CN101555487A - 用于骨质疏松症的rna干扰载体及大鼠骨髓间质干细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于骨质疏松症的RNA干扰载体及大鼠骨髓间质干细胞。本发明所述的RNA干扰载体是在基于慢病毒的短链发夹RNA表达的骨架质粒中，引入以过氧化物酶体增殖子激活受体γ即PPARγ为作用靶点的可表达出短链发夹RNA即shRNA的DNA片段，构建为慢病毒表达载体；所构建的RNA干扰载体可表达针对PPARγ的特异性短链发夹RNA，从而下调PPARγ的表达。本发明还提供了用上述的RNA干扰载体转染的大鼠骨髓间质干细胞。本发明不仅提供了制备治疗骨质疏松症药物的新途径，还可为其它干细胞源性的细胞治疗和组织工程化产品的开发提供一个良好的实验平台。

Description

用于骨质疏松症的RNA干扰载体及大鼠骨髓间质干细胞

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种下调PPARγ表达的shRNA慢病毒表达载体以及将该载体转入大鼠骨髓间质干细胞后形成的基因修饰的骨髓间质干细胞。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis)是以骨量减少，骨组织显微结构退化为特征，从而导致骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身性骨代谢异常疾病。引起骨质疏松的原因很多，例如年龄的增加、长期使用糖皮质激素等，目前尚无理想的治疗方法。随着人均寿命的延长，骨质疏松症的发病率增加所造成的危害日趋严重，寻找有效的治疗方法迫在眉睫。

骨髓中除了造血系统外，还含有骨髓基质成分，主要包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌肉细胞等。成骨细胞的主要作用是合成和矿物化细胞外基质，脂肪占了正常骨髓空间的50％，它可以为骨髓中其它细胞的分化和发挥功能提供必需的能量，随着年龄的增长，骨髓中的脂肪细胞逐渐增加，最多可占骨髓的90％。临床研究发现，增龄、卵巢切除、糖皮质激素等原因引起的骨质疏松均存在脂肪组织增加和骨质减少的现象。

众所周知，骨髓腔中的成骨细胞与脂肪细胞均来源于骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)，MSC分化方向的改变，致使成骨细胞减少，脂肪细胞增加可能是骨质疏松的发病原因之一。

本发明人的研究发现，MSC在不同诱导条件下可向成骨细胞或脂肪细胞分化，调控信号传导途径可逆转MSC向成骨细胞或脂肪细胞的分化命运(张丽蓉，项鹏，李树浓等。PD98059对人骨髓间质干细胞分化为成骨细胞的影响。中国病理生理杂志，2002，18(8)：896-899)。分化方向的不同归根结底是通过胞内的信号传导途径激活的一系列不同的转录因子来实现，其中与成骨和成脂相关的转录因子就是过氧化物酶体增殖子激活受体γ(PPARγ)。

过氧化物酶体增殖子激活受体γ(peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPARγ)是核激素受体超家族成员，它与胞内配体结合后起转录因子作用。PPARγ2亚型在白色和褐色脂肪组织中高度表达并在脂肪细胞的分化中起重要的调控作用，研究发现，PPARγ2对骨髓间质干细胞的分化方向起关键的调控作用，在成骨与成脂过程中起到分子开关的作用。骨髓腔中的成骨细胞和脂肪细胞均来源于MSC，且数量存在此消彼长的关系，PPARγ介导MSC成脂分化因而可直接影响成骨细胞的分化，这可能是骨质疏松时骨髓中脂肪细胞与成骨细胞比例失调的一个原因。

作为成骨细胞和脂肪细胞的前体细胞，MSC具有取材方便、扩增迅速、低免疫原性、选择性归巢回骨髓、易于外源基因转染与表达等特点，因此选择它作为骨质疏松症的细胞治疗或基因治疗的靶细胞具有得天独厚的条件。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于骨质疏松症的RNA干扰载体。

针对MSC具有向脂肪细胞和成骨细胞双向分化的特点以及PPARγ在成骨与成脂分化过程中的关键作用，如果能够调控MSC内PPARγ的表达(抑制PPARγ的表达)，则可促进MSC向成骨方向分化，抑制其向脂肪细胞分化。本发明采用RNA干扰技术来实现这一目的。RNA干扰技术是通过小的干扰RNA片段以序列特异的方式下调基因的表达。

本发明所述的一种用于骨质疏松症的RNA干扰载体，其特征在于：在基于慢病毒的短链发夹RNA表达的骨架质粒中，引入以过氧化物酶体增殖子激活受体γ即PPAR γ为作用靶点的可表达出短链发夹RNA即shRNA的DNA片段，构建为慢病毒表达载体(lentiviral expression vector)；该质粒含有U6启动子，该启动子是DNA依赖的RNA聚合酶，通过XhoI和HpaI两个酶切位点在U6启动子后引入可表达出短链发夹RNA的DNA片段，该DNA片段的双链序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，以便在U6启动子作用下表达短链发夹RNA；并且，在插入DNA片段的下游是CMV(巨细胞病毒)启动子控制的GFP(绿色荧光蛋白)基因，由于短链发夹RNA与GFP共表达，以致可通过检测GFP的表达以方便观察短链发夹RNA表达的情况；所构建的RNA干扰载体可表达针对PPARγ的特异性短链发夹RNA，从而下调PPARγ的表达。

本发明还提供了用上述的RNA干扰载体转染的大鼠骨髓间质干细胞。

本发明所优选的基于慢病毒的短链发夹RNA表达的骨架质粒是从Rubinson DA处获得PLL3.7质粒(Rubinson DA，Dillon CP，Kwiatkowski AV，et al.A lentivirus-based system to functionally silence genes in primarymammalian cells，stem cells and transgenic mice by RNA interference.NatGenet.2003，33(3)：401-6.)。也可以选用同类的其他慢病毒表达质粒。

本发明选择影响MSC向成骨细胞与脂肪细胞分化的关键转录因子PPARγ为作用靶点，体外构建PPARγ的RNA干扰载体，转入MSC中，观察抑制了PPARγ表达对MSC向成骨细胞与脂肪细胞分化的影响，本发明不仅提供了制备治疗骨质疏松症药物的新途径，还可为其它干细胞源性的细胞治疗和组织工程化产品的开发提供一个良好的实验平台，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为大鼠MSC成骨诱导第29天茜素红S染色的显微镜图(×100)。镜下可见散在大量橘红色的钙结节，为茜素红S与钙盐形成的橘红色复合物，显示大量的钙沉积。

图2为成骨诱导第14天碱性磷酸酶染色的显微镜图(×100)。显示大量紫黑色颗粒，提示碱性磷酸酶活性为强阳性。

图3为大鼠MSC成骨诱导第14天RT-PCR检测成骨相关基因表达的图。显示大鼠MSC分化为成骨细胞的相关基因osteocalcin(骨钙素)表达阳性。

图4为大鼠MSC成脂诱导第19天油红O染色的显微镜图(×200)。镜下可见细胞内出现大量的脂肪滴。

图5为大鼠MSC成脂诱导第8天RT-PCR检测成脂相关基因表达的图。在成脂诱导的第8天，抽提对照组和诱导组的RNA，用半定量RT-PCR的方法检测LPL、aP₂、PPARγ2等脂肪特异性基因的表达，显示MSC定向诱导成脂过程中脂肪特异性基因的表达增高。

图6为基于慢病毒(lentiviral-based)RNAi骨架质粒PLL3.7质粒的图谱。

图7为构建完成的PPARγ扰质粒的示意图。

图8为构建的质粒酶切初步鉴定图

图9为利用293FT细胞包装病毒的显微镜图(×40)。镜下可见在产生的病毒作用下，293FT细胞发生细胞融合等改变

图10为利用293FT细胞包装病毒的荧光显微镜图(×40)。镜下可见CMV启动子驱动的GFP表达(绿色荧光)，显示慢病毒包装成功

图11为病毒转染大鼠MSC荧光显微镜图(×40)。镜下可见大鼠MSC内CMV启动子驱动的GFP表达(绿色荧光)。

图12为检测成功转染的大鼠MSC的PPARγ基因表达的图。显示PPARγ的表达抑制。

图13为携带PPARγshRNA慢病毒表达载体的MSC成脂诱导第19天油红O染色的显微镜图(下×200)和数码相机拍照(上)。结果显示成脂分化受到抑制，分化的脂肪细胞很少。

图14为携带PPARγshRNA慢病毒表达载体的MSC成骨诱导第14天RT-PCR检测成骨相关基因表达的图。显示成骨相关基因osteocalcin(骨钙素)表达增强。

图15为携带PPARγshRNA慢病毒表达载体的MSC成骨诱导第29天Vonkossa染色的显微镜图(下×100)和数码相机拍照(上)。显示钙沉积增多，提示分化为成骨细胞的能力增强。

图16为携带PPARγshRNA慢病毒表达载体的MSC成骨诱导第14天碱性磷酸酶染色的图(数码相机拍照)。可见紫黑色明显加深，提示活性增强。

具体实施方式

实施例一：下调过氧化物酶体增殖子激活受体γ(PPARγ)表达的shRNA慢病毒表达载体的构建

1、大鼠MSC的分离、培养、扩增、鉴定

MSC的分离、培养、扩增：成年大鼠股骨冲出骨髓，充分混匀，离心，收集沉淀，再用密度为1.083的Percoll分离液，收集单核细胞层，含10％FCS低糖DMEM培养5-7天，更换培养液，以后每4天换液一次。细胞80％融合后，0.25％胰酶消化，传代。

大鼠MSC鉴定：流式细胞仪鉴定细胞表面标志抗原，主要包括CD29、CD44、CD45(Pharmigen)，其中CD29、CD44为阳性，CD45为阴性。2、建立体外定向诱导大鼠MSC分化为成骨细胞的模型

成骨诱导液为低糖DMEM(含10％FCS)加入维生素C、β-甘油磷酸钠、地塞米松，3-4天更换一次诱导液，诱导4-5周。

BCIP/NBT方法鉴定碱性磷酸酶活性；茜素红S法或von kossa法检测钙沉积；RT-PCR检测osteopontin(骨桥素)、osteocalcin(骨钙素)等成骨细胞标志物的表达。图1为加入成骨诱导剂29天大鼠MSC形态呈多角形变化，出现钙沉积。用茜素红S染色，可见散在大量橘红色的钙结节，为茜素红S与钙盐形成的橘红色复合物，显示大量的钙沉积，MSC分化为成骨细胞。在成骨诱导培养的第14天，碱性磷酸酶活性与对照组相比，为强阳性，镜下见细胞密集区出现紫黑色颗粒(见图2)，图3显示成骨诱导第14天RT-PCR检测成骨相关基因osteocalcin的表达呈强阳性。这些结果均提示MSC在体外成功诱导分化为成骨细胞。

3、建立体外定向诱导MSC分化为脂肪细胞的模型

成脂诱导液为含胰岛素、地塞米松、IBMX的高糖DMEM，诱导时间为2-3周，3-4天更换一次诱导液。

油红O染色鉴定脂肪细胞的形成，RT-PCR检测PPARγ、LPL、aP2等脂肪细胞相关基因的表达。图4为诱导19天油红O染色显示细胞内出现大量的脂肪滴，MSC分化为脂肪细胞。提示MSC在体外成功诱导分化为脂肪细胞。诱导第8天，抽提总RNA，做半定量的RT-PCR，结果显示LPL、aP₂、PPARY₂等脂肪特异性基因在成脂诱导之后表达明显增强(如图5)。

4、构建下调PPARγ表达的shRNA的慢病毒表达载体

本发明人实验室从Rubinson DA处获得PLL3.7质粒(Rubinson DA，DillonCP，Kwiatkowski AV，et al.A lentivirus-based system to fu nctionally silencegenes in primary mammalian cells，stem cells and transgenic mice by RNAinterference.Nat Genet.2003，33(3)：401-6.)，这个质粒是基于慢病毒的短链发夹RNA表达的骨架质粒，含有U6启动子，该启动子是DNA依赖的RNA聚合酶，因此可通过XhoI和HpaI两个酶切位点在U6启动子后引入可表达出短链发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)的DNA片段，这样可在U6启动子作用下表达短链发夹RNA，并且在其下游是CMV启动子控制的GFP基因。由于短链发夹RNA与GFP共表达，所以可通过检测GFP的表达以方便的观察短链发夹RNA表达的情况。

合成的PPARγ两个寡聚DNA序列：

5’-T

TTCAAGAGA

TTTTTTC-3’和

5’-TCGAGAAAAAA TCTCTTGAA

A-3’

其中的TTCAAGAGA和TCTCTTGAA序列可形成短链发夹RNA的发夹部分(loop)。

其中的

和

可形成互补的双链RNA，可特异与PPARγRNA的相应区域结合，发挥干扰作用。

质粒构建方法：将上述单链寡聚DNA序列100℃4分钟退火成双链寡聚DNA。短链发夹RNA的慢病毒表达载体骨架质粒PLL3.7(图6)，图7为构建完成的PPAR γ干扰质粒的示意图。用HpaI和Xho I双酶切后切胶回收。在T4DNA连接酶的作用下，将上述双链寡聚DNA片断插入HpaI和Xho I双酶切后的PLL3.7质粒中。将连接产物转化超级感受态细胞，转化产物涂布于含有氨苄青霉素的细菌培养板上，37℃培养12-16小时之后，挑取阳性克隆，经HpaI和Xho I酶切初步鉴定(如图8)，并经测序进一步鉴定本发明成功构建的短链发夹RNA慢病毒表达载体。

实施例二：下调PPARγ表达的大鼠骨髓间质干细胞的制备

1、病毒包装，收集：

按照invitrogen公司的慢病毒包装试剂盒(目录号K4950-00)说明书进行病毒包装。详细如下：293FT细胞(invitrogen公司产品，目录号R700-07)接种于直径100mm的细胞培养皿中，待细胞至95％融合时，换含新鲜的含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。用36μl的脂质体lipo-fectamin2000将3μg的PPARγshRNA慢病毒表达载体质粒和9μg的package mix质粒(包含VSVG、RSV-REV、pMDL g/p RRE，invitrogen慢病毒包装试剂盒中提供)转染入293FT细胞。二氧化碳细胞培养箱中孵育24小时，换10毫升完全培养基，48-72小时后，观察293FT细胞的改变和绿色荧光蛋白的表达情况，将293FT细胞的培养上清在高速冷冻离心机上3.000rpm、4℃离心30分钟，去除细胞碎片。离心之后取上清，分装后，-80℃保存。图9为利用293FT细胞包装病毒的结果，在产生的病毒作用下，293FT细胞发生细胞融合等改变。图10为利用293FT细胞包装病毒，可见CMV启动子驱动的GFP表达(绿色荧光)，显示慢病毒包装成功。

2、将收集的病毒颗粒上清转染MSC：

将收集的病毒颗粒以感染复数为5的条件对大鼠骨髓间质干细胞进行转染，通过流式细胞技术检测绿色荧光蛋白阳性细胞比例，将转染成功的MSC体外扩增，RT-PCR检测PPARγ的表达是否受到抑制。图11显示慢病毒成功转染大鼠MSC。RT-PCR检测PPARγ的表达受到抑制(如图12)。

3、下调PPARγ表达的大鼠MSC的成脂能力变化

按照体外定向诱导大鼠MSC分化为脂肪细胞的模型，体外定向诱导携带PPAR γshRNA慢病毒表达载体或对照组的MSC分化为脂肪细胞，诱导时间为2-3周，通过油红O染色等方法观察成脂分化能力的变化。图13结果显示用油红O染色，对照组细胞内可见大量的脂肪滴，大量脂肪细胞形成，而干扰组(携带PPAR γshRNA慢病毒表达载体的MSC)脂肪细胞形成很少，成脂分化能力受到抑制。

4、下调PPARγ表达的大鼠MSC的成骨能力变化

根据体外定向诱导为大鼠MSC分化为成骨细胞的模型，体外定向诱导携带PPARγshRNA慢病毒表达载体或对照组的MSC分化为成骨细胞，诱导4-5周。通过RT-PCR检测osteocalcin(骨钙素)等成骨相关基因的表达、碱性磷酸酶活性测定和钙沉积染色等方法，与对照组比较成骨分化能力的变化。图14显示干扰组诱导第14天成骨相关基因osteocalcin(骨钙素)表达增强。图15为成骨诱导29天，Vonkossa染色显示干扰组的MSC钙沉积增多，提示分化为成骨细胞的能力增强。图16为成骨诱导14天碱性磷酸酶活性检测，结果显示干扰组的MSC碱性磷酸酶活性明显增强，提示分化为成骨细胞的能力增强。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>广东药学院

<120>用于骨质疏松症的RNA干扰载体及大鼠骨髓间质干细胞

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>55

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

tgcccttcac tactgttgac ttcaagagag tcaacagtag tgaagggctt ttttc    55

<210>2

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

tcgagaaaaa agcccttcac tactgttgac tctcttgaag tcaacagtag tgaagggca    59

Claims (2)

1、一种用于骨质疏松症的RNA干扰载体，其特征在于：

在基于慢病毒的短链发夹RNA表达的骨架质粒中，引入以过氧化物酶体增殖子激活受体γ即PPARγ为作用靶点的可表达出短链发夹RNA即shRNA的DNA片段，构建为慢病毒表达载体(lentiviral expression vector)；

该质粒含有U6启动子，该启动子是DNA依赖的RNA聚合酶，通过Xhol和Hpal两个酶切位点在U6启动子后引入可表达出短链发夹RNA的DNA片段，该DNA片段的双链序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，以便在U6启动子作用下表达短链发夹RNA；

并且，在插入DNA片段的下游是CMV(巨细胞病毒)启动子控制的GFP(绿色荧光蛋白)基因，由于短链发夹RNA与GFP共表达，以致可通过检测GFP的表达以方便观察短链发夹RNA表达的情况；

所构建的RNA干扰载体可表达针对PPARγ的特异性短链发夹RNA，从而下调PPARγ的表达。

2、用如权利要求1所述的RNA干扰载体转染的大鼠骨髓间质干细胞。

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