CN115356487B - 一种利用cd276评价间充质干细胞生物学效力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用CD276评价间充质干细胞生物学效力的方法，通过计数细胞后，裂解单位数量的细胞，收集细胞裂解液后，采用ELISA方法检测裂解液中CD276的蛋白含量来评价该间充质干细胞的生物学效力，所述生物学效力是指与活化外周血单个核细胞共培养，对外周血单个核细胞分泌IFN‑γ和TNF‑α的抑制能力，本发明不同于以往检测细胞培养上清中的因子来评估间充质干细胞生物学效力的方法，本发明通过ELISA的方法检测一定数目细胞的裂解液中的CD276的含量即可快速判断该细胞的生物学效力，简便快捷，具有广阔的应用前景，有利于推广应用。

Description

一种利用CD276评价间充质干细胞生物学效力的方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种利用CD276评价间充质干细胞生物学效力的方法。
背景技术
间充干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）是一群起源于中胚层的的亚全能干细胞，具备自我更新、多向分化、免疫调节、组织损伤修复、抗纤维化、促进血管新生等多项生物学功能。目前已知的MSC调控免疫应答的方式主要通过旁分泌和直接接触介导（Mesenchymal stem/stromal cells as a valuable source for the treatment ofimmune-mediated disorders. Stem Cell Res Ther. 2021 Mar 18;12(1):192），其中旁分泌效力因子主要包括 PGE2，IDO，IL-10，TGF-beta, TSG-6等，而细胞接触效力分子主要包括膜蛋白ICAM-1，VCAM-1，TLR3，TLR4，PD-L1和PD-L2等 (Mesenchymal stem cellimmunomodulation: mechanisms and therapeutic potential. Trends PharmacolSci.2020 Sep; 41(9):6530664; Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stemand stromal cells in inflammatory disease. Nature Reviews Nephrology 14, 493-507 (2018). )。
由于具备多种生物学功能，MSC具备药物属性，但因其存在显著的细胞异质性，且其介导免疫调控的作用机理非常复杂且难以确定标准品，而使得其生物效力评价成为其质量控制的难题。目前间充质干细胞的质量检验标准中免疫学反应检测中的内容主要包括下述三方面：（1）淋巴细胞增殖抑制检测；（2）特定淋巴细胞亚群检测（Th1/Treg/Th17）；（3）淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验。由于检测内容复杂和批量检测的高额成本，MSC药物的替代性功能指标成为企业和科研结构争相研究的热点。替代性功能指标即用特定的细胞因子或蛋白与细胞的生物学效力建立联系，并以此作为其质量评价的方法。现在被报道用于评价间充质干细胞生物学效力的替代性标志物，包括公开号为CN109576334A的发明专利公开的PGE2，公开号为CN110938668的发明专利公开的TNFRI，公开号为CN102643909B的发明专利公开的Galectin-3等。但可溶性细胞因子存在一个关键问题，即其自身不够稳定，极容易降解，保存的难度较大。同时，收集和检测的过程需要较长时间，人为操作较多，步骤繁琐容易污染等。
CD276（B7-H3）是新近发现的一种隶属于B7家族的免疫调节蛋白，与其他B7家族分子具有高度的序列和结构同源性。CD276（B7-H3）有两种存在形式，一种是跨膜结构形式，一种是可溶性形式，其中跨膜结构属于I型跨膜结构，该结构包含316个氨基酸，分子量约45-66kDa（B7-H3/CD276: An Emerging Cancer Immunotherapy. Front Immunol. 2021Jul19;12:701006.）。CD276被报道参与增殖、凋亡、侵袭、细胞周期、细胞分化、细胞自噬和表皮间质转化过程 (The Role of CD276 in Cancers. Front Oncol.2021 Mar26;11:654684; The co-stimulatory molecule B7-H3 promotes the epithelial-mesenchymaltransition in colorectal cancer. Oncotarget. 2016 May31;7(22):31755-71)。CD276是新型的免疫检查点分子，被报道在实体肿瘤中表达上调且与癌症患者预后不良密切相关，可被用作肿瘤免疫治疗的一个靶点（B7-H3, a checkpoint molecule, as a targetfor cancer immunotherapy. Int J Biol Sci. 2020 Mar 25;16(11):1767-1773）。此外，CD276在抗原递呈细胞上可被诱导，参与调节T细胞介导的免疫反应，其表达可能由micro-RNA mir-29介导（MicroRNA miR-29 modulates expression of immunoinhibitorymolecule B7-H3: potential implications for immune based therapy of humansolid tumors. Cancer Res. 2009 Aug1;69(15):6275-81）。
而作为新型免疫检查点分子的CD276在不同组织来源的MSC上也被报道表达，如骨髓、脂肪、脐带、牙龈和真皮来源的间充质干细胞以及新生儿包皮成纤维细胞（Humanstromal (mesenchymal) stem cells from bone marrow, adipose tissue and skinexhibit differences in molecular phenotype and differentiation potential.Stem cell reviews and reports 9,32-43(2013); Human Wharton’s Jellymesenchymal stem cells maintain the expression of key immunomodulatorymolecules when subjected to osteogenic, adipogenic and chondrogenicdifferentiation in vitro: new perspectives for cellular therapy. Current StemCell Res Ther. 2013 Jan;8 (1):100-13; Cannabidiol modulates theimmunophenotype and inhibits the activation of the inflammasome in humangingival mesenchymal stem cells. Front Physiol. 2016 Nov24;7:559）。但上述研究主要集中于MSC表型检测方面，缺少与CD276相关的功能研究，仅有一篇论文指出CD276可以介导脐带MSC对活化外周血单个核细胞的增殖抑制（Wharton’s Jelly Mesenchymalstromal cells from human umbilical cord: a close-up on immunomodulatorymolecules featured in situ and in vitro. Stem Cell Rev Rep. 2019 Dec;15(6):900-918）,提示CD276在MSC介导的免疫调控中的重要作用。
考虑到目前对CD276在MSC中的研究尚浅，主要集中在表型检测以及对外周血单个核细胞的增殖抑制方面，而CD276用于评价MSC的生物学效力，尤其是对活化外周血单个核细胞分泌炎性因子的功能抑制方面尚未有相关报道。而且通过直接裂解细胞，测定单位数目细胞所含CD276的蛋白含量来评价该MSC的生物学效力目前也无相关报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用CD276评价MSC生物学效力的方法，不同于以往通过检测细胞培养上清中细胞因子的表达水平来评估MSC的生物学效力，本发明通过裂解单位数目的细胞，检测细胞裂解液中CD276的含量即可快速判断该MSC的生物学效力，判断精准，方便快捷，具有广阔的应用前景，有利于推广应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种利用CD276评价MSC生物学效力的方法，通过收集并裂解单位数目的细胞，利用ELISA检测的方法定量分析细胞裂解液中CD276的含量来判断该MSC的生物学效力，所述生物学效力是指其与活化的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）共培养，对PBMC分泌TNF-α和IFN-γ的抑制能力。
优选地，所述MSC的来源为脐带、骨髓、胎盘或脂肪。
优选地，具体包括如下步骤：
S1：收集细胞：收集并计数细胞；
S2：裂解细胞：将S1计数好的细胞离心，去掉上清保留细胞沉淀；按照单位数量细胞用一定量的细胞裂解液将其在冰上充分裂解适当时间；
S3：收集细胞裂解液：将细胞裂解液在低温条件下高速离心，收集细胞裂解液上清用于CD276的蛋白含量检测；
S4：用人CD276 ELISA试剂盒检测上清液中CD276的浓度并根据细胞计数结果计算单位数目细胞所含CD276的蛋白总量；
S5：当106个细胞中所含CD276的蛋白含量超过13.5ng时，判定该MSC具有免疫抑制的生物学效力。
优选地，所述S1中，若当天收集完细胞但无法裂解，可以将细胞计数后放入液氮快速冷冻固定10min后转移至-80℃冰箱保存。
优选地，所述S2中，细胞悬液的离心转速为1000-2500rpm/5-10min。
优选地，所述S2中，细胞裂解按照106细胞加入100ul细胞裂解液的比例进行。
优选地，所述S2中，细胞在冰上裂解30-60min。
优选地，所述S3中，细胞裂解液在4℃条件下以13000rpm/30-60min离心。
优选地，上述利用CD276评价MSC生物学效力的方法，应用于细胞库及细胞注射液质量检测标准的制定。
本发明提供的一种利用CD276评价MSC生物学效力的方法，具有如下有益效果。
1．相比于以往收集细胞分泌的上清，再检测上清中细胞因子含量的方法，本发明直接裂解细胞，检测细胞裂解液中CD276的含量，省略了收集培养上清的步骤，避免了细胞因子不稳定容易降解的问题，操作步骤更加简便快捷，省时节力，在时间上更加经济高效，同时避免了可能存在的人为污染问题，且膜蛋白比细胞因子更加稳定，不易降解，容易检测。
2．本发明首次阐明MSC中CD276的表达水平与其生物学效力水平（对PBMC分泌TNF-α和IFN-γ的抑制水平）呈显著正相关，且首次采用ELISA的方法检测单位数量细胞裂解液中CD276的含量来判断该MSC的生物学效力。
附图说明
图1为对多样本脐带MSC生物学效力和其基因CD276的转录组水平的FPKM值（FPKM值即每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片）进行相关性分析图，其中：A.多样本脐带MSC基因CD276的转录水平（FPKM值）与其对活化PBMC共培养24h所分泌TNF-α抑制率%呈显著正相关（r=0.524, p=0.045；n=15）；B.多样本脐带MSC基因CD276的转录水平（FPKM值）与其对活化PBMC共培养24h所分泌IFN-γ抑制率%呈显著正相关（r=0.5691, p=0.0268; n=15）；
图2为多样本脐带MSC的细胞裂解液中CD276蛋白含量（n=29）；
图3为满足优选条件的多样本脐带MSC的细胞裂解液中CD276含量和其生物学效力的相关性分析示意图，其中：A.满足优选条件的多样本脐带MSC在规定细胞数的细胞裂解液中所含CD276的蛋白含量（n=26）；B.满足优选条件的多样本脐带MSC分别与活化的PBMC共培养72h，对其分泌的TNF-α抑制率%（n=26）；C.满足优选条件的多样本脐带MSC在规定细胞数的细胞裂解液中CD276的蛋白含量与其对活化PBMC分泌TNFa的抑制率%呈显著正相关（r=0.7086, p<0.0001; n=26）；D.满足优选条件的多样本脐带MSC分别与活化的PBMC共培养72h，对其分泌的IFN-γ抑制率%（n=26）；E.满足优选条件的多样本脐带MSC在规定细胞数的细胞裂解液中CD276的蛋白含量与其对活化PBMC分泌IFN-γ的抑制率%呈显著正相关（r=0.8078, p<0.0001; n=26）。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。
本发明提供的一种利用CD276评价MSC生物学效力的方法，通过收集并裂解一定数量的细胞，利用ELISA检测的方法定量分析细胞裂解液中CD276的含量来评价MSC的生物学效力，所述生物学效力是指其与活化的PBMC共培养，对PBMC分泌TNF-α和IFN-γ的抑制能力。所述MSC的来源为脐带、骨髓、胎盘或脂肪。具体包括如下步骤：
S1：收集细胞：收集并计数一定量的细胞。若当天收集完细胞但无法裂解细胞，可以将细胞计数后放入液氮快速冷冻固定10min后转移至-80℃冰箱保存。
S2：裂解细胞：将S1计数好的细胞离心，细胞的离心转速为1000-2500rpm/5-10min，去掉上清保留细胞沉淀，按照单位数目细胞用一定量的细胞裂解液将其在冰上充分裂解30-60min。细胞裂解按照106细胞加入100ul细胞裂解液的比例进行。若为预先冻存的细胞沉淀可以直接加入相应量的细胞裂解液。
S3：收集细胞裂解液：将细胞裂解液在低温条件下高速离心，收集裂解液上清用于检测CD276的蛋白含量。细胞裂解液在4℃条件下以13000rpm/30-60min离心。
S4：用人CD276 ELISA试剂盒检测上清液中CD276的浓度并根据细胞计数结果计算单位数目细胞所含CD276的蛋白总量。
S5：当106个细胞中所含CD276的蛋白含量超过13.5ng时，判定该MSC具有免疫抑制的生物学效力。
实施例1
对多样本脐带MSC进行生物学效力检测并对细胞进行转录组测序（n=15），具体的实施方法为：
（1）共培养实验：消化计数多样本脐带MSC（n=15），用DF12无酚红完全培养基将其重悬，按照每孔1×104细胞/100ul铺96孔板。显微镜观察，轻轻拍动96孔板，使细胞均匀分布后，放置于二氧化碳培养箱培养。用DF12无酚红完全培养基重悬新鲜的PBMC。取部分未加刺激的细胞用于阴性对照组，剩余细胞加入PHA刺激促使其活化。待MSC贴壁后，按照每孔1×105细胞/100ul将PBMC悬液加入脐带MSC中，再次混匀。阴性对照组为不添加PHA刺激的PBMC组，原则上该组PBMC不活化，分泌极低水平的IFN-γ和TNF-α。阳性对照组（也称PHA组）为PHA活化的PBMC组，MSC组为脐带MSC与PHA刺激的PBMC共培养组。共培养24h后收集上清，并按照2000rpm/10min离心，吸取上清分装并冻存于-80℃待测IFN-γ和TNF-α的含量。
（2）用人IFN-γ和人TNF-αELISA试剂盒（欣博盛）检测共培养上清中IFN-γ和TNF-α的含量并根据如下公式计算抑制率%：
IFN-γ抑制率%=[1-IFN-γ（MSC组）/IFN-γ（PHA组）]*100%
TNF-α抑制率%=[1-TNF-α（MSC组）/TNF-α（PHA组）]*100%
（3）转录组测序：分别取2×106脐带MSC，用DPBS清洗后，用1ml Trizol充分裂解、冻存并以干冰寄送测序。
（4）对多样本MSC生物学效力和其基因CD276的转录组水平（FPKM）进行相关性分析，分析结果如图1所示。
通过对共培养上清中IFN-γ和TNF-α的含量检测，阴性对照组PBMC分泌的IFN-γ和TNF-α含量极低，阳性对照组中活化的PBMC分泌的二者IFN-γ和TNF-α含量最高，而MSC组可以显著抑制活化的PBMC分泌IFN-γ和TNF-α。由图1可知：对多样本脐带MSC生物学效力和其基因CD276的转录组水平进行相关性分析，发现不论TNF-α抑制率%（A）还是IFN-γ抑制率%（B）均与基因CD276的转录组水平呈显著正相关（TNF-α: r=0.5240, p=0.045; IFN-γ:r=0.5691，p=0.0268；n=15）。该结果从转录水平提示基因CD276是评估MSC生物学效力的潜在指标。
实施例2
对多样本脐带MSC的细胞裂解液中CD276蛋白含量进行ELISA检测，具体实施例如下：
（1）对多样本脐带MSC进行细胞计数和裂解（n=29）：消化收集多个不同人来源的脐带MSC并清洗计数(或将预先计数好的冷冻保存的细胞沉淀取出)，按照1×106细胞加入100ul的细胞裂解液将其在冰上充分裂解。细胞裂解液为混有1%蛋白酶抑制剂和1%EDTA的NP40细胞裂解液（博士德）。细胞在冰上裂解约30-60min后，将细胞裂解液在预先制冷的低温高速离心机中，4℃按13000rpm/30-60min离心，收集裂解液上清；
（2）对多样本脐带MSC的细胞裂解液中CD276的蛋白含量进行ELISA检测：具体步骤参照人CD276 ELISA试剂盒（RayBiotech）说明书，根据细胞计数结果和ELISA检出的CD276的浓度计算单位数量细胞的CD276蛋白含量，结果如图2所示。
由图2可知：多样本脐带MSC单位细胞数所含的CD276的蛋白含量参差不齐。106个脐带MSC所含CD276的蛋白平均含量在18.49ng±3.892，范围在11.93ng～26.7ng之间。
实施例3
对满足优选条件的多样本脐带MSC进行生物学效力评价，并结合一定数目细胞裂解液中CD276的蛋白含量进行相关性分析。优选条件为106个细胞的裂解液中CD276含量需要超过13.5ng，具体实施方法为：
（1）对满足优选条件的多样本脐带MSC进行细胞计数和裂解（n=26）：消化收集多样本脐带MSC并清洗计数(或将预先计数好的冷冻保存的细胞沉淀取出)，按照1×106细胞加入100ul的细胞裂解液将其在冰上充分裂解。细胞裂解液为混有蛋白酶抑制剂和EDTA的NP40裂解液（博士德）。细胞在冰上裂解约30-60min后，将裂解液在预先制冷的低温高速离心机中，4℃按13000rpm/30-60min离心，收集裂解液上清；
（2）对多样本脐带MSC的细胞裂解液中CD276的蛋白含量进行ELISA检测：参照人CD276 ELISA试剂盒（RayBiotech）说明书检测CD276的含量；
（3）对多样本脐带MSC进行生物学效力检测：消化计数脐带MSC，用DF12无酚红完全培养基将其重悬，按照每孔1×104细胞/100ul铺96孔板。显微镜观察，轻轻拍动96孔板，使细胞均匀分布后，放置于二氧化碳培养箱培养。用DF12无酚红完全培养基重悬新鲜的PBMC。取部分未加刺激的细胞用于阴性对照，剩余细胞加入PHA促使其活化。待MSC贴壁后，按照每孔1×105细胞/100ul将PBMC悬液加入MSC中，再次混匀。阴性对照组为未活化的PBMC，阳性对照组（也称PHA组）为PHA活化的PBMC，MSC组为脐带MSC和PHA活化的PBMC共培养。培养72h后收集共培养上清，按照2000rpm/10min离心，吸取上清分装并冷冻保存于-80℃冰箱待测IFN-γ和TNF-α的含量。
（4）对共培养上清中IFN-γ和TNF-α的含量进行ELISA检测：参照人IFN-γ和人TNF-α ELISA试剂盒（欣博盛）说明书。根据共培养上清中IFN-γ和TNF-α的含量分别计算二者的抑制率%：
IFN-γ抑制率%=[1-IFN-γ（MSC组）/IFN-γ（PHA组）]*100%
TNF-α抑制率%=[1-TNF-α（MSC组）/TNF-α（PHA组）]*100%
（5）对单位数量不同人来源的MSC所含CD276的蛋白含量与其生物学效力进行相关性分析，结果如图3所示。
通过对共培养上清中IFN-γ和TNF-α的含量检测，阴性对照组PBMC分泌的IFN-γ和TNF-α含量极低，阳性对照组中活化的PBMC分泌的二者IFN-γ和TNF-α含量最高，而MSC组可以显著抑制活化的PBMC分泌IFN-γ和TNF-α。由图3可知：对满足优选条件的多样本脐带MSC的CD276的蛋白含量（A）进行ELISA检测（n=26）。分别将多样本脐带MSC与PHA活化的PBMC共培养72小时，收集共培养上清并检测其中TNF-α和IFN-γ的含量，计算MSC对活化PBMC分泌TNF-α（B）和IFN-γ的抑制率%（D）。通过对多样本MSC细胞裂解液中的CD276含量和其对活化PBMC分泌TNF-α抑制率%和IFN-γ抑制率%进行Spearman相关性分析后发现，CD276含量分别与TNF-α抑制率%（C）和IFN-γ抑制率%（E）呈显著正相关（TNF-α: r=0.7086, ****p<0.0001; IFN-γ: r=0.8078, ****p<0.0001）。
本发明是在MSC基础研究的过程中，通过转录组测序，ELISA检测细胞裂解液中CD276含量以及生物学效力分析的过程中发现的。
（1）转录组测序结合生物学效力进行相关性分析，从基因的转录水平发现MSC基因CD276的转录水平与其生物学效力呈显著正相关。
（2）通过对多个不同个体来源的脐带MSC的细胞裂解液中CD276含量和其生物学效力检测分析，发现CD276的表达水平与其生物学效力呈显著正相关；
（3）当106个MSC所含CD276的蛋白含量超过13.5ng时，该MSC与PHA活化的PBMC共培养72小时，可以显著抑制其分泌TNF-α和IFN-γ超过65%。
本发明首次描述了MSC膜蛋白CD276的含量与其生物学效力（对活化PBMC分泌TNF-α和IFN-γ的抑制水平）呈显著正相关，并首次采用ELISA检测细胞裂解液中关键膜蛋白CD276的含量来评价MSC的生物学效力。相比于以往培养细胞，收集培养上清，再用ELISA方法检测上清中的细胞因子，本发明收集计数后的细胞直接裂解，省略了细胞培养和细胞因子收集等相关步骤，操作更加简便快捷，省时节力，在时间上更加经济高效，同时避免了可能存在的人为污染问题，且膜蛋白比细胞因子更加稳定，不易降解，容易保存和检测。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利用CD276评价间充质干细胞生物学效力的方法，其特征在于，通过收集并裂解一定数量的细胞，利用ELISA检测的方法定量分析细胞裂解液中CD276的含量来评价间充质干细胞的生物学效力，所述生物学效力是指其与活化的外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cell,PBMC)共培养，对PBMC分泌TNF-α和IFN-γ的抑制能力，间充质干细胞中CD276的表达水平与其对PBMC分泌TNF-α和IFN-γ的抑制水平呈显著正相关。
2.据权利要求1所述的一种利用CD276评价间充质干细胞生物学效力的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源为脐带、骨髓、胎盘或脂肪。
3.根据权利要求2所述的一种利用CD276评价间充质干细胞生物学效力的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1：收集细胞：收集并计数细胞；
S2：裂解细胞：将S1计数好的细胞离心，去掉上清保留细胞沉淀，按照单位数目细胞用细胞裂解液将其在冰上充分裂解；
S3：收集细胞裂解液：将S2细胞裂解液在低温条件下高速离心，收集裂解液上清用于CD276的蛋白含量检测；
S4：用人CD276 ELISA试剂盒检测上清液中CD276的浓度，并根据细胞计数结果计算单位数量细胞所含CD276的蛋白总量；
S5：当106个细胞中所含CD276的蛋白含量超过13.5ng时，判定该间充质干细胞具有免疫抑制的生物学效力。
4.根据权利要求3所述的一种利用CD276评价间充质干细胞生物学效力的方法，其特征在于，应用于细胞库及细胞注射液质量检测标准的制定。
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