附图说明
图1A.PCR结果分析hUC-MSC mRNA水平表达galecitn-3,其中1、3、5分别是三批细胞表达galectin-3的条带,2、4、6为相应细胞的β-actin。
图1B.real-time qPCR结果分析3批hUC-MSC于P2~P5不同代次mRNA水平表达galecitn-3。以β-actin作为内参,对galectin-3的Cp值进行2-ΔCt分析。
图2.Westernblot结果分析hUC-MSC上清液和RIPA裂解液中galecitn-3的表达。
图3.ELISA分析hUC-MSC上清液和RIPA裂解液中galecitn-3的表达。
图4.流式细胞仪分析hUC-MSC表面表达galectin-3的情况,其中空心部分表示同型对照表达情况,实心部分(M值)表示galectin-3表达。
图5A.real-time qPCR结果分析RNA干扰后hUC-MSC mRNA水平表达galecitn-3,以β-actin作为内参,contr组作为对照,对galectin-3的Cp值进行2-ΔΔCt分析;其中 组表达量明显低于contr组和NA组(P<0.01)。
图5B.ELISA分析RNA干扰后hUC-MSC分泌至上清中的galecitn-3(ng/ml),统计分析可知 组表达量明显低于contr组和NA组(P<0.01)。
图5C.ELISA分析RNA干扰后RIPA裂解100万个hUC-MSC中的galecitn-3(ng/ml),其中
组表达量明显低于contr组和NA组(P<0.01)。
图6.BrdU吸收法检测各共培养组PHA-P刺激的PBMC增殖情况(以光吸收值表示)。
图7.BrdU吸收法检测各Transwell共培养组PHA-P刺激的PBMC增殖情况(以光吸收值表示)。
具体实施方式
实施例1 mRNA水平检测galectin-3表达
连续培养三批人脐带间充质干细胞(hUC-MSC),培养至P4代后,分别消化离心,用RNA提取试剂盒(Invitrogen公司产品)提取细胞总RNA,逆转为cDNA后,用galectin-3引物分别进行常规PCR扩增(正向引物:5′-CCAAAGAGGGAATGATGTTGCC-3′,反向引物:5′-TGATTGTACTGCAACAAGTGAGC-3′),并进行琼脂糖电泳分析(结果图1A);选取相同批次P2~P4代细胞提取RNA后逆转为cDNA,用real-time qPCR(实时定量PCR)分析,引物序列与PCR相同,并对real-time qPCR结果进行目标产物的2-ΔCt分析(结果见图1B)。由结果可知,hUC-MSC在mRNA水平表达galectin-3,且代次之间表达量无明显差异。
实施例2 Western blot检测galectin-3蛋白表达
培养人脐带间充质干细胞,培养体系为10ml,培养48h后收集上清液备用;细胞消化后离心计数,每100万细胞加入1ml RIPA试剂(细胞裂解液,Sigma公司)裂解细胞。细胞上清液和RIPA裂解液同时做SDS-PAGE电泳,将电泳条带用半干法转移至PVDF膜上进行Western blot分析,一抗为goat抗-galectin-3抗体(R&D公司),二抗为rabbit抗goat IgG(Abcam公司),结果见图2。由结果可知,hUC-MSC可表达galectin-3蛋白,并且此蛋白可分泌至细胞培养液中。
实施例3 ELISA检测galectin-3蛋白表达
连续培养3批人脐带间充质干细胞,培养体系为10ml,培养48h收集上清液备用;48h末消化细胞,每100万细胞加入1ml RIPA试剂裂解细胞。细胞上清液和RIPA裂解液同时做ELISA检测(galectin-3ELISA试剂盒,Bender公司),结果如图3。进一步证明galectin-3蛋白可在hUC-MSC细胞中表达并可分泌至细胞外。
实施例4 流式细胞仪检测galectin-3表达
连续培养3批人脐带间充质干细胞,培养48h后消化细胞,每100万细胞加入5μl Alexa488 goat anti galectin-3抗体或同型对照,进行流式细胞分析,检测细胞表面galectin-3表达。结果如图4所示,galectin-3在细胞表面表达量可达47.95%。
实施例5 对galectin-3进行RNA干扰
采用galectin-3 siRNA对hUC-MSC进行RNA干扰;同时选择siRNA的阴性序列作为RNA干扰的阴性对照。
galectin-3 siRNA及阴性对照序列来源于Sigma-Aldrich公司,其中galectin-3 siRNA的序列(5′-3′)如下:
sense:CACUUUAACCCACGCUUCAdTdT,
anti-sense:UGAAGCGUGGGUUAAAGUGdTdT;
阴性对照序列(5′-3′)如下:
sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT,
anti-sense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT。
具体方法为:同一来源的细胞等分为3份,贴壁培养24h后,其中两份分别加入含有脂质体(lipofectamine RNAi MAX,Invitrogen公司)和galectin-3 siRNA( 组)或阴性对照序列(NA组)的Opti-MEM溶液,另外一份不做处理(contr组)。
细胞加入siRNA培养24h后,分别检测三份细胞mRNA水平、蛋白水平galectin-3表达情况。结果如图5A-5C,
组与NA组和contr组相比,hUC-MSC在mRNA水平、蛋白水平表达galectin-3均显著降低(P<0.01)。经RNA干扰后,mRNA水平表达抑制率为95.1%,细胞内galectin-3表达抑制率为61.2%,细胞分泌galectin-3抑制率为82.3%。
实施例6 hUC-MSC(
组/NA组/contr组)与PBMC共培养将6个不同批次的UC-MSC接种于24孔板,相同细胞各做3个平行孔, 其中2孔分别进行galectin-3和阴性对照序列的RNA干扰(
组/NA组),另一孔不做处理(contr组)。干扰24h后各组细胞一起与经PHA-P刺激的PBMC共培养,48h后BrdU法检测经上述各组hUC-MSC共培养后PBMC的增殖作用,增殖量以OD值(A450nm-A690nm)表示。
如图6所示,PBMC经PHA-P刺激后可显著增殖(PP组),然而与hUC-MSC共培养后,PBMC增殖明显被抑制(NA组和contr组)。而经galectin-3 siRNA干扰后,hUC-MSC抑制PBMC能力明显降低(P<0.01)。其中PP组为经PHA-P刺激的PBMC单独培养组,
组/NA组/contr组为经galectin-3 siRNA处理/阴性对照序列处理/不处理的hUC-MSC与经PHA-P刺激的PBMC共培养组。
组与NA组相比hUC-MSC对PBMC增殖抑制率降低了69.03%。
说明:抑制率计算方法:
(OD值为各组平均值,其他共培养组抑制率算法相同)。抑制率降低率算法:
以上结果发现,经galectin-3 siRNA干扰后,hUC-MSC抑制PHA-P刺激的PBMC增殖能力明显下降(P<0.01),表明galectin-3的表达对于hUC-MSC免疫抑制有重要作用。
实施例7 hUC-MSC(
组/NA组/contr组)与PBMC经Transwell小室共培养
将6个不同批次的hUC-MSC接种于24孔板,相同细胞各做3个平行孔,其中2孔分别进行galectin-3 siRNA和阴性对照序列处理(
组/NA组),另一孔不做处理(contr组)。RNA干扰24小时后各孔细胞分别植入transwell小室,在小室中加入经PHA-P刺激的PBMC,共培养48h后BrdU法检测经上述各组hUC-MSC共培养后PBMC的增殖作用,增殖量以OD值表示。
在transwell作用下,hUC-MSC主要通过分泌各种抗炎症因子而对PBMC增殖产生抑制作用。如图7所示,transwell存在情况下,hUC-MSC仍然可以显著抑制PBMC增殖(NA组和contr组)。而经galectin-3 siRNA 干扰后,hUC-MSC抑制PBMC能力明显降低(P<0.01)。
组与NA组相比hUC-MSC对PBMC增殖抑制率降低了79.22%。
经RNA干扰后的hUC-MSC分泌至细胞外的galectin-3表达量降低,从而使其抑制PBMC增殖的能力降低率高达79%,说明分泌型的galectin-3在hUC-MSC免疫抑制过程中起主要作用,可作为检测hUC-MSC免疫调节能力的标志性因子。
实施例8 hUC-MSC上清galectin-3含量检测
连续培养6批不同批号的hUC-MSC,按1.5×106/瓶细胞接种于T75细胞瓶中,培养体系为10ml培养液。从P2代开始至P6代,每批细胞传代接种48小时后取1ml上清液,用galectin-3 ELISA试剂盒检测上清液中galectin-3的含量(如表1所示)。6批细胞在各代次间差异不显著(P>0.05),各批次和各代次细胞平均值(±标准差)为:5.23(±0.45)ng/ml。
表1 6批次UC-MSC P2~P6代培养48小时后上清中galectin-3含量
|
MSC1 |
MSC2 |
MSC3 |
MSC4 |
MSC5 |
MSC6 |
Mean |
Std. |
P2 |
3.835 |
6.485 |
4.183 |
5.851 |
5.055 |
5.071 |
5.080 |
0.992 |
P3 |
4.842 |
4.661 |
4.663 |
5.405 |
5.898 |
4.136 |
4.934 |
0.624 |
P4 |
6.269 |
5.528 |
5.146 |
5.946 |
6.974 |
4.363 |
5.704 |
0.909 |
P5 |
5.505 |
6.201 |
5.938 |
4.523 |
7.239 |
4.915 |
5.720 |
0.971 |
P6 |
6.190 |
5.069 |
4.620 |
4.855 |
3.725 |
3.907 |
4.728 |
0.890 |
根据上述不同批次或代次的hUC-MSC细胞上清中galectin-3检测结果,我们将galectin-3检测阈值定为5.23×50%=2.62ng/ml,低于此数值的细胞判定为不合格。
参考文献
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4.Chen,H.Y.,F.T.Liu,and R.Y.Yang,Roles of galectin-3in immune responses.Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2005.53(6):p.497-504.
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