CN105018430A

CN105018430A - 一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法

Info

Publication number: CN105018430A
Application number: CN201510065393.9A
Authority: CN
Inventors: 张守全; 白银山; 冯美莹; 卫恒习; 李莉
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2015-02-06
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-02-06
Also published as: CN105018430B

Abstract

本发明公开了一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法，包括步骤：取长白小公猪的骨髓细胞，培养液培养20-28h后更换新鲜培养液，继续培养，传代至获得细胞形态均一的F3代的长白仔猪bMSCs；利用携带LargeT慢病毒液侵染F3代的长白仔猪bMSCs，细胞筛选，传代至得到稳定表达Egfp的细胞株；将稳定表达Egfp的细胞株，传代50代以上，经细胞生物学分析检测，获得长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系。本发明获得了能支持猪bMSCs稳定培养的系统，促使细胞体外快速稳定增殖，并维持原代的生物学特征，证明得到了永生的长白仔猪bMSCs，可以深入研究猪bMSCs生物学性质和应用于药物或疫苗研发。

Description

一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系建立用培养液及使用培养液建立长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的方法和应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多向分化的成体干细胞，它来源于中胚层，广泛分布在各个组织器官中。MSCs在不同的诱导条件下，可以生成脂肪、骨、软骨、肌肉、皮肤、血管、神经以及肝细胞等。此外，MSCs还表现出体外分离和培养容易、增殖和分化能力强、免疫原性低的特点，所以被认为是细胞治疗比较理想的细胞资源。研究证明MSCs膜表面存在表达(CD29、CD44、CD73(SH3/4)、CD90、CD105(SH2))等抗原，不表达造血干细胞的特异表面标记(CD45)及内皮细胞表面标志(CD31、CD34)等特征。

骨髓来源的间充质干细胞(bone MSCs，bMSCs)是MSCs特征的代表。不仅广泛在临床医学上研究，同时在猪业生产相关实验研究中也有重要价值。然而成体细胞在体外增殖能力是有限的，bMSCs在体外经历了一定时期增殖以后，也将进入一种生长停滞的状态，限制了体外大量扩增及其生物学性质研究。

目前市场上仍然缺乏可用的猪bMSCs细胞系，一定程度上也限制了研究的进程。猪作为畜牧业生产重要的饲养动物之一，同时也是人类医学研究最理想的动物模型，猪bMSCs系建立具有重要的科研价值。

长白猪是目前畜牧业生产中主要的猪品种之一，其生长性能，肉质品质一直是畜牧业研究的重点。而对于各个组织器官中都有分布的MSCs来说，对于维持机体稳定和各项生产指标息息相关，所以长白仔猪bMSCs建立对于猪业生产相关的试验研究具有重要意义。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系建立用的培养液、以及用该培养液建立长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的方法和永生系的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系建立用的培养液，所述培养液为：添加了12～18％FBS，50～60μMβ-巯基乙醇，0.8～1.2％ITS，0.8～1.2％L-谷氨酰胺，0.8～1.2％核苷酸，0.8～1.2％非必需氨基酸，0.8～1.2％必需氨基酸，45～55μg/mL维生素C，5～15ng/mL表皮生长因子，5～15ng/mL碱性成纤维生长因子和0.8～1.2％双抗的MEM培养基。所述核苷酸为几种核苷酸的混合物；所述非必须氨基酸为几种非必须氨基酸的混合物；所述必须氨基酸为几种必须氨基酸的混合物。

在其中一个实施例中，所述培养液为：添加了15％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1％非必需氨基酸，1％必需氨基酸，50μg/mL维生素C，10ng/mL表皮生长因子，10ng/mL碱性成纤维生长因子和1％双抗的MEM培养基。

本发明还提供了一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法，包括以下步骤：

1)、取长白小公猪的骨髓细胞，完全培养基贴壁培养20～28h后更换新鲜培养液，继续培养，传代至获得细胞形态均一的F3代的长白仔猪bMSCs；

2)、利用携带Egfp和Large T基因的慢病毒液侵染F3代的长白仔猪bMSCs，进行细胞筛选，传代至得到稳定表达Egfp的细胞株；

3)将稳定表达Egfp的细胞株，使用上述培养液传代50代以上，经细胞生物学分析检测，获得长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系。

在其中一个实施例中，步骤2)中所述传代的代数为7代。

在其中一个实施例中，步骤3)中所述细胞生物学检测为生长曲线绘制、膜表面抗原分析、细胞核型分析、特异性蛋白分析、成骨成脂潜能分析和致瘤性分析。

本发明还提供了上述建立方法建立的长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系。

本发明还提供了长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系在制备治疗猪疾病的药物或疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用慢病毒转基因方法，将Large T和Egfp基因稳定整合到长白仔猪bMSCs基因组内。在体外筛选大量的培养体系以后，最终获得了能支持猪bMSCs稳定培养的系统，促使细胞体外快速稳定增殖，并维持原代的生物学特征。此细胞系体外传代次数已超过60代，利用流式细胞术检测，证明该细胞系表达CD44的标记，不表达造血干细胞标记CD45；细胞周期处于分裂相的细胞比例达到30％以上，而坏死和凋亡的细胞数量低于5％；细胞核型正常，并且未显示有致瘤作用等特征的细胞系，符合建系标准，表达bMSCs的生物学标记，证明得到了永生的长白仔猪bMSCs。长白仔猪bMSCs系的建立可以深入研究猪bMSCs生物学性质和应用于药物或疫苗研发。

附图说明

图1是本发明实施例1的长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法流程图；

图2是本发明实施例1中分离培养猪骨髓间充质干细胞时对长白仔猪bMSCs的检测结果，其中：A：3d长白仔猪的股骨；B：少量贴壁的长白仔猪bMSCs；C：培养第3d的长白仔猪bMSCs；D：F2代的长白仔猪bMSCs；E：F3代的长白仔猪bMSCs；F：NANOG蛋白染色；G：Hochest33342细胞核染色；H：F和G叠加的结果；L、M和N：膜表面抗原检测；

图3是本发明实施例1中对F3代长白仔猪骨髓间充质干细胞多潜能性分析结果，其中，A：F3代长白仔猪bMSCs多能转录因子(Oct4，Nanog和Sox2)启动子甲基化差异区分析图；B、C和D：Oct4，Nanog和Sox2启动子甲基化区分析结果；E：诱导第3个周期后bMSCs；F：油红O染色结果；G：长白仔猪bMSCs诱导成骨细胞钙结节茜素红染色结果；H：诱导成骨细胞的对照组染色；

图4是本发明实施例1中慢病毒侵染F3代bMSCs的传代结果，其中，A、C、E和H：分别为F3、F7、F17和F57代长白仔猪骨髓间充质干细胞白光下的照片；B、D、F和H：为对应荧光下照片。

图5是本发明实施例1中对长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的生物学检测结果，其中，A和B：F52代pMSCs流式检测结果；C：F17代长白仔猪bMSCs细胞周期分析结果；D：F57代长白仔猪bMSCs细胞周期分析结果；E：截取F17、F32代转入Large T的长白仔猪bMSCs进行绘制生长曲线；F：F57代长白仔猪bMSCs凋亡分析；G：核型分析；H：致瘤性分析；

图6是本发明实施例1中对长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的分子表达检测图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来对本发明作进一步说明。

以下实施例中，所使用的抗体来源于：CD29鼠抗猪单克隆抗体购于BD公司；NANOG兔抗人和小鼠的单克隆抗体购于(cell signalingtechnology，CST)公司；抗人和小鼠的流式抗体CD44(PerCP-cy5.5)、CD45(APC)购于ebioscience公司；Alexa Fluor 568荧光标记羊抗兔二抗，FITC荧光标记羊抗鼠二抗购于Invitrogen公司；Hoechst 33342染细胞核试剂购于Molecular Probes公司，核苷酸购于Millipore公司、非必须氨基酸和必须氨基酸购于GIBICO公司，其他未做说明的试剂均来源于市售。

实施例1

请参阅图1，为本发明的一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法的路线图，包括以下具体步骤：

1、猪骨髓间充质干细胞分离培养检测

1)取3日龄长白雄性仔猪的股骨(如图2A)和胫骨，浸泡到75％的乙醇中消毒和脱脂；

2)用骨钳去掉两端，仅保留股骨体，用20mL一次性注射器注射器吸取含有20U/mL肝素钠的无菌的PBS液后冲出骨髓细胞；

3)收集冲洗后的液体，混匀后，402g离心3min；

4)弃去上清，用新的PBS液重悬，过500目细胞筛，去除骨碎片和凝血块等；

5)收集液体，按1∶1比例加到事先准备好的无菌淋巴分离液中；

6)小心不能将液体混匀，以402g离心力离心15min；

7)离心后吸取中间层细胞，里面含有骨髓细胞和淋巴细胞，红细胞因密度大而离心到离心管底而被去除；

8)加入DMEM洗涤并计数，用完全培养液接种到培养皿内培养，细胞密度保持10⁴～10⁵个/mL；

9)接种24h后可见细胞贴壁(如图2B)。未贴壁的细胞及粘附于贴壁细胞之上的杂细胞在换液的过程中逐渐被清除。

10)当细胞80％～90％汇合(如图2C)后，传代培养，传到F2代(如图2D)后大量冻存备用，F3代(如图2E)细胞形态均一，呈梭形、三角形和多边形且折光性强，生长状态好。F3代免疫荧光检测显示bMSCs表达多能因子NANOG(如图2F-H)；流式细胞分析，显示bMSCs膜表面大量存在CD29和CD44抗原，但不存在CD45(如图2L-N)。证明了通过这种方法获取了高纯度的F3代bMSCs。

2、F3代长白仔猪骨髓间充质干细胞多潜能性分析

Oct4、Sox2和Nanog是干细胞多潜能性的重要因子，分析核心多能因子启动子甲基化情况，对于其基因表达提供直接证据。结果显示：在长白仔猪F3代bMSCs的Oct4启动子处于高度甲基化状态，高达57.84％(如图3A)；而Sox2 99.28％和Nanog 60％处于非甲基化状态(如图3B和3C)，和预期RT-PCR结果数据一致，数据可靠(如图3D)。

F3代长白仔猪bMSCs进行诱导脂肪和成骨的分化潜能的检测。在三个周期的诱导以后，有大量的脂肪滴出现(如图3E)；油红O染色呈阳性(如图3F)；而诱导成骨实验中，茜素红对诱导成骨细胞的钙结节染色，结果也呈阳性(如图3G)，而对照组不着色(如图3H)，因此，证明了分离培养的细胞是具有分化潜能的长白仔猪bMSCs。

3、慢病毒侵染步骤1的F3代bMSCs

利用携带Egfp和Large T基因的慢病毒液侵染F3代的长白仔猪bMSCs，经过两次病毒侵染以后，细胞呈现出了90％以上的阳性感染(如图4A和4B)；随着细胞筛选，到F7代时绝大部分细胞表达绿色荧光蛋白Egfp(如图4C和4D)；F17和F57代细胞维持Egfp稳定表达(如图4E、F、G和H)。

4、将稳定表达Egfp的细胞株，传代50代以上，获得长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系；传代所使用的培养体系为：加了15％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1％非必需氨基酸，1％必需氨基酸，50μg/mL维生素C，10ng/mL表皮生长因子，10ng/mL碱性成纤维生长因子和1％双抗的MEM培养基。

5、长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的生物学检测

长白仔猪bMSCs转入Large T基因以后获得了永生，保持了原有的生物学特征，体外快速增殖。具体表现在：维持表达膜表面抗原CD44，不表达造血干细胞表面抗原CD45(如图5A和B)，细胞在体外快速增殖，表现在处于细胞周期分裂项的细胞比例大大增加(如图5C和D)，而且细胞生长曲线也显示细胞增殖能力增强(如图5E)；并且发生凋亡的细胞比例低于5％(如图5F)，染色体数目正常(2n＝38)(如图5G)，在注射裸鼠未出现有畸胎瘤(如图5H)。而原代细胞在F5代以后增殖表现缓慢，无法很好维持F3代形态特征，这些结果都证明获得了特征的长白仔猪bMSCs永生系。

6、长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系分子表达检测

F3代长白仔猪bMSCs转入Large T基因以后，体外大量增殖，传代次数超过60代，细胞建系成功。

目前还没有特异的MSCs分子标记，本实施例通过RT-PCR，利用表1所示的引物对，对多能因子(Oct4、Nanog、c-Myc、Klf4、Esg1、Sall4、Rex1和Prdm14)和生殖因子(Fragilis、Blimp1、Etv5、Bcl6b、Taf4b、Pcna、Zfp148、Sohlh2、Dazl和Stra8)在原代F3代长白仔猪bMSCs和转入Large T F60代bMSCs分子表达模式进行了PCR扩增，20μL PCR扩增体系中包含：PreMix(TAKARA)10μL，Primer F 0.4μL，Primer R 0.4μL，cDNA模板4μL，ddH₂O 5.2μL。在PCR仪内95℃变性3min后，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，循环30次以后72℃再延伸10min，降低4℃后进行电泳检测。

表1猪基因(sus scrofa)RT-PCR引物信息

注：所有引物退火温度均设计在60℃(除基因组启动子扩增引物外)

对扩增结果进行分析，如图6结果所示，建立的永生系和原代F3代细胞对应表达表1的这些基因。证明了建立的永生系保持了原代细胞基因表达特征。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系建立用的培养液，其特征在于，所述培养液为：添加了12～18％FBS，50～60μMβ-巯基乙醇，0.8～1.2％ITS，0.8～1.2％L-谷氨酰胺，0.8～1.2％核苷酸，0.8～1.2％非必需氨基酸，0.8～1.2％必需氨基酸，45～55μg/mL维生素C，5～15ng/mL表皮生长因子，5～15ng/mL碱性成纤维生长因子和0.8～1.2％双抗的MEM培养基。

2.根据权利要求1所述的长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系建立用的培养液，其特征在于，所述培养液为：添加了15％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1％非必需氨基酸，1％必需氨基酸，50μg/mL维生素C，10ng/mL表皮生长因子，10ng/mL碱性成纤维生长因子和1％双抗的MEM培养基。

3.一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)、利用携带Egfp和Large T基因的慢病毒液侵染F3代的长白仔猪bMSCs，细胞筛选，传代至得到稳定表达Egfp的细胞株；

3)将稳定表达Egfp的细胞株，使用权利要求1或2所述的培养液传代50代以上，经细胞生物学分析检测，获得长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系。

4.根据权利要求3所述的长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法，其特征在于，步骤2)中所述传代的代数为7代。

5.根据权利要求3所述的长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法，其特征在于，步骤3)中所述细胞生物学检测为生长曲线绘制、膜表面抗原分析、细胞核型分析、特异性蛋白分析、成骨成脂潜能分析和致瘤性分析。

6.权利要求1～5任一项所述的建立方法建立的长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系。

7.权利要求6所述的长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系在制备治疗猪疾病的药物或疫苗中的应用。