CN111454947A - 一种间充质干细胞成骨分化诱导剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞成骨分化诱导剂及其制备方法，所述间充质干细胞成骨分化诱导剂，包括金纳米内核，及修饰在所述金纳米内核表面的诱导间充质干细胞成骨分化siRNA。本发明中诱导剂具有良好的生物相容性，无毒副作用，且结构和制备工序简单，能便捷、高效、精准携载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA，安全地诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞，同时实时监测细胞分化情况。

Description

一种间充质干细胞成骨分化诱导剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种间充质干细胞成骨分化诱导剂、运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体、及二者制备方法和应用。
背景技术
成骨细胞和成脂细胞是由一个共同的祖细胞；骨髓间质干细胞在不同的条件、体内精密的体液调节、细胞调节中维系两者分化、数量和活性的平衡，其向成骨与成脂细胞分化的平衡维系着髓内骨组织与脂肪组织量的平衡，一旦该平衡被打破，可以引起成骨细胞减少、活性降低或向脂肪细胞分化增多或活性增加的情况，导致骨质疏松的发生。因此，如何调控和诱导骨髓间充质干细胞的分化方向及平衡是治疗骨质疏松症的关键。通过诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化来治疗骨质疏松是一种非常有临床应用前景的治疗手段。
骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞。由于它具有多向分化的潜能，在一定诱导条件下可以向成骨、成软骨、成脂细胞等分化，并具有自我更新和增殖的特性，因此间充质干细胞(MSCs)成为基础医学和临床学组织器官损伤修复及再生领域研究的热点，但是目前还存在一些问题，如分化效率低、及非定向分化形成异质细胞，甚至异常分化成为肿瘤细胞。现有几种定向诱导MSCs分化为成骨细胞的方法，均是基于引入诱导因子诱导干细胞分化，但该类方法的操作繁复，诱导效率低，且价格昂贵，并可能引起机体不良反应。因此急需一种操作简单、诱导效率高且价格低廉的诱导因子诱导MSCs分化为成骨细胞。
21世纪初，研发人员发现siRNA可以参与RNA干扰(即RNAi现象)，以专一性的方式调节基因的表达。因此，siRNA具有成为诱导MSCs分化为成骨细胞的优良诱导因子的前景。小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)是一个长20到25个核苷酸的双股RNA。在生物学上有许多不同的用途，siRNA在细胞的多种生命活动包括发育、增值、分化、凋亡、代谢等发挥着重要作用，因此利用RNA干扰机制可以起到药物作用。和小分子药物相比，siRNA作为药物选择性会更好，能够特异性下调致病基因的表达，不影响细胞中正常基因表达；而且，通过合理的siRNA设计，理论上能够沉默细胞内的任何基因表达，这与传统的小分子药物相比更具有治疗潜力。因此，近年来，对于siRNA在控制分化方面的功能成为目前研究的热点。
但是，要实现向细胞内递送含诱导功能siRNA的诱导剂，传统的诱导剂常采用非病毒作为载体，导致诱导剂的转导效率低，目的基因只能实现瞬间表达，并且运送载体的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。因此，开发一种结构简单，能实现高效、安全、精准的向细胞内递送诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的间充质干细胞成骨分化诱导剂，将对促进间充质干细胞成骨分化的研究发展，及对骨质疏松症的医学基础研究和组织工程研究具有至关重要的作用。
发明内容
基于此，本发明提供一种间充质干细胞成骨分化诱导剂、运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA、及其制备方法和应用，所述间充质干细胞成骨分化诱能高效、安全、精准的在细胞内诱导间充质干细胞成骨分化。
本发明所述间充质干细胞成骨分化诱导剂，包括金纳米内核，及修饰在所述金纳米内核表面的诱导间充质干细胞成骨分化siRNA。
与现有技术相比，金纳米颗粒尺寸小且具有良好的生物相容性，无毒副作用，易于表面修饰，可用作纳米药物载体和荧光探针，广泛应用于生物医学研究中。本发明通过构建功能性金纳米内核，再在其表面修饰诱导间充质干细胞成骨分化siRNA；金纳米内核与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA通过静电吸附自组装，形成带正电的间充质干细胞成骨分化诱导剂。该间充质干细胞成骨分化诱导剂除了具有尺寸小、结构简单、生物相容性好、无毒副作用的优点外；最重要的是能便捷、高效、精准携载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA到相应的靶细胞；可以成为研究干细胞基础科学研究的有力工具，在骨疾病治疗中具有广阔的临床应用前景。
进一步，所述诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的序列包括正义链和反义链；
所述正义链为5′-GACAUUCCAUUCACAAGAA-3′；
所述反义链为5′-UUCUUGUGAAUGGAAUGUCTT-3′。
进一步，所述金纳米内核的表面还修饰有含FITC多肽段。
本发明所述间充质干细胞成骨分化诱导剂进入间充质干细胞的细胞质后，成骨细胞产生的MMP-13酶(即金属蛋白酶13酶)将金纳米内核表面的含FITC的多肽段(即酶响应多肽，EGPLGVRGK-FITC)进行酶切，实现了特异性剪切多肽，并释放出FITC荧光分子；FITC荧光分子远离金纳米内核后，发出荧光，从而达到了荧光实时监测间充质干细胞成骨分化情况的目的。本发明所述间充质干细胞成骨分化诱导剂不仅可以促进间充质干细胞成骨分化，还能对间充质干细胞的成骨分化情况进行实时监测。
本发明还提供了金纳米内核作为诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的应用。
与现有技术相比，将诱导间充质干细胞成骨分化siRNA修饰在金纳米内核表面，用以诱导间充质干细胞成骨分化。金纳米颗粒尺寸小且具有良好的生物相容性，无毒副作用，易于表面修饰，可用作纳米药物载体和荧光探针，广泛应用于生物医学研究中。本发明通过构建功能性金纳米内核，再与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA通过静电吸附自组装，形成带正电的间充质干细胞成骨分化诱导剂。该金纳米内核除了具有尺寸小、结构简单、生物相容性好、无毒副作用的优点外；最重要的是能便捷、高效、精准运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA到相应的靶细胞；可以成为研究干细胞基础科学研究的有力工具，在骨疾病治疗中具有广阔的临床应用前景。
本发明还提供了一种运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体，包括金纳米内核，及修饰在所述金纳米内核表面的含FITC的多肽段。
与现有技术相比，本发明通过构建功能性金纳米内核，再在其表面修饰一种连接荧光分子的MMP-13酶响应肽段——含FITC的多肽段，形成运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体。该运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体除了具有尺寸小、生物相容性好、无毒副作用的优点外，最重要的是能便捷、高效、精准运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA到相应的靶细胞。该运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体进入间充质干细胞的细胞质后，成骨细胞产生的MMP-13酶(即金属蛋白酶13酶)将金纳米内核表面的含FITC的多肽段(即酶响应多肽，EGPLGVRGK-FITC)进行酶切，实现了特异性剪切多肽，并释放出FITC荧光分子；FITC荧光分子远离金纳米内核后，发出荧光，从而达到了荧光实时监测间充质干细胞成骨分化情况的目的。本发明所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体可以成为研究干细胞基础科学研究的有力工具，在骨疾病治疗中具有广阔的临床应用前景。
进一步，所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的粒径为8-12nm。
进一步，所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体表面的Zeta电位为30～60mV。
进一步，所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的紫外-可见吸收峰位为500～550nm。
本发明还提供了一种间充质干细胞成骨分化诱导剂的制备方法，将Au-PEI与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA混合，获得间充质干细胞成骨分化诱导剂。
与现有技术相比，金纳米颗粒尺寸小且具有良好的生物相容性，无毒副作用，易于表面修饰，可用作纳米药物载体和荧光探针，广泛应用于生物医学研究中。本发明通过Au-PEI构建功能性金纳米内核，再在其表面修饰诱导间充质干细胞成骨分化siRNA；金纳米内核与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA通过静电吸附自组装，形成带正电的间充质干细胞成骨分化诱导剂。该间充质干细胞成骨分化诱导剂除了具有尺寸小、结构和制备简单、生物相容性好、无毒副作用的优点外；最重要的是能便捷、高效、精准携载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA到相应的靶细胞；可以成为研究干细胞基础科学研究的有力工具，在骨疾病治疗中具有广阔的临床应用前景。
进一步，在Au-PEI与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA混合之前，还包括步骤：将Au-PEI与含FITC的活性多肽溶液混合反应，再经离心、清洗后，得到运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体。
进一步，所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与所述诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的摩尔比为1:5～10。
本发明中间充质干细胞成骨分化诱导剂对siRNA携带能力的的凝胶电泳实验，可知，在运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的摩尔比为1:5～10时，运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体可以将诱导间充质干细胞成骨分化siRNA不会滞留在孔中，说明运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体可有效吸附诱导间充质干细胞成骨分化siRNA。
进一步，所述Au-PEI与所述含FITC的活性多肽溶液混合后，搅拌5～7h，再以10000～14000r/min的转速离心处理3～8min，除去上清后用去离子水清洗，得到运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体。
附图说明
图1为实施例2中所述间充质干细胞成骨分化诱导剂促进并实时监测人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机理图；
图2为实验1中运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的透射电镜图；
图3为实验1中运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的Zeta电位图；
图4为实验1中运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的紫外-可见吸收光谱图；
图5为实验1中Au-PEI、多肽、运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的红外光谱图；
图6为本发明中间充质干细胞成骨分化诱导剂对诱导间充质干细胞成骨分化siRNA携带能力的凝胶电泳图；
图7为本发明中间充质干细胞成骨分化诱导剂进入人骨髓间充质干细胞激光共聚焦显微镜图；
图8为本发明中人骨髓间充质干细胞的活性实验结果统计图；
图9为本发明中间充质干细胞成骨分化诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育7天后的RT-PCR实验分析结果统计图；
图10为本发明中间充质干细胞成骨分化诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育7天后的Western blot实验统计图；
图11为本发明中间充质干细胞成骨分化诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育1～7天后的激光共聚焦显微镜观察图；
图12为本发明中间充质干细胞成骨分化诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育1～7天后的细胞成骨分化染色图。
具体实施方式
实施例1
本发明通过对间充质干细胞成骨分化的生物机理特性进行研究，选取了内核体积小且生物毒性低的金纳米内核，来作为运载的诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体。
其中，所述金纳米内核来源于Au-PEI(聚乙烯亚胺-金纳米颗粒复合物)。通过将氯金酸溶液与聚乙烯亚胺(PEI)混合反应，并加热搅拌，再经离心、清洗后，得到Au-PEI。
在本发明中，将浓度为2～3mmol/L的氯金酸溶液与质量分数为3～8％PEI溶液，以体积比为10～15:1混合，在50～70℃下加热15～25min；再以6000～10000r/min的转速离心处理3～8min，除去上清后用去离子水清洗，得到Au-PEI颗粒物。
所述诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的序列包括正义链和反义链；
所述正义链为5′-GACAUUCCAUUCACAAGAA-3′；
所述反义链为5′-UUCUUGUGAAUGGAAUGUCTT-3′。
直接将Au-PEI颗粒物与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA进行混合，由于金纳米内核富含正电荷，能够吸附带负电的诱导间充质干细胞成骨分化siRNA，生成诱导间充质干细胞成骨分化siRNA修饰在金纳米内核表面的间充质干细胞成骨分化诱导剂。在金纳米内核表面修饰诱导间充质干细胞成骨分化siRNA时，诱导间充质干细胞成骨分化siRNA通过静电吸附在金纳米内核上，形成带正电的间充质干细胞成骨分化诱导剂，其可诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞。
实施例2
本发明进一步研究了在实施例1中所述间充质干细胞成骨分化诱导剂上加载显示物质，使其能够实时监测间充质干细胞成骨分化情况。本发明具体研究了一种连接荧光分子的MMP-13酶响应肽段——含FITC多肽段，用其作为诱导间充质干细胞成骨分化的实时监测显示的物质。成骨细胞产生的MMP-13酶(即金属蛋白酶13酶)将诱导剂表面的含FITC的多肽段进行酶切，实现了特异性剪切多肽，并释放出FITC荧光分子；FITC荧光分子远离金纳米内核后，发出荧光，从而达到促进并实时监测间充质干细胞成骨分化的目的。
当在间充质干细胞成骨分化诱导剂上加载含FITC多肽段时，需首先在金纳米内核表面修饰含FITC多肽段，形成含FITC多肽段的载体，其包括金纳米内核，及修饰在所述金纳米内核表面的含FITC多肽段。然后再在该含FITC多肽段的载体上修饰诱导间充质干细胞成骨分化siRNA，形成含FITC的多肽段的间充质干细胞成骨分化的诱导剂。
其具体的制备方法为：
步骤1：分别制备Au-PEI和含FITC的活性多肽溶液，并将其混合反应，再经离心、清洗后，得到运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体。
其中，制备含FITC的活性多肽溶液的步骤为：将含FITC的多肽段溶解，并加入EDC/NHS溶液中搅拌，得到含FITC的活性多肽溶液。在本发明中，具体将浓度为0.8～1.2mg/mL含FITC的多肽段溶液，加入0.8～1.2mg/mL的EDC/NHS溶液中，并在室温下搅拌15～25min，得到含FITC的活性多肽溶液。
具体的，所述Au-PEI与所述含FITC的活性多肽溶液混合后，搅拌5～7h，再以10000～14000r/min的转速离心处理3～8min，除去上清后用去离子水清洗，得到运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体。
所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的粒径为8-12nm；表面的Zeta电位为30～60mV；紫外-可见吸收峰位为500～550nm。
步骤2：将所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA混合，获得含FITC多肽段的间充质干细胞成骨分化的诱导剂。
作为优选，所述含FITC的多肽段的运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与所述诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的摩尔比为1：5～10。
本实施例2所述间充质干细胞成骨分化诱导剂促进并实时监测人骨髓间充质干细 胞成骨分化的作用机理如下：
请参照图1，图1为实施例2中所述间充质干细胞成骨分化诱导剂促进并实时监测人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机理图。由图1可知，本发明通过构建功能性金纳米内核，再在其表面修饰一种连接荧光分子的MMP-13酶响应肽段——即含FITC的多肽段；进一步，由于金纳米内核富含正电荷，能够吸附带负电的诱导间充质干细胞成骨分化siRNA，形成间充质干细胞成骨分化诱导剂。
所述间充质干细胞成骨分化诱导剂促进并实时监测人骨髓间充质干细胞成骨分化，主要通过以下两个步骤实现：
a)促进成骨分化：将所述间充质干细胞成骨分化诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育7天，以诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞；
b)实时监测：步骤a)获得的所述成骨细胞产生MMP-13酶，所述MMP-13酶将所述间充质干细胞成骨分化诱导剂表面的含FITC的多肽段进行酶切，并释放出FITC荧光分子，以实现荧光实时监测成骨分化情况。
该间充质干细胞成骨分化诱导剂可抑制骨髓间充质干细胞的成脂基因PPARγ的表达，使其基因沉默，成骨分化的负调控因子PPARγ的蛋白表达明显下降，而成骨分化的标志性基因BMP-2、Runx2基因及其蛋白表达明显上升，并诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞，促进间充质干细胞成骨分化；同时成骨细胞产生的MMP-13酶(即金属蛋白酶13酶)将诱导剂表面的含FITC的多肽段(即酶响应多肽，EGPLGVRGK-FITC)进行酶切，实现了特异性剪切多肽，并释放出FITC荧光分子；FITC荧光分子远离金纳米内核后，发出荧光，从而实现荧光实时监测间充质干细胞细胞成骨分化情况的目的。
以下通过具体实验，详细说明本发明中间充质干细胞成骨分化诱导剂、运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体、及二者制备方法和应用的技术方案。
实验1
将10mL、浓度为2.4mmol/L的氯金酸溶液与0.08mL、质量分数为5％的PEI溶液在锥形瓶中混合，用加热搅拌器加热至60℃；经搅拌20min后，溶液由金黄色变为酒红色；再以8000r/min的转速离心处理5min，除去上清后用去离子水离心重悬三次，以去除杂质，得到Au-PEI。
将EGPLGVRGK-FITC肽段(即MMP-13酶响应多肽)溶于去离子水制成浓度为1mg/mL的溶液，再加入1mg/mL的EDC/NHS溶液中，在室温下搅拌20min进行活化，得到含FITC的活性多肽溶液。
然后，将10mL所述Au-PEI与所述含FITC的活性多肽溶液在锥形瓶中搅拌6h，混合反应，再以12000r/min的转速离心处理5min，除去上清后用去离子水离心重悬三次，以去除多余的多肽，得到运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体。
最后，将运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的摩尔比为1:10，得到间充质干细胞成骨分化诱导剂。
请参照图2～图5，其中，图2为实验1中运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的透射电镜图，该图是取1mL运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体溶液在铜网上制样，并进行120kV透射电镜观察，获得的运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的透射电镜图；由图2可知，所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的粒径为10nm。
图3为实验1中运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的Zeta电位图，该图是取2mL运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体溶液，并测试其Zeta电位；图3可知，所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体表面的Zeta电位为50mV。
图4为实验1中运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的紫外-可见吸收光谱图，该图是取1mL运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体溶液，并测其紫外-可见吸收光谱；由图4可知，所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的紫外-可见吸收峰位为530nm。
图5为实验1中Au-PEI、含FITC多肽段、运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的红外光谱图，将2mg干燥后的运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与溴化钾混合后进行压片，用红外光谱检测1680cm-1处有峰，说明运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体已形成酰胺键(即-CO-NH-)，即含FITC多肽段成功连接到Au-PEI上。
实验2～3
本实验2～3与实验1的制备间充质干细胞成骨分化诱导剂的制备步骤相同，其区别在于各组分的物料配比和操作参数的不同。详见表1。
表1实验2～3与实验1中各组分的物料配比和操作参数一览表
Figure BDA0002398760620000091
实验1～3的性能对比分析
由实验1～3制备得到的运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体对应的性能如表2所示。
表2实验1～3制备得到的运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的性能对比情况
测试性能 实验2 实验3 实验1
粒径(nm) 8.2 11.9 10.1
表面的Zeta电位(mV) 31.6 58.8 50.3
紫外-可见吸收峰位(nm) 503 552 530
由表2可知，随着制备步骤中各组分的物料配比和操作参数的调整，所制备得到运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的粒径范围为8-12nm，表面的Zeta电位范围为30～60mV，及紫外-可见吸收峰位范围为500～550nm。所得到运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体具有良好的生物相容性，能精准运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA，并能实现安全地诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和实时监测细胞分化。
诱导剂对siRNA携带能力的凝胶电泳实验：
利用实施1制备的运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA以摩尔比分别为1:0、1:1、1:2、1:5、1:10、1:20混合，并获得6组间充质干细胞成骨分化诱导剂样品，同时对6组样品进行凝胶电泳实验。
请参照图6，图6为本发明中间充质干细胞成骨分化诱导剂对诱导间充质干细胞成骨分化siRNA携带能力的的凝胶电泳图，可知，在运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的摩尔比为1:5时，运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体可以将诱导间充质干细胞成骨分化siRNA完全滞留在孔中，说明在运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的摩尔比≥5时，运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体可有效吸附诱导间充质干细胞成骨分化siRNA。
诱导剂对人骨髓间充质干细胞的诱导实验：
利用实施1中运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA以摩尔比为1:10混合，得到间充质干细胞成骨分化诱导剂，对人骨髓间充质干细胞进行诱导实验。本实验是将3组人骨髓间充质干细胞消化培养在共聚焦皿中，密度为104/皿。。
请参照图7，图7为发明中诱导剂进入人骨髓间充质干细胞激光共聚焦显微镜图，其中，荧光染料DAPI激发波长为405nm，荧光素FITC激发波长为488nm。图7中分别为间充质干细胞成骨分化诱导剂进入人骨髓间充质干细胞0.5h、1h、2h的情况，随着时间延长，人骨髓间充质干细胞内荧光强度增强且聚集到细胞核周围，表明诱导间充质干细胞成骨分化siRNA和含FITC多肽段已经成功被金纳米内核携带进入人骨髓间充质干细胞中。
诱导剂对人骨髓间充质干细胞的毒性实验:
请参照图8，图8为本发明中人骨髓间充质干细胞的活性实验结果统计图。
图8A是将人骨髓间充质干细胞消化培养在96孔板中，密度为104/孔；再分别将0、50、100、200、500nmol/L的间充质干细胞成骨分化诱导剂溶于1mL的培养液中；然后用不同浓度的培养液分别与人骨髓间充质干细胞共孵育24h；最后用细胞固定液固定人骨髓间充质干细胞，并用阿尔玛蓝试剂盒检测细胞活力。结果显示人骨髓间充质干细胞的存活率均在90％以上，表明间充质干细胞成骨分化诱导剂对人骨髓间充质干细胞的生物毒性较低。
另外，图8B是将人骨髓间充质干细胞消化培养在96孔板中，密度为104/孔；再将200nmol/L的间充质干细胞成骨分化诱导剂溶于1mL的培养液中；然后用处理过的培养液与人骨髓间充质干细胞共孵育24h、48h、72h；最后用细胞固定液固定人骨髓间充质干细胞，并用阿尔玛蓝试剂盒检测细胞活力。结果显示人骨髓间充质干细胞的存活率由95％递减为90％，进一步表明间充质干细胞成骨分化诱导剂对细胞的生物毒性较低。
诱导剂诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化实验：
利用实施1中运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA以摩尔比为1:10混合，得到间充质干细胞成骨分化诱导剂，对人骨髓间充质干细胞进行诱导实验。先将人骨髓间充质干细胞培养在6孔板中，且分别与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA、Au、Lip2000-siRNA、间充质干细胞成骨分化诱导剂共孵育7天。
提取人骨髓间充质干细胞的总RNA进行RT-PCR实验后进行灰度分析，统计结果制成柱状图。请参照图9，图9为本发明中诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育7天后的RT-PCR实验分析结果统计图，由图可知，成骨分化的标志性基因BMP-2、Runx2基因表达明显上升，表明间充质干细胞成骨分化诱导剂成功促进人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞。
另外，提取人骨髓间充质干细胞的总蛋白进行Western blot实验后进行灰度分析，统计结果制成柱状图。请参照图10，图10为本发明中诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育7天后的Western blot实验统计图，由图可知，其中成骨分化的负调控因子PPARγ的蛋白表达明显下降，成骨分化的标志性蛋白BMP-2、Runx2基因表达明显上升，进一步表明间充质干细胞成骨分化诱导剂成功促进人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞。
诱导剂诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的效果分析实验：
利用实施1中运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA以摩尔比为1:10混合，得到间充质干细胞成骨分化诱导剂，对人骨髓间充质干细胞进行诱导实验。
请参照图11，图11为本发明中诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育1～7天后的激光共聚焦显微镜观察图，荧光染料DAPI激发波长为405nm，荧光素FITC激发波长为488nm。将诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育1天、3天、7天之后，人骨髓间充质干细胞内的荧光显示情况。由图11可知，孵育7天的人骨髓间充质干细胞内的荧光强度，高于孵育3天和孵育1天的人骨髓间充质干细胞内的荧光强度。表明在间充质干细胞成骨分化诱导剂的诱导下，人骨髓间充质干细胞成功分化为成骨细胞；且由于明显的荧光强度区别，可以达到实施监测分化情况的目的。
将人骨髓间充质干细胞培养在24孔板中，且分别将人骨髓间充质干细胞与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA、Au、Lip2000-siRNA、间充质干细胞成骨分化诱导剂共同孵育7天；再用细胞固定液固定人骨髓间充质干细胞，然后加入1％的茜素红染料进行染色，用激光共聚焦显微镜观察人骨髓间充质干细胞的染色情况。
请参照图12，图12为本发明中诱导剂与人骨髓间充质干细胞共同孵育1～7天后的细胞成骨分化染色图。图12中结果显示，经过诱导剂处理的实验组细胞染色颜色相较于对照组明显加深，表明间充质干细胞成骨分化诱导剂已对人骨髓间充质干细胞的进行了诱导分化，人骨髓间充质干细胞已成功分化为成骨细胞。
与现有技术相比，本发明通过构建功能性金纳米内核，再在其表面修饰一种连接荧光分子的MMP-13酶响应肽段——即含FITC的多肽段；进一步，由于金纳米内核富含正电荷，能够吸附带负电的诱导间充质干细胞成骨分化siRNA，形成间充质干细胞成骨分化诱导剂。该诱导剂可抑制骨髓间充质干细胞的成脂基因PPARγ的表达，使其基因沉默，并诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞，促进间充质干细胞成骨分化；同时通过酶切反应和FRET效应荧光实时监测细胞分化的方法，可为医学基础研究和组织工程研究提供新的诱导干细胞定向分化及监测分化的方案。本发明所述间充质干细胞成骨分化诱导剂具有良好的生物相容性，无毒副作用，且结构和制备工序简单，能便捷、高效、精准携载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA，安全地诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞，同时能实时监测细胞分化情况。可以成为研究干细胞基础科学研究的有力工具，在骨疾病治疗中具有广阔的临床应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种间充质干细胞成骨分化诱导剂，其特征在于：包括金纳米内核，及修饰在所述金纳米内核表面的诱导间充质干细胞成骨分化siRNA。
2.根据权利要求1所述间充质干细胞成骨分化诱导剂，其特征在于：所述诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的序列包括正义链和反义链；
所述正义链为5′-GACAUUCCAUUCACAAGAA-3′；
所述反义链为5′-UUCUUGUGAAUGGAAUGUCTT-3′。
3.根据权利要求1或2所述间充质干细胞成骨分化诱导剂，其特征在于：所述金纳米内核的表面还修饰有含FITC多肽段。
4.金纳米内核作为诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的应用。
5.一种运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体，其特征在于：包括金纳米内核，及修饰在所述金纳米内核表面的含FITC多肽段。
6.根据权利要求5所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体，其特征在于：所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的粒径为8-12nm。
7.根据权利要求5所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体，其特征在于：所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体表面的Zeta电位为30～60mV。
8.根据权利要求5所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体，其特征在于；所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体的紫外-可见吸收峰位为500～550nm。
9.一种间充质干细胞成骨分化诱导剂的制备方法，其特征在于：将Au-PEI与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA混合，获得间充质干细胞成骨分化诱导剂。
10.根据权利要求9所述间充质干细胞成骨分化诱导剂的制备方法，其特征在于：在Au-PEI与诱导间充质干细胞成骨分化siRNA混合之前，还包括步骤：将Au-PEI与含FITC的活性多肽溶液混合反应，再经离心、清洗后，得到运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体。
11.根据权利要求10所述间充质干细胞成骨分化诱导剂的制备方法，其特征在于：所述运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体与所述诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的摩尔比为1:5～10。
12.根据权利要求10所述间充质干细胞成骨分化诱导剂的制备方法，其特征在于：所述Au-PEI与所述含FITC的活性多肽溶液混合后，搅拌5～7h，再以10000～14000r/min的转速离心处理3～8min，除去上清后用去离子水清洗，得到运载诱导间充质干细胞成骨分化siRNA的载体。
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