CN112725274A - 一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞生物学技术领域，更具体涉及一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法。包括：步骤一：间充质干细胞和外周血单个核细胞共培养；步骤二：固定破膜染色和检测。本发明提供一种检测方法，通过使用间充质干细胞和外周单个核细胞共培养，促进淋巴细胞增殖分化，从而促进间充质干细胞抑制作用的体现，提高抑制效果；对共培养得到的PBMC细胞进行刺激阻断，从而促进因子分泌，同时加入抑制及将因子阻断，来进行检测，从而进一步促进PBMC细胞中Th1和Th17的表达，提高检测得到的Th1和Th17的表达，提高进一步体现抑制效果。

Description

一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法

技术领域

本发明涉及干细胞生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类多能干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，可以在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉和脐带等多种组织中分离，具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质、神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞和心肌细胞等多向分化的潜能。具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

间充质干细胞不仅能促进损伤组织的再生与修复，还拥有良好的免疫调节能力，此外还可以作为基因治疗的载体。制备间充质干细胞的方法种类繁多，例如组织块贴壁培养法、脐带匀浆胶原酶消化法与改良胶原酶消化法等，但是目前的研究大多着眼于间充质干细胞的临床治疗应用，并不存在一个良好的评价机制来鉴定诸多制备方法制备得到的间充质干细胞免疫调节能力的好坏。

CN201811507077.2提供间充质干细胞免疫调节能力的检测方法，将原始样本与待评价的间充质干细胞进行共培养，通过检测淋巴细胞亚群的比例变化量，来评价间充质干细胞的抑制作用，从而对间充质干细胞的免疫调节能力进行评价，但是在间充质干细胞体外抑制T淋巴细胞亚群Th1和Th17检测中，存在抑制率低、效果不明显、重复性差等特点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，包括：

步骤一：间充质干细胞和外周血单个核细胞共培养；

步骤二：固定破膜染色和检测。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤一包括：将间充干细胞和外周血单个核细胞混合，加入抗体培养后，离心，加入含有刺激剂的培养基刺激细胞后，加入抑制剂培养、离心，得到的细胞沉淀洗涤后，用平衡盐溶液重悬，得到重悬溶液。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤一中，间充质干细胞和外周血单个核细胞的细胞数比为1：(5～15)。

作为本发明一种优选的技术方案，所述抗体包括anti-CD3和anti-CD28。

作为本发明一种优选的技术方案，所述anti-CD3的浓度为3～7μg/mL，所述anti-CD28的浓度为3～7μg/mL。

作为本发明一种优选的技术方案，所述刺激剂包括PMA和Ionomycin。

作为本发明一种优选的技术方案，所述含有刺激剂的培养基中，PMA的浓度为40～60ng/mL，Ionomycin的浓度为0.8～1.5μg/mL。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤二包括：将步骤一得到的重悬溶液中细胞用固定剂、破膜剂和染色抗体处理后，孵育、洗涤，去除上清液后，加入重悬溶液检测。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤二包括：

将步骤一得到的重悬溶液细胞依次用固定剂、破膜剂和染色抗体处理后，孵育、洗涤，去除上清液后，加入重悬溶液检测。

本发明第二个方面提供了一种所述的

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

(1)本发明提供一种检测方法，通过使用间充质干细胞和外周单个核细胞共培养，促进淋巴细胞增殖分化，从而促进间充质干细胞抑制作用的体现，提高抑制效果；

(2)对共培养得到的PBMC细胞进行刺激阻断，从而促进因子分泌，同时加入抑制及将因子阻断，来进行检测，从而进一步促进PBMC细胞中Th1和Th17的表达，提高检测得到的Th1和Th17的表达，提高进一步体现抑制效果；

(3)对重悬溶液中细胞进行处理，使得细胞固定破裂，来进行染色抗体染色，从而进行Th1和Th17的检测，通过选择合适的固定破裂方法，可提高检测结果的可重复性，提高抑制效果的表达。

(4)使用本发明提供的方法，有利于提高抑制率检测的效果，更准确说明间充质干细胞对T细胞亚群中Th1和Th17的抑制作用，来充分考察间充质干细胞抑制炎症的能力。

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。

此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。

以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。

本发明第一个方面提供了一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，包括：

步骤一：间充质干细胞和外周血单个核细胞共培养；

步骤二：固定破膜染色和检测。

步骤一

间充质干细胞MSC是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。本发明不对间充质干细胞的来源做具体限定，可来自脐带、脂肪、胎盘、骨髓等，优选位脐带。

为了避免MSC培养过度增殖，本发明在MSC培养过程中会进行去增殖处理，本发明去增殖处理的方法为本领域常用的方法，不做具体限定，在一种实时方式中，所述间充质干细胞的培养过程包括：

(1)MSC细胞接种：取MSC细胞悬液，400g离心5min，去上清，加入完全培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×10⁵/mL；将调整后的细胞悬液接种于24孔培养板中，每孔500μl，共接种2孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO₂浓度设置为：5.0％，温度设置为：37.0℃)，培养20～24h；

(2)MSC去增殖处理：MSC细胞培养20～24h后，镜下观察细胞贴壁情况；吸弃各孔培养基，每孔加入500μl含10μg/mL丝裂霉素C的完全培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO₂浓度设置为：5.0％，温度设置为：37.0℃)，孵育2h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1ml PBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1ml完全培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO₂浓度设置为：5.0％，温度设置为：37.0℃)中。

基础培养基添加血清、抗生素等物质后，叫完全培养基，也叫(血清)细胞培养基。基础培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需添加天然培养基，常用的是牛血清，因为牛血清中含有促细胞增殖的各种生长因子和其他多种有利于细胞生存的物质，本发明不对完全培养基做具体限定，为本领域熟知的完全培养基，可列举的有，广州铂晋生物科技有限公司的间充质干细胞完全培养基，10％终浓度牛血清(购自四季青)的1640培养基(购自GibCO)。

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。其比重为1.070左右，淋巴细胞来源于造血干细胞(hemopoietic stem cell，HSC)。造血干细胞可分化成多能前体细胞(multipotentprogenitor cell，MPC)，继而分化为淋巴样干细胞和髓样干细胞。淋巴样干细胞可继续发育为成熟的T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等。所述外周血单个核细胞可自制或购买，当购买时，一般为经过冻存处理的PBMC，需要经过复苏。本发明不对冻存PBMC的复苏方法做具体限定，为本领域熟知的复苏方法，在一种实施方式中，所述冻存PBMC的复苏方法包括：PBMC冻存管放入37.0℃水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化(约2min)，将冻存细胞转移至装有适量完全培养基的15ml离心管中，500g离心5min。弃去上清，加入适量体积的PBS重悬PBMC并计数。

在一种实施方式中，本发明所述步骤一包括：将间充干细胞和外周血单个核细胞混合，加入抗体培养后，离心，加入含有刺激剂的培养基刺激细胞后，加入抑制剂培养、离心，得到的细胞沉淀洗涤后，用平衡盐溶液重悬，得到重悬溶液。

优选地，本发明所述步骤一中，间充质干细胞和外周血单个核细胞的细胞数比为1：(5～15)，可列举的有，1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15，优选地为1：10。

申请人通过采用抗CD3和抗CD28抗体共同进行活化，其中抗CD3抗体可与T细胞表面的T细胞受体(TCR)结合并构成TCR－CD3复合体，从而提供了T细胞活化的第1信号；而抗原提呈细胞或抗CD28抗体的协同刺激则构成了第2信号，并进而刺激T细胞充分活化、增殖，从而促进仪器测试得到，且有利于抑制率效果的表达，提高准确性和可重复性。更优选地，本发明所述抗体包括anti-CD3和anti-CD28。进一步优选地，本发明所述anti-CD3的浓度为3～7μg/mL，可列举的有，3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL、4.5μg/mL、5μg/mL、5.5μg/mL、6μg/mL、6.5μg/mL、7μg/mL，优选地为5μg/mL；所述anti-CD28的浓度为3～7μg/mL，可列举的有，3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL、4.5μg/mL、5μg/mL、5.5μg/mL、6μg/mL、6.5μg/mL、7μg/mL，优选地为5μg/mL。

anti-CD3抗体是以CD3抗体为抗原的APC多克隆抗体，可以特异性结合CD3抗体。抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇(表位)和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。除两者分子构型高度互补外，抗原表位和抗体超变区必须密切接触，才有足够的结合力。CD28(ClusterofDifferentiation28)是一种二硫键合的糖蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族，结构上属于单个IgV样胞外域，anti-CD28抗体是以CD28抗体为抗原的抗体。

若不添加刺激因子进行活化，Th1和Th17型细胞因子的分泌量很少，很难用仪器测得，从而影响测试的准确性和可重复性，为了更好比较MSC对T细胞内因子的抑制作用，申请人采用PMA+Ionomycin作为刺激原，使n0向Thl和n2细胞转化，并促进Th17的转化，增加细胞因子的分泌，从而能更好的提高抑制效果和准确性。更进一步优选地，本发明所述刺激剂包括PMA和Ionomycin。在一种优选的实施方式中，本发明所述含有刺激剂的培养基中，PMA的浓度为40～60ng/mL，可列举的有，40～60ng/mL、42ng/mL、44ng/mL、46ng/mL、48ng/mL、50ng/mL、52ng/mL、54ng/mL、56ng/mL、58ng/mL、60ng/mL，优选地为50ng/mL；Ionomycin的浓度为0.8～1.5μg/mL，可列举的有，0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.1μg/mL、1.2μg/mL、1.3μg/mL、1.4μg/mL、1.5μg/mL，优选地为1μg/mL。

PMA佛波肉荳蔻醋酸即Phorbol 12-myristate 13-acetate，一种佛波酯，二酰基甘油(DG)的一种类似物，可通过与蛋白激酶C(PKC)的C1区结合而使后者激活，产生类似于“双信使系统”的级联反应，信号通路研究中，可与PHA/Ionomycin联合使用刺激细胞产生细胞因子，以及与蛋白转运抑制剂如Monensin和Brefeldin A连用研究细胞因子在细胞内的滞留等。但申请人在研究时发现，当使用PMA和PHA共同作为刺激因子，或者PHA单独作用时测试得到的抑制率效果不好。

Ionomycin(离子霉素)，来源于链霉菌属Streptomyces COnglobatus的一种聚醚类抗生素，一种有效的选择性钙离子载体，把钙离子从水相转移到有机相。也能转运其它离子，亲和力相对较低(Ca2+＞Mg2+＞＞Sr2+＝Ba2+)。

本发明不对含刺激剂的培养基中的培养基做具体限定，为本领域常用的培养基，可列举的有，GibCO的DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F-12等，不做具体限定。

为将细胞因子阻断于细胞内，需要在刺激培养后添加抑制剂作为刺激阻断，本发明不对抑制剂做具体限定，可为BFA，BFA(Brefeldin A)是一种内酯抗生素，是蛋白质运输的特定抑制剂。Brefeldin A阻断分泌蛋白和膜蛋白从内质网向高尔基体的转运。Brefeldin A也是一种自噬(autophagy)和mitophagy抑制剂。在一种实施方式中，所述BFA的浓度为5～15μg/mL，可列举的为，5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL，优选地为10μg/mL。

为了说明添加MSC后对PBMC的抑制效果，本发明还设置了不添加MSC的阳性组作为对照。在一种更优选的实施方式中，本发明所述步骤一包括：

共培养组设置：将间充质干细胞和外周血单个核细胞以1：(5～15)的细胞数比混合，并添加终浓度为3～7μg/mL的anti-CD3和终浓度为3～7μg/mL的anti-CD28，作为共培养组；

阳性组设置：将外周血单个核细胞中添加终浓度为3～7μg/mL的anti-CD3和终浓度为3～7μg/mL的anti-CD28，作为阳性组；

刺激阻断：共培养组和阳性组分别培养4～6天后，离心，得到的细胞沉淀，加入含40～60ng/mL的PMA和0.8～1.5μg/mL的Ionomycin的培养基刺激细胞0.6～1.5h，然后加入5～15μg/mL的BFA，放入CO₂培养箱中继续孵育4～6h、离心5min，得到的细胞沉淀洗涤后，添加80～120μL平衡盐溶液重悬，得到重悬溶液。

平衡盐溶液是溶液中电解质含量与血浆内含量相仿的盐溶液称为平衡盐溶液，可列举的有，PBS、DPBS、Hanks液、BSS，优选地为PBS。

在一种进一步优选的实施方式中，本发明所述步骤一包括：

共培养组设置：将间充质干细胞和外周血单个核细胞以1：10的细胞数比混合，并添加终浓度为5μg/mL的anti-CD3和终浓度为5μg/mL的anti-CD28，作为共培养组；

阳性组设置：将外周血单个核细胞中添加终浓度为5μg/mL的anti-CD3和终浓度为5μg/mL的anti-CD28，作为阳性组；

刺激阻断：共培养组和阳性组分别培养5天后，500g离心，得到的细胞沉淀，加入含50ng/mL的PMA和1μg/mL的Ionomycin的培养基刺激细胞1h，然后加入10μg/mL的BFA，放入CO₂培养箱中继续孵育5h；每隔2h将聚集的细胞吹打分散均匀；500g离心5min，得到的细胞沉淀用2mL PBS的洗涤2次后洗涤后，添加100μL PBS重悬，得到重悬溶液。

间充质干细胞对Th1和Th17的抑制作用和培养体系、细胞类型、刺激因素和培养环境均有关系，且间充质干细胞本身分泌多种细胞因子，也会影响PBMC的分泌和转化，而申请人通过采用特定的MSC和PBMC的比例，并通过一定浓度的抗原和刺激原在特定培养基中进行培养，促进T细胞的增殖和Th1、Th17细胞的转化，可更进一步提高间充质干细胞对Th1和Th17抑制效果的表达，提高测定的准确性和可靠性。

步骤二

本发明培养制得的细胞需要经过固定破膜染色后才可以进行检测，目前的固定破膜染色根据固定剂、破膜剂和染色剂的不同，一般分为三种，第一种是先添加染色剂，后添加固定剂和破膜剂，第二种是先添加固定剂固定细胞，在添加破膜剂破膜，最后添加染色剂，最后一种是同时添加固定剂和破膜剂进行固定破膜，在添加染色剂，申请人在研究时发现，不同固定破膜方法对抑制效果的结果和可重复性也不同，很难标准化因而限制了流式细胞术胞内染色的应用。在一种实施方式中，本发明所述步骤二包括：将步骤一得到的重悬溶液中细胞用固定剂、破膜剂和染色抗体处理后，孵育、洗涤，去除上清液后，加入重悬溶液检测。

固定液、破膜剂用于细胞内细胞因子染色前对细胞膜的处理，固定液起稳定细胞膜、保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用；破膜剂使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞。用流式细胞仪检测细胞内抗原及DNA时，对待测细胞进行固定、破膜处理后，加入相应抗体或检测试剂，孵育一定时间即可上机分析。优选地，本发明所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛，优选地为甲醛；更优选地，本发明所述破膜剂包括甲醇、丙酮、皂素、吐温中的一种或多种，优选地为皂素。

皂素是一类结构较为复杂的成分，由皂苷和糖、糖醛酸或其他有机酸所组成。皂素广泛存在于植物界，在单子叶植物和双子叶植物中均有分布。

一般来说固定剂和破膜剂的成分来自于试剂盒的成分，其中固定剂和破膜剂中甲醛、皂素等成分的用量由选择的试剂盒确定，作为试剂盒的实例，可列举的有，杭州联科生物技术股份有限公司的试剂盒(货号70-GAS006/2)、联科生物的Human Th1/Th2/Th17staining kit人Th1/Th2/Th17染色试剂盒(目录号：70-KTH001-100)，包括固定破膜剂试剂A和固定破膜剂试剂B)、上海研卉生物科技有限公司的Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine(目录号：Kit 560485)，优选地为，杭州联科生物技术股份有限公司的试剂盒(货号70-GAS006/2)(试剂盒的固定剂包括甲醛，试剂盒的破膜剂包括皂素)。

更进一步优选地，本发明所述步骤二包括：将步骤一得到的重悬溶液细胞加入50～150μL固定剂固定10～20min后，加入2～4mL的平衡盐溶液，300～800g离心3～6min洗涤，得到的细胞沉淀涡旋2～10s后，加入50～150μL破膜剂，涡旋2～10s后，加入染色抗体，避光孵育15～25min、加入2～5mL平衡盐溶液，300～500g离心3～8min，得到的细胞沉淀加入250～350μL重悬溶液检测。

本发明检测方法为本领域熟知的流式细胞检测方法，不做具体限定，本发明检测的染色抗体根据选择的试剂盒具体确定，当选择杭州联科生物技术股份有限公司的试剂盒(货号70-GAS006/2)时，染色抗体为Hu CD4 FITC RPA-T4、Hu IFN-Gma PerCP-Cy5.5 B27、Hu IL-17A PE SCPL1362。

在一种优选的实施方式中，本发明所述步骤二包括：将步骤一得到的重悬溶液细胞加入100μL固定剂固定15min后，加入3mL的平衡盐溶液，500g离心4min洗涤，得到的细胞沉淀涡旋5s后，加入100μL破膜剂，涡旋5s后，加入染色抗体，避光孵育20min、加入3mL平衡盐溶液，400g离心5min，得到的细胞沉淀加入300μL重悬溶液检测。

本发明第二个方面提供一种如上所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法在检测间充质干细胞抑制淋巴细胞亚群的应用。

本发明提供的检测方法可测试间充质干细胞对淋巴细胞的抑制效果，通过检测间充质干细胞对Th1和Th17的抑制率来确定。Th1辅助细胞主要为对抗细胞内细菌及原虫的免疫反应，其主要为白介素12(IL-12)所驱动诱发，其主要的执行的细胞因子是伽马干扰素(IFN-γ)，其最重要的执行细胞为巨噬细胞(Macrophage)另外还有杀手CD8+T细胞、产生IgG的B细胞以及分泌IFNg的CD4+T细胞等、其主要的转录因子为STAT4另外还有T-bet等等。CD4+T细胞分泌的IFNg会活化巨噬细胞，使其能够吞噬并消化掉细胞内细菌及原虫，另外IFNg也会活化iNOS而放出NOx等自由基而直接杀死细胞内细菌及原虫，Th1免疫反应对应的是第四型自体免疫疾病(Type4 delayed type hypersensitivity)也就是过分的Th1激活将会导致巨噬细胞自体免疫疾病比如麻风病或结核菌素过分反应或第一型糖尿病等都属此类。

Th17辅助性T细胞17(T helper cell 17,)是一种新发现的能够分泌白介素17(interleukin 17,IL-17)的T细胞亚群，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。β转化生长因子(transforming growth factor b,TGF-β)、IL-6、IL-23和IL-21在Th17细胞的分化形成过程中起着积极的促进作用，而γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、IL-4、细胞因子信号传送阻抑蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3,Socs3)和IL-2则抑制它的分化。Th1表型为CD4+INF-γ+，Th17表型CD4+IL-17+。

实施例

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本例提供一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，包括：

(1)MSC细胞接种：取MSC细胞悬液，400g离心5min，去上清，加入完全培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×10⁵/mL；将调整后的细胞悬液接种于24孔培养板中，每孔500μl，共接种2孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO₂浓度设置为：5.0％，温度设置为：37.0℃)，培养20～24h；

(2)MSC去增殖处理：MSC细胞培养20～24h后，镜下观察细胞贴壁情况；吸弃各孔培养基，每孔加入500μl含10μg/mL丝裂霉素C的完全培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO₂浓度设置为：5.0％，温度设置为：37.0℃)，孵育2h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1ml PBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1ml完全培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO₂浓度设置为：5.0％，温度设置为：37.0℃)中；

(3)冻存PBMC的复苏方法：PBMC冻存管放入37.0℃水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化(约2min)，将冻存细胞转移至装有适量完全培养基的15ml离心管中，500g离心5min。弃去上清，加入适量体积的PBS重悬PBMC并计数；

(4)共培养组设置：将间充质干细胞和外周血单个核细胞以1：10的细胞数比混合，并添加终浓度为5μg/mL的anti-CD3和终浓度为5μg/mL的anti-CD28，作为共培养组；

阳性组设置：将外周血单个核细胞中添加终浓度为5μg/mL的anti-CD3和终浓度为5μg/mL的anti-CD28，作为阳性组；

刺激阻断：共培养组和阳性组分别培养5天后，500g离心，得到的细胞沉淀，加入含50ng/mL的PMA和1μg/mL的Ionomycin的培养基刺激细胞1h，然后加入10μg/mL的BFA，放入CO₂培养箱中继续孵育5h；每隔2h将聚集的细胞吹打分散均匀；500g离心5min，得到的细胞沉淀用2mL PBS的洗涤2次后洗涤后，添加100μL PBS重悬，得到重悬溶液；

(5)将重悬溶液细胞加入100μL固定剂固定15min后，加入3mL的平衡盐溶液，500g离心4min洗涤，得到的细胞沉淀涡旋5s后，加入100μL破膜剂，涡旋5s后，加入染色抗体，避光孵育20min、加入3mL平衡盐溶液，400g离心5min，得到的细胞沉淀加入300μL重悬溶液检测；

所述固定剂包括甲醛，所述破膜剂包括皂素，所述固定剂和破膜剂购自杭州联科生物技术股份有限公司的试剂盒(货号70-GAS006/2)，所述平衡盐溶液为PBS。

实施例2

本例提供一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述刺激阻断：共培养组和阳性组分别培养5天后，500g离心，得到的细胞沉淀，加入含1μg/mL的PHA的培养基刺激细胞1h，然后加入10μg/mL的BFA，放入CO₂培养箱中继续孵育5h；每隔2h将聚集的细胞吹打分散均匀；500g离心5min，得到的细胞沉淀用2mL PBS的洗涤2次后洗涤后，添加100μL PBS重悬，得到重悬溶液。

实施例3

本例提供一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述步骤(5)中，将重悬溶液细胞加入100μL固定剂和100μL破膜剂涡旋5s后，固定15min后，加入染色抗体，避光孵育20min、加入3mL平衡盐溶液，400g离心5min，得到的细胞沉淀加入300μL重悬溶液检测。

实施例4

本例提供一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述步骤(5)中，将重悬溶液细胞加入100μL固定剂固定15min后，加入3mL的平衡盐溶液，500g离心4min洗涤，得到的细胞沉淀涡旋5s后，加入100μL破膜剂，涡旋5s后，加入染色抗体，避光孵育20min、加入3mL平衡盐溶液，400g离心5min，得到的细胞沉淀加入300μL平衡盐溶液检测。

实施例5

本例提供一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述步骤(5)中，将重悬溶液细胞加入100μL固定剂固定15min后，加入3mL的平衡盐溶液，500g离心4min洗涤，得到的细胞沉淀涡旋5s后，加入100μL破膜剂，涡旋5s后，加入染色抗体，避光孵育20min、加入3mL平衡盐溶液，400g离心5min，得到的细胞沉淀加入300μL重悬溶液检测，所述固定剂包括甲醛，所述破膜剂包括皂素，所述固定剂和破膜剂分别为联科生物的Human Th1/Th2/Th17 staining kit人Th1/Th2/Th17染色试剂盒(目录号：70-KTH001-100)的固定破膜剂试剂A和固定破膜剂试剂B。

性能评价

1、抑制率：将实施例提供的检测方法使用贝克曼的DxFLEX流式细胞分析仪，得到Th1和Th17各亚群占比，抑制率＝(阳性组亚群占比-共培养组亚群占比)/阳性组亚群占比，其中实施例提供的检测方法的阳性组亚群占比、共培养组亚群占比和抑制率的结果见表1。

表1性能表征测试

2、重复性：使用实施例提供的检测方法分别进行十次测试，得到每次测试的抑制率，得到平均抑制率，其中变异度＝(十次测试中最高的抑制率-平均抑制率)/平均抑制率*100％，并进行评级，其中1级为变异度小于5％，2级位变异度大于等于5％，小于7％，3级为变异度大于等于7％，小于10％，4级为变异度大于等于10％，结果见表2。

表2性能表征测试

实施例	Th1	Th17
			1	1级	1级
2	2级	3级
			3	3级	4级
4	2级	2级
			5	2级	2级

由表1测试结果可知，本发明提供的检测方法可用于间充质干细胞体外抑制Th1和Th17的检测，可获得好的抑制效果和可靠性，有利于判断间充质干细胞的抑制效果。

前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其特征在于，包括：

步骤一：间充质干细胞和外周血单个核细胞共培养；

步骤二：固定破膜染色和检测。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其特征在于，所述步骤一包括：将间充干细胞和外周血单个核细胞混合，加入抗体培养后，离心，加入含有刺激剂的培养基刺激细胞后，加入抑制剂培养、离心，得到的细胞沉淀洗涤后，用平衡盐溶液重悬，得到重悬溶液。

3.根据权利要求2所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，间充质干细胞和外周血单个核细胞的细胞数比为1：(5～15)。

4.根据权利要求2所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其特征在于，所述抗体包括anti-CD3和anti-CD28。

5.根据权利要求4所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其特征在于，所述anti-CD3的浓度为3～7μg/mL，所述anti-CD28的浓度为3～7μg/mL。

6.根据权利要求2所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其特征在于，所述刺激剂包括PMA和Ionomycin。

7.根据权利要求6所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其特征在于，所述含有刺激剂的培养基中，PMA的浓度为40～60ng/mL，Ionomycin的浓度为0.8～1.5μg/mL。

8.根据权利要求2～7任意一项所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其特征在于，所述步骤二包括：将步骤一得到的重悬溶液中细胞用固定剂、破膜剂和染色抗体处理后，孵育、洗涤，去除上清液后，加入重悬溶液检测。

9.根据权利要求8所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，其特征在于，所述步骤二包括：

将步骤一得到的重悬溶液细胞依次用固定剂、破膜剂和染色抗体处理后，孵育、洗涤，去除上清液后，加入重悬溶液检测。

10.一种根据权利要求1～9任意一项所述的间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法在检测间充质干细胞抑制淋巴细胞亚群的应用。