KR102126783B1 - 항결핵 nk세포 대량 증식방법 - Google Patents

항결핵 nk세포 대량 증식방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 말초혈액으로부터 림프구가 분리되어 배양액에 현탁되는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서의 현탁액에, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상이 투입되어 배양되는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서의 현탁액에 새로운 배지가 투입되어 현탁된 이후, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상이 투입되어 배양되는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서의 현탁액에 새로운 배지가 투입되어 현탁된 이후, anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체가 제외된 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상이 투입되어 배양되는 단계를 포함하는 항결핵 NK세포 대량 증식방법에 관한 것이다.

Description

항결핵 NK세포 대량 증식방법{A anti-tuberculosis NK cell mass proliferation method}
본 발명은 일정한 배양단계를 거치되, 초기 배양단계에서는 anti-NKp46 항체 및 anti-NKp44 항체가 투입되는 되지만, 후기 배양단계에서는 anti-NKp46 항체 및 anti-NKp44 항체가 제외된 다른 항체와 혈장만이 투입되도록 하여, NKp44, NKp46 또는 NKG2D인 활성화 수용체(activating receptor)가 과발현된 NK세포를 대량 증식하는 방법으로서, 우수한 항결핵 효과를 나타내는 항결핵 NK세포 대량 증식방법에 관한 것이다.
결핵(結核, tuberculosis, TB)은 여러 종류의 미코박테륨, 특히 결핵균에 감염되어 발병하는 흔하고 치명적인 전염병으로서, 가슴앓이(consumption), 백사병(white death)이라고도 한다. 결핵균은 1882년 미생물학자인 로베르트 코흐에 의해 발견되었다. 세계적으로 해마다 새로 결핵 진단을 받은 사람은 약 870만 명이며 이중 140만명이 사망한다고 알려져 있다.
또한, 우리나라는 OECD 가입국 중 결핵 발생률 및 사망률이 1위이다. 우리나라에서 결핵으로 신고되는 신 환자 수는 약 39,000명으로 결핵으로 인한 사망자수도 약 2,300명에 이르며, 우리나라 법정 감염병 중 사망자가 가장 많다.
하지만, 더 큰 문제점은 최근 들어 일상적인 결핵 치료제로 제대로 완치할 수 없는 다제내성 결핵의 출현과 그 빈도의 증가에 있는데 이와 같은 다제내성 결핵에 감염될 경우 치료기간이 6개월에서 최소 18개월로 길어질 뿐만 아니라 약제에 대한 부작용도 심해 치료 성공률도 떨어지는 등 결핵치료가 더 힘들어 지게 된다.
우리나라의 결핵 발생율이 높은 이유로 결핵에 대한 방심, 치료 중심 방역의 한계점, 결핵에 대한 경각심 부족으로 인해 약물복용 시기를 지키지 않는 점, 학교, 학원, 군대, 기숙사 등 다중 밀접 생활로 인하여 쉽게 전파가 가능한 환경 등이 고려될 수 있다. 이렇듯 면역력이 떨어지는 노년 인구에서뿐만 아니라, 젊은 청년기 등에서도 결핵 발병이 자주 보고되는 등 계층이나 연령과 무관하게 나타나는 질병이 되었다. 따라서, 새로운 결핵 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
우리나라 말고도 북한에는 약 51만의 결핵 환자가 있을 것으로 추정되기도 한다. 2015년 기준으로 3.74배에 이르는 것으로 보고 되었다. 특히, 심각한 것은 북한에는 다제내성 결핵이 많다는 것이다. 다제내성(多劑耐性) 결핵이란 가장 효과적인 두 가지 결핵약이 모두 듣지 않는 결핵이다. 다른 세균들은 단기간 항생제를 사용하는 것과는 달리, 결핵은 6개월 ~ 2년의 훨씬 긴 치료 기간을 필요로 하는데, 이는 미코박테리아를 박멸하기 위해서이다. 일반 결핵은 약값 3만∼4만원으로 6개월 치료하면 낫지만, 다제내성일 경우 약값은 최소 100배 이상 들고, 치료 기간도 2년 정도 소요되는 것으로 알려져 있다. 북한이 만약 인도와 비슷한 비율이라면 다제내성 결핵 환자는 한해 3,500명 정도 생기겠지만, 중국이나 러시아 수준이라면 8,000 내지 23,000명까지 봐야 할 것이다.
연구발표를 따르면 만성 결핵균 감염환자의 폐병변으로 NK세포가 모이고, NK세포는 TLR-2 및 세포 독성 수용체(NCR)인 NKp44 수용체를 통해 Mycolic acids와 같은 다양한 결핵균(Mtb)의 세포벽 성분을 인식한다고 보고되었다 (Interaction of mycobacterium tuberculosis cell wall components with the human natural killer cell receptors NKp44 and toll-like receptor 2, Scandinavian Journal of Immunology, 2013).
1차결핵증(primary TB)은 환자가 세균을 흡입하고, 균들이 폐에 쌓이게 되면서 폐의 대식세포(macrophage)에 탐식 당하게 된다. 이때 살아남은 균들은 림프계(lymphatic system)나 혈관계를 통해 다른 장기로 퍼져나가게 된다. 대식세포에 탐식 당한 결핵균들도 죽지 않고 대식세포 내에서 생존한다. 결핵을 섭취한 대식세포 표면에서 ULBP-1 및 vimentin 리간드들이 발현하는데, 이는 NK세포의 활성화 수용체인 NKG2D 및 NKp46 수용체가 인식하여 대식세포를 용해시킬 수 있다고 보고되었다 (The NKp46 receptor contributes to NK cell lysis of mononuclear phagocytes infected with an intracellular bacterium, The Journal of Immunology, 2002).
결핵균과 싸우고 난 뒤 살아남은 NK세포는 수명이 길어지고 기억 NK세포로 분화하게 되고, 결핵의 재감염시 2차 면역반응을 일으켜 다른 면역반응을 높일 수 있다는 보고도 있다 (Memory of Natural Killer Cells: A New Chance against Mycobacterium tuberculosis. Front. Immunol, 2017).
하지만, 활동성 결핵환자에서는 NK세포의 면역기능을 억제하는 수용체인 KIR 이 정상인보다 더 많이 발현되어 있고, 폐결핵으로 진단받은 환자는 NK세포 수가 감소되고 활성화 수용체인 NKp30, NKp46 및 활성화된 NK세포에서 분비하는 IFN-γ의 발현 저하를 보인다고 보고되었다. 결핵균에 감염된 세포를 체외 배양하려 해도 대량 증식이 되지 않는 문제가 있고, 배양이 된다고 해도 일반적인 배양 방법을 사용하여 배양을 하면 결핵을 효과적으로 예방하기 어렵다. 이처럼 고병원균을 효과적으로 예방할 수 있는 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
한국등록특허 제10-1760764호
상술한 종래기술에 따른 문제점을 해결하고자 항결핵 효과가 우수한 NK세포를 대량으로 증식할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
구체적으로, 결핵균을 직접적으로 인식할 수 있는 활성화 수용체인 NKp44, NKp46 또는 NKG2D 등을 많이 발현되는 활성화된 NK세포를 대량으로 증식할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
상술한 종래기술에 따른 문제점을 해결하고자 본 발명에 따른 항결핵 NK세포 대량 증식방법은, (a) 말초혈액으로부터 림프구가 분리되어 배양액에 현탁되는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서의 현탁액에, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상이 투입되어 배양되는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서의 현탁액에 새로운 배지가 투입되어 현탁된 이후, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상이 투입되어 배양되는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서의 현탁액에 새로운 배지가 투입되어 현탁된 이후, anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체가 제외된 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상이 투입되어 배양되는 단계를 포함한다.
바람직하게는, (e) 상기 (d) 단계에서의 현탁액에 새로운 배지가 투입되어 현탁된 이후, anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체가 제외된 IL-2 및 혈장만이 투입되어 배양되는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 (b) 단계 및 상기 (c) 단계에서, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상에는 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체 중 어느 하나 이상이 포함된다.
바람직하게는, 상기 (b) 단계에서, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상은 배양 시작 당일에 투입된다.
바람직하게는, 상기 (c) 단계에서, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상은 배양 2일차에 투입된다.
바람직하게는, 상기 (d) 단계에서, anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체가 제외된 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 2종 이상은 배양 5일차에 투입되며, 상기 (e) 단계에서, anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체가 제외된 IL-2 및 혈장은 배양 7일차에 투입된다.
본 발명은 말초혈액에서 분리된 림프구로부터 항결핵 NK세포를 대량 증식하는 방법에 관한 것으로서, 이에 따라 증식된 NK세포는 활성화 수용체인 NKp44, NKp46 및 NKG2D이 과발현된 상태에서 결핵균 또는 결핵균에 감염된 대식세포를 사멸시킴으로써 고병원성 결핵의 재발을 막고, 잠복결핵의 활성화를 예방할 수 있으며, 특히, 다제내성 결핵을 치료할 수 있어, 결핵의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 A 배양법 및 B 배양법에 따라 배양된 세포에 대하여 annexin V-FITC apoptosis detection kit를 이용하여 세포사멸 정도를 측정한 결과이다.
도 2는 A 배양법 및 B 배양법에 따라 배양된 세포의 세포사멸 분석 결과에서 early apoptosis 비율 및 late apoptosis 비율을 비교한 결과이다.
도 3은 활성화된 NK세포 및 면역세포의 표현형을 나타낸 결과이다.
도 4는 활성화된 NK세포의 활성화 수용체인 NKp46, NKG2D 및 NKp44의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 5는 종래기술에 따른 NK세포의 배양방법으로 배양한 후, NK세포의 활성화 수용체인 NKp46, NKG2D 및 NKp44의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 6은 활성화된 NK세포를 포함한 면역세포를 결핵균에 감염된 대식세포와 공배양하여 결핵균을 억제하는 효과를 확인하기 위한 실험 공정도를 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 대식세포를 결핵균에 감염시킨 후 3일째에서 NK세포의 처리 유무에 따른 대식세포의 증식 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 9 및 도 10은 대식세포를 결핵균에 감염시킨 후 6일째에서 NK세포의 처리 유무에 따른 대식세포의 증식 억제 효과를 나타낸 결과이다.
본 발명에서의 용어, "자연살해세포(natural killer cells, 이하 "NK세포"라 함)"는 선천면역에 중요한 세포로서, 비정상세포를 인지하여 세포사멸(apoptosis)을 일으키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서의 용어, "NKT 세포"는 NK세포와 매우 유사한 세포로서, 간이나 골수에서 성숙하게 되는 NK세포와 달리, 흉선에서 성숙하고, T 세포의 일종으로서 T 세포 수용체를 가지고 있다. NK세포와 NKT 세포는 모두 NK세포 수용체를 가지고 있다.
본 발명에서의 용어, "NK세포가 포함된 면역세포"는 NK세포, NKT 세포 및 T세포를 포함하는 세포이고, 이중 NK세포 및 NKT 세포의 비율이 전체 비율 중 50% 이상을 차지하는 세포를 지칭한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 활성화된 NK세포가 포함된 면역세포의 제조방법
1.1. 제 1 단계
본 발명자들은 활성화된 NK세포가 포함된 면역세포를 제조하기 위하여, 우선, 사람의 말초혈액에서 림프구를 분리하였다. 구체적으로, 사람의 말초혈액을 헤파린 처리된 10㎖ 진공채혈관(BD Vacutainer TM)을 이용하여 30㎖ ~ 60㎖ 채혈하였다. 이후, 50㎖ 림프구 분리튜브(Leuco sep, Greiner Bio-One, Swiss)에 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque Plus; endotoxin tested, 밀도 1.077g/㎖, GE Healthcare, USA) 용액을 15㎖ 넣고, 2,000rpm에서 원심분리하여 용액을 튜브 내의 글래스 멤브레인(glass membrane)의 아래로 침강시켰다. 채혈한 혈액은 분리튜브에 옮기고, 2,500rpm에서 원심분리하여 적혈구 및 과립구층는 아래층으로, 단핵구층(림프구층), 혈소판 및 혈장은 상층으로 나뉘게 하여, 혈액성분을 분리하였다.
원심분리로 나뉘어진 상층의 혈장은 56℃ 수조에서 30분간 불활성화(inactivation)시켰다. 림프구층은 멸균된 피펫을 이용하여 채취한 후 15㎖ 튜브(tube)에 모은 후, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상층액이 제거된 림프구는 완충용액(PBS) 10㎖로 현탁하여 세정(washing)하였다. 현탁액의 일부는 혈구계산판(hemocytometer)을 사용하여 세포수를 측정하였고, 다시 원심분리하여 림프구만을 모았다. 수확된 림프구의 세포수는 총 20x106 개로 측정되었다.
1.2. 제 2 단계
제 1 단계에서 분리된 림프구를 배양액(KBM502)에 현탁시킨 후, 세포 현탁액에 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 적어도 2종 이상을 선택하여 투입하였고, 25T Flask 에서 1~2일간 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 면역세포를 배양하였다. 본 단계에서의 항체 및 혈장은 배양 시작 당일에 현탁액에 투입하였다.
다만, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 적어도 투입되는 2종 이상에는 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체 중 어느 하나 이상을 포함하였다. 즉, 투입되는 2종에는 anti-NKp44 항체 또는 anti-NKp46 항체 중 반드시 어느 하나가 포함되어 투입되었거나, 또는 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체 모두 다 포함되어 투입되었다.
도 1 및 도 2에 도시된 배양법 A, B에 따른 결과 데이터에 대해서 본 제 2 단계에서는, 제 1 단계에서 분리된 림프구를 배양액(KBM502)에 현탁시킨 후. 분리되어 진행되는 배양법 A, B의 세포 현탁액 각각에 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장을 투입하여 면역세포를 배양하였다.
1.3. 제 3 단계
면역세포가 배양되고 있는 제 2 단계에서의 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 세포 현탁액에 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 적어도 2종을 선택하여 투입하였고, 75T Flask 에서 2~3일간 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 면역세포를 배양하였다. 본 단계에서의 항체 및 혈장은 배양 2일차에 투입하였다.
다만, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 적어도 투입되는 2종에는 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체 중 어느 하나 이상을 포함하였다. 즉, 투입되는 2종에는 anti-NKp44 항체 또는 anti-NKp46 항체 중 반드시 어느 하나가 포함되어 투입되었거나, 또는 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체 모두 다 포함되어 투입되었다.
도 1 및 도 2에 도시된 배양법 A, B에 따른 결과 데이터에 대해서 본 제 3 단계에서는, 면역세포가 배양되고 있는 제 2 단계에서의 배양법 A, B 각각의 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 배양법 A, B의 세포 현탁액 각각에 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장을 각각 투입하여 면역세포를 배양하였다.
1.4. 제 4 단계
제 3 단계에서 배양된 면역세포는 이후, A 또는 B 배양방법으로 나뉘어 배양하였다.
1.4.1. A 배양법
제 3 단계에서 면역세포가 배양되고 있는 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 세포 현탁액에 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 적어도 2종을 선택하여 투입하였고, 175T Flask 에서 2~3일간 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 면역세포를 배양하였다. 본 단계에서의 항체 및 혈장은 배양 5일차에 투입하였다.
도 1 및 도 2에 도시된 배양법 A, B에 따른 결과 데이터에 대해서 본 제 4 단계의 A 배양법에서는, 면역세포가 배양되고 있는 제 3 단계에서의 배양법 A의 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 배양법 A의 세포 현탁액에 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체 및 혈장을 투입하여 면역세포를 배양하였다.
1.4.2. B 배양법
제 3 단계에서 면역세포가 배양되고 있는 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 세포 현탁액에 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체 및 혈장으로 이루어진 그룹에서 적어도 2종을 선택하여 투입하였고, 추가로 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체 중 1종을 선택하여 투입하였으며, 175T Flask 에서 2~3일간 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 면역세포를 배양하였다. 본 단계에서의 항체 및 혈장은 배양 5일차에 투입하였다.
도 1 및 도 2에 도시된 배양법 A, B에 따른 결과 데이터에 대해서 본 제 4 단계의 B 배양법에서는, 면역세포가 배양되고 있는 제 3 단계에서의 배양법 B의 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 배양법 B의 세포 현탁액에 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장을 투입하여 면역세포를 배양하였다.
1.5. 제 5 단계
제 4 단계에서 배양된 면역세포는 이후, A 또는 B 배양법으로 나뉘어 배양하였다.
1.5.1. A 배양법
제 4 단계에서 면역세포가 배양되고 있는 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 세포 현탁액에 IL-2 및 혈장을 투입하였고, 1,000ml CO2 투과 bag에서 7~10일간 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 면역세포를 배양하였다. 본 단계에서의 항체 및 혈장은 배양 7일차에 투입하였다.
도 1 및 도 2에 도시된 배양법 A, B에 따른 결과 데이터에 대해서 본 제 5 단계의 A 배양법에서는, 면역세포가 배양되고 있는 제 4 단계에서의 배양법 A의 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 배양법 A의 세포 현탁액에 IL-2 및 혈장을 투입하여 면역세포를 배양하였다.
1.5.2. B 배양법
제 4 단계에서 면역세포가 배양되고 있는 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 세포 현탁액에 IL-2 및 혈장을 투입하였고, 추가로 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체 중 1종을 선택하여 투입하였으며, 1,000ml CO2 투과 bag에서 7~10일간 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 면역세포를 배양하였다. 본 단계에서의 항체 및 혈장은 배양 7일차에 투입하였다.
도 1 및 도 2에 도시된 배양법 A, B에 따른 결과 데이터에 대해서 본 제 5 단계의 B 배양법에서는, 면역세포가 배양되고 있는 제 4 단계에서의 배양법 B의 현탁액에 새로운 배지를 투입하여 현탁시킨 후, 배양법 B의 세포 현탁액에 IL-2 및 혈장을 투입하였고, 추가로 anti-NKp46 항체를 선택하여 투입하여 면역세포를 배양하였다.
1.6. 제 6 단계
제 5 단계에서 CO2 투과 bag에 들어있는 배양법 A, B에 따른 세포 현탁액을 원심분리 튜브에 옮긴 후, 2,500rpm 에서 원심분리하여 세포를 수확하였다. 상층액은 버리고, 세포가 포함된 pellet은 멸균생리식염수 250ml로 세포를 2회 세척한 뒤 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포는 주사용 멸균 생리식염수 100ml 팩에 세포를 주입하여 제조를 완성하였다.
1.7. 제조방법의 비교
본 발명자들은 활성화된 NK세포를 포함하는 면역세포를 제조하기 위하여, 실시예 1에서와 같이 건강한 사람의 말초혈액으로부터 림프구를 분리하였고, 상기 세포를 활성화 및 증식시킨 뒤, 7~14일차에 세포를 수확하였다.
본 발명자들은 실시예 1의 제조방법 중 A 배양법 및 B 배양법으로 나누어 배양하였는데, 제 4 단계 및 제 5 단계에 이르러 A 배양법은 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체를 추가로 처리하지 않은 방법이고, 제 4 단계 및 제 5 단계에 이르러 B 배양법은 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체 중 1종 이상을 추가로 처리한 방법이다.
본 발명자들은 A 배양법 또는 B 배양법으로 배양된 면역세포를 14일간 배양한 후, annexin V-FITC apoptosis detection kit를 이용하여 세포사멸 정도를 측정하였다. 그 결과, A 배양법은 early apoptosis 비율이 0.7%인 반면, B 배양법은 7.7%로서 세포사멸이 11배 정도 증가하였고, A 배양법은 late apoptosis 비율이 0.3%인 반면, B 배양법은 4.7%로서 세포사멸이 15배 정도 증가하였음을 확인하였다 (도 1 및 도 2).
이에 따라, A 배양법은 세포생존율이 98.2%인 반면, B 배양법은 85.7%로서, B 배양법은 현저하게 낮은 세포생존율을 보였다 (도 1). 즉, 제 4 단계 및 제 5 단계에서도 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체 중 1종 이상을 추가로 처리한 배양 방법(B 배양법)에서는 세포 독성이 일어나 세포사멸(apoptosis)이 일어남을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 A 배양법 또는 B 배양법으로 배양된 면역세포를 14일간 배양한 후, Hemacytometer를 이용하여 증식된 세포수를 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, A 배양법에 의해 배양된 면역세포의 세포수는 2.6x109 cells 이었고, B 배양법에 의해 배양된 면역세포의 세포수는 1.7x109 cells로 측정되었다. 이로써, A 배양법에 의한 경우 세포증식 효과가 더 뛰어남을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 배양 초기인 제 2 단계 및 제 3 단계에만 anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체를 투입하여 배양하는 것이 면역세포의 생존율을 높이고 대량 증식에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 2. 제조한 NK세포가 포함된 면역세포의 표현형 분석
본 발명자들은 배양법 A에 따라 배양된 NK세포가 포함된 면역세포를 배양 전 및 14일간의 배양 후로 나누어, NK세포, NKT 세포 및 T 세포에 대한 표현형을 유세포 분석기를 통해 확인하였다.
배양 전인 말초혈액에서 림프구를 분리(배양 전)하여 표현형을 분석한 결과, NK세포 및 NKT 세포 (NK+NKT 세포)의 비율은 26%이었고, T 세포의 비율은 43.2%이었다 (도 3, 왼쪽 패널). 또한, 분리된 림프구를 14일 동안 배양한 후에는 NK세포 및 NKT 세포 (NK+NKT 세포)의 비율이 89.4%이었고, T 세포 비율은 9.0%로 확인되었다 (도 3, 오른쪽 패널).
이로써, 본 발명자들은 말초혈액에서 림프구를 분리하여 배양함으로써 활성화된 NK세포(50% 이상으로 포함)가 포함된 면역세포를 대량생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 제조된 NK세포의 활성화 수용체 분석
NK세포가 결핵균 또는 결핵균을 탐식한 대식세포를 직접적으로 인식하기 위해서는 NK세포가 활성화 수용체(activating receptor)가 높게 발현되어야 하는데, 활성화 수용체 중 NKp44은 결핵균을 직접적으로 인식하고, NKG2D 및 NKp46는 결핵균을 탐식한 대식세포를 인식하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 배양법 A에 따라 배양된 NK세포가 포함된 면역세포를 배양 전 및 14일간의 배양 후에 NK세포의 활성화 수용체인 NKp44, NKp46 및 NKG2D의 발현 수준을 유세포분석기를 통해 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 배양 전 림프구에서 활성화 수용체인 NKp46, NKG2D 및 NKp44 의 발현 수준은 각각 0.1%, 0.6% 및 0.2%로서, 모두 1% 미만을 수치를 보였다(도 4, 위쪽 패널). 그런데, 배양법 A에 따라 배양된 NK세포의 활성화를 유도하는 배양방법에 의할 경우 활성화 수용체인 NKp46, NKG2D 및 NKp44의 발현 수준은 각각 73.9%, 85% 및 61.2%로서, 배양 전의 발현 수준에 비해 현저하게 상승된 수치를 보였다 (도 4, 아래쪽 패널).
따라서, 본 발명자들은 배양법 A에 따라 배양된 NK세포의 활성화를 유도할 수 있는 배양방법을 통해 활성화 수용체(activating receptor)인 NKp46, NKG2D 및 NKp44가 과발현된 NK세포를 대량 증식할 수 있음을 확인하였고, 이를 통해 결핵을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 상술한 종래기술인 대한민국 등록특허 제10-1760764호에 따라 기존에 알려진 NK세포의 배양방법에 의할 경우 활성화 수용체의 발현 수준을 측정하여 본 발명에 따른 방법과 비교하는 실험을 수행하였다. 기존에 알려진 NK세포의 배양방법은 세포 배양 시 IL-2, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체 및 anti-CD355 항체를 처리하여 14일간 배양하는 것이다. 본 발명자들은 기존에 알려진 NK세포의 배양방법으로 세포를 배양한 후 활성화 수용체의 발현 수준을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, NKp46, NKG2D 및 NKp44 은 각각 21.8%, 41.2% 및 7.8%의 발현 수준을 나타내었다 (도 5).
이로써, 본 발명에 따른 방법이 종래기술에 알려진 배양방법에 비해 활성화 수용체의 발현 수준이 현저히 높은 것으로 확인되었다.
실시예 4. 활성화된 NK세포를 통한 결핵균의 증식 억제 효과
결핵균은 세포 내에 기생하는 병원체로서, 체내에 침입한 후에는 탐식구, 즉, 대식세포를 감염시켜 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 결핵균으로 대식세포를 감염시킨 후, 배양법 A에 따라 배양된 활성화된 NK세포에 의해 결핵균의 증식억제 작용이 있는지 알아보기 위한 실험을 진행하였다.
4.1. 결핵균에 감염시킬 대식세포 제조
본 발명에서 사용된 대식세포의 경우, 건강한 사람의 말초혈액 60cc를 채취하여 원심분리를 통해 림프구를 채취한 뒤 2시간 동안 세포를 세포배양접시(cell culture plate)에 부착시킨 후, 부착되지 않은 세포는 제거하고, 부착된 세포를 대식세포로 분화하여 사용하였다. 부착세포는 10% FBS가 첨가된 RPMI1640 배지를 사용하여 5% CO2 인큐베이터에서 약 7일 동안 배양하였다.
4.2. 결핵균의 배양
본 발명에서 사용된 결핵균주는 표준결핵균주인 Mycobacterium tuberculosis H37Pv (국제결핵연구소에서 보유하고 있음)를 사용하였고, 상기 결핵균은 10% ADC를 첨가된 Middlebrook 7H9(Sigma-Aldrich) 배지를 사용하여 최소 3주간 배양하였다.
4.3. 실험 공정
실험에 사용될 활성화된 NK세포가 포함된 면역세포 및 대식세포는 7~14일간 배양하여 준비하였고, 이후, 배양 후 7일차에는 대식세포로 분화된 세포주를 24-well plate에 2x105 cells/well의 양으로 분주한 후, 상기 대식세포에 Mycobacterium tuberculosis H37Pv를 5 MOI (multiplicity of infection)로 첨가하여 대식세포를 결핵균으로 감염시켰다 (도 6). 24시간 후, 활성화된 NK세포가 포함된 면역세포의 E:T(면역세포수: 결핵균에 감염된 대식세포수) 비율을 1:20으로 하여 대식세포에 처리하였다. 이후, 6일 동안 배양하면서, 3일 및 6일째에 AFB(Acid-Fast Bacilli) 염색을 통해 결핵균의 증식 및 억제 효과를 확인하였다.
4.4. 결과
표 1에서와 같이, 3일째 및 6일째 모두에서는 대식세포가 결핵균에 의해 감염되었음을 확인하였고, 6일째에는 활성화된 NK세포가 처리된 그룹에서 결핵균의 증식이 현저하게 억제되는 효과가 있음을 확인하였다.
공 배양 일수 시료 명 E:T ratio 대식세포 결핵균 (H37Rv) 감염 증식억제 여부
3일째 활성화 NK세포가 포함된 면역세포 처리안함 ++++ + ~ ++
(면역세포가 감싸서 분석이 어려움)
1: 20 ++++ + ~ ++
(면역세포가 감싸서 분석이 어려움)
6일째 활성화 NK세포가 포함된 면역세포 처리안함 ++++ 이상 +
(강한 억제)
1: 20 ++++ 이상 +
(강한 억제)
구체적으로, 도 7 및 도 8은 감염 후 3일째에서 결핵균에 감염된 대식세포의 결과를 나타낸 것으로서, 면역세포가 첨가되지 않은 군(Macrophage + H37Rv)에서는 결핵균(violet staining 된 것)이 많이 증식되어 있음을 확인하였고, 면역세포가 첨가된 군(Macrophage + H37Rv + NK)에서는 감염된 대식세포 쪽으로 면역세포가 이동하여 세포에 부착하고 있는 모습이 관찰되었고, 면역세포가 대식세포를 감싸고 있어 염색된 결핵균의 확인이 어려웠다.
도 9 및 도 10은 감염 후 6일째에서 결핵균에 감염된 대식세포의 결과를 나타낸 것으로서, 면역세포가 첨가되지 않은 군(Macrophage + H37Rv)에서는 결핵균(violet staining 된 것)이 많이 증식되어 있을 뿐 아니라 대식세포가 많이 사멸되어 있었으며, 살아있는 세포에서도 형태상으로 건강해 보이지 않았다. 그러나, 면역세포가 첨가된 군(Macrophage + H37Rv + NK)에서는 결핵균의 증식이 현저하게 억제되어 있었고, 대식세포의 상태도 좋아 보였음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 배양법 A에 따라 배양된 활성화된 NK세포는 결핵균 및 결핵균을 탐식한 대식세포에 직접적으로 부착하여 작용하는 것을 확인하였고, 시간이 갈수록 결핵균을 강하게 억제하였음을 확인하였다.
결핵균은 대식세포가 탐식하여도 대식세포에서 살아남아 잠재되어 있다는 문제가 있는데, 본 발명에 따른 배양법 A에 따라 배양된 활성화된 NK세포는 감염된 대식세포까지 인식하여 사멸시킴으로써 잠재되어 있는 결핵균의 활성을 억제할 수 있는 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (5)

  1. (a) 말초혈액으로부터 림프구가 분리되어 배양액에 현탁되는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서의 현탁액에, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장이 투입되어 배양되는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서의 현탁액에 새로운 배지가 투입되어 현탁된 이후, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장이 투입되어 배양되는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서의 현탁액에 새로운 배지가 투입되어 현탁된 이후, anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체가 제외된 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체 및 혈장이 투입되어 배양되는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서의 현탁액에 새로운 배지가 투입되어 현탁된 이후, anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체가 제외된 IL-2 및 혈장만이 투입되어 배양되는 단계를 포함하는 항결핵 NK세포 대량 증식방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장은 배양 시작 당일에 투입되며,
    상기 (c) 단계에서, IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체, anti-NKp44 항체, anti-NKp46 항체 및 혈장은 배양 2일차에 투입되는 항결핵 NK세포 대량 증식방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서, anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체가 제외된 IL-2, IL-15, anti-CD56 항체, anti-CD16 항체 및 혈장은 배양 5일차에 투입되며,
    상기 (e) 단계에서, anti-NKp44 항체 및 anti-NKp46 항체가 제외된 IL-2 및 혈장은 배양 7일차에 투입되는 항결핵 NK세포 대량 증식방법.
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