＦ−Ｒβ、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、ＲＡＮＴＥＳ−ＲまたはＭＤＣ−Ｒである、請求項３６から４５のいずれか一項に記載の細胞治療法。
47. 前記移動マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項３６から４６のいずれか一項に記載の細胞治療法。
48. 前記多能性幹細胞マーカーがＳＳＥＡ４であり、前記移動マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項３６から４３および４５から４７のいずれか一項に記載の細胞治療法。