CN106729712A - 一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl‑2 siRNA的制备方法 - Google Patents

一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl‑2 siRNA的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl‑2 siRNA的制备方法，包括：功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒{(Au0)25‑PEI‑(PEG‑RGD)10‑mPEG10}的制备；功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl‑2 siRNA复合物的制备。本发明的方法过程简单，实验条件温和，易操作，得到的{(Au0)25‑PEI‑(PEG‑RGD)10‑mPEG10}作为Bcl‑2 siRNA的载体应用于诱导特异性癌细胞基因沉默，具有很好的应用前景。

Description

一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2 siRNA的制备方法
技术领域
本发明属于高分子纳米载体靶向基因转染领域，特别涉及一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2 siRNA的制备方法。
背景技术
基因治疗作为一种新型的有效治疗手段，已经引起了研究者们广泛的关注。在多种基因治疗手段中，RNA干扰技术是一种相对高效的生物治疗方法，它能通过双链RNA诱导同源性的信使RNA特异性的降解，从诱导基因沉默。小干扰RNA(siRNA)治疗方法已经被证明是一种有前景的治疗手段，它能够治疗很多固有的和获得性的疾病，包括艾滋病、血友病和肿瘤等等。然而，siRNA本身的特性限制了它的广泛运用，比如：易被降解，与细胞膜相同的表面负电荷和较差的溶酶体逃逸能力。因此，安全高效的载体在基因传递系统中必不可少的。
近些年，各种纳米材料被应用于基因传递系统，包括脂质体、树状大分子、量子点和碳纳米管等等。然而，能够完全克服siRNA传递障碍的载体还是有待开发。在过去的研究中，RGD(环状的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸氨基酸序列肽)多肽修饰的树状大分子包裹的纳米颗粒被应用于负载人骨形态发生蛋白-2来转染骨髓间充质干细胞，结果成功的诱导了干细胞分化成成骨细胞(ZL201310699637.X)。但是，树状大分子的高成本限制了其进一步的临床应用。聚乙烯亚胺是一种功能性水溶大分子，拥有与树状大分子相似的结构性质：丰富的表面氨基官能团和高度支化的结构。这些独特的性质赋予聚乙烯亚胺作为基因传递载体的广泛应用前景。检索国内外相关文献和专利结果表明：以聚乙二醇化的RGD修饰的包裹金纳米颗粒的聚乙烯亚胺为载体，用于靶向基因转染的方法，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，该方法具有易操作，转染条件简单，转染效率高，特异性强等优点，在癌症治疗等方面有良好的应用前景。
本发明将聚乙烯亚胺作为主体，在其表面修饰RGD，聚乙二醇(PEG)，并包裹纳米金颗粒，制备出一种功能化的聚乙烯亚胺纳米颗粒，这种纳米颗粒由于拥有丰富的表面氨基，可以与带负电荷的B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)siRNA通过静电作用相互结合，形成的载体/基因复合物能够通过RGD靶向性的识别人恶性胶质母细胞瘤细胞(U87MG)表面的αvβ3整合素，从而进入细胞，实现对肿瘤细胞特异性的癌细胞基因沉默。
本发明的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒(Au PENPs)/Bcl-2 siRNA的制备方法，包括：
(1)将NH2-PEG-COOH溶液与6-MAL(6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)溶液混合，搅拌反应8h，得到MAL-PEG-COOH溶液，然后加入RGD-SH(巯基端环状的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸氨基酸序列肽；上海强耀生物科技有限公司)溶液，搅拌反应12h，得到RGD-PEG-COOH溶液；
(2)将步骤(1)中的RGD-PEG-COOH溶液经过EDC·HCl((1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐))和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化后，加入PEI，反应24h，得到PEI-(PEG-RGD)10溶液，然后加入经EDC·HCl和NHS活化的mPEG-COOH(端基分别为羧基和甲氧基的聚乙二醇)溶液，反应24h，得到PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10溶液；
(3)将HAuCl4·4H2O(198.67μL)溶液加入到步骤(2)中的PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10溶液中，搅拌反应30min，然后加入NaBH4溶液(27.4μL)，搅拌3h，透析，冷冻干燥，得到{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}；
(4)将步骤(3)中的{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}用无菌水稀释，然后用DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液稀释Bcl-2 siRNA，再将二者混合均匀后于37℃孵育30min，得到功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2 siRNA。
所述步骤(1)中NH2-PEG-COOH、6-MAL和RGD-SH的摩尔比为1：1：1；其中，NH2-PEG-COOH、6-MAL和RGD-SH的质量分别为11.58mg，1.785mg和4mg。
所述步骤(1)中NH2-PEG-COOH溶液、6-MAL溶液和RGD-SH溶液的浓度均为5.8mmol/mL，溶剂均为DMSO。
所述步骤(2)中EDC·HCl、NHS和mPEG-COOH的摩尔比为1.8：1.8：1；EDC·HCl、NHS和RGD-PEG-COOH的摩尔比为1.8：1.8：1；其中，EDC·HCl、NHS和mPEG-COOH的质量分别为4.0mg，2.4mg和11.58mg。
所述步骤(2)中mPEG-COOH与PEI的摩尔比为10：1(质量分别为11.58mg和13.9mg)。
所述步骤(2)中mPEG-COOH溶液的浓度为5.8mmol/mL；PEI溶液的浓度为0.58mmol/mL；溶剂均为DMSO。
所述步骤(3)中HAuCl4·4H2O与PEI的摩尔比为25：1，NaBH4与HAuCl4·4H2O的摩尔比为5：1。
所述步骤(3)中HAuCl4·4H2O与PEI的摩尔比为25：1，其中，HAuCl4·4H2O的质量为5.96mg；NaBH4与HAuCl4·4H2O的摩尔比为5：1，其中NaBH4的质量为0.274mg。
本发明将HAuCl4·4H2O加入到功能化聚乙烯亚胺溶液中后，快速搅拌30min，能够使HAuCl4·4H2O与聚乙烯亚胺充分混合，进入到聚乙烯亚胺内部空腔；再快速加入NaBH4还原得到金纳米颗粒，避免了金纳米颗粒的聚集。
所述步骤(3)中透析为用去离子水透析3d，每天3次，每次2L去离子水；其中，透析袋截留分子量为14000。
所述步骤(4)中{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}与Bcl-2 siRNA的N/P比为5：1～15：1；所述的N/P比为聚乙烯亚胺纳米颗粒的伯氨基与siRNA骨架上磷酸基团摩尔比，优选5:1、10:1或者15:1。
所述步骤(4)中{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}作为负载Bcl-2 siRNA的载体应用于诱导特异性癌细胞基因沉默。
本发明中将亲水试剂PEG接枝到末端为氨基的聚乙烯亚胺表面，可以与部分表面氨基发生反应以降低材料对细胞的毒性，从而提高材料的生物相容性；将靶向试剂RGD修饰到聚乙烯亚胺表面，使材料能够与U87MG细胞表面的αvβ3整合素相结合，实现材料对肿瘤细胞的特异性靶向效果。
本发明以功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒为载体，负载Bcl-2 siRNA，以U87MG细胞作为靶细胞，基因转染诱导肿瘤内特异性基因沉默。本发明通过核磁共振(1H NMR)对修饰在聚乙烯亚胺纳米颗粒表面的PEG和RGD的数量进行表征；紫外可见光谱(UV-Vis)对载体中的金纳米颗粒的存在进行了表征；透射电子显微镜(TEM)对载体中的金纳米颗粒的分布和大小进行了表征；凝胶阻滞实验对载体/siRNA复合物进细胞的能力进行了表征；通过水动力学粒径和表面电势对载体/Bcl-2 siRNA复合物的粒径和电势进行了分析；通过CCK-8测试材料对细胞的毒性；通过加强绿色荧光蛋白基因(EGFP)的转染对载体的基因传递能力进行检测；通过流式细胞术对载体负载Bcl-2 siRNA的基因转染能力进行研究；通过共聚焦显微镜对载体负载Bcl-2 siRNA后在细胞内的定位进行观察；通过自由RGD阻断实验对材料的靶向性能进行研究；通过western blot对载体负载Bcl-2 siRNA进入细胞后，对特异性基因沉默的能力进行检测。
有益效果
(1)本发明制备的功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒具有良好的基因转染效果，为癌细胞的基因治疗提供了应用前景；
(2)本发明制备的功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒对U87MG细胞具有靶向作用，可用于基因的靶向输送；
(3)本发明的方法具有制备过程简单，实验条件温和，易操作，在负载siRNA后对诱导癌症细胞基因具有良好的基因沉默结果，在癌症细胞的基因治疗方面有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中{(Au0)25-PEI-mPEG20}(a)和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}(b)的核磁共振氢谱图；
图2为实施例2中{(Au0)25-PEI-mPEG20}(a)和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}(b)的紫外吸收光谱图；
图3为实施例2中{(Au0)25-PEI-mPEG20}(a)和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}(b)的TEM图和粒径分布直方图；
图4为实施例3中PEI(a)和{(Au0)25-PEI-mPEG20}(b)和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}(c)的凝胶阻滞实验电泳图谱；
图5为实施例4中{(Au0)25-PEI-mPEG20}和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}/Bcl-2siRNA复合物的水动力学粒径(a)和电势(b)图；
图6为实施例5中{(Au0)25-PEI-mPEG20}和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}对U87MG细胞的细胞毒性结果图；
图7为实施例6中{(Au0)25-PEI-mPEG20}和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}/pDNA复合物在不同N/P下对U87MG的绿色荧光蛋白基因转染的荧光显微镜图；其中，a～k分别为经PBS，pDNA,PEI/pDNA(N/P＝5),PEI/pDNA(N/P＝10)，PEI/pDNA(N/P＝15)，{(Au0)25-PEI-mPEG20}PENPs/pDNA(N/P＝5)，{(Au0)25-PEI-mPEG20}PENPs/pDNA(N/P＝10)，{(Au0)25-PEI-mPEG20}PENPs/pDNA(N/P＝15)，{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}PENPs/pDNA(N/P＝5)，{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}PENPs/pDNA(N/P＝10)和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}PENPs/pDNA(N/P＝15)处理后的U87MG细胞；
图8为实施例7中{(Au0)25-PEI-mPEG20}和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}PENPS/Bcl-2siRNA复合物在不同N/P下对U87MG细胞的基因转染效率图；
图9为实施例8中在N/P＝10时，激光共聚焦显微镜图；其中，a-e分别为经PBS，Bcl-2 siRNA，PEI/Bcl-2 siRNA，{(Au0)25-PEI-mPEG20}PENP/Bcl-2 siRNA和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}PENP/Bcl-2 siRNA处理后的U87MG细胞；
图10为实施例9中I:{(Au0)25-PEI-mPEG20}/Bcl-2 siRNA复合物和II:{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}/Bcl-2 siRNA复合物的自由RGD阻断结果图；
图11为实施例10中{(Au0)25-PEI-mPEG20}和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}/Bcl-2 siRNA复合物在N/P＝10时，蛋白印记分析图；
图12为本发明中的实施例和对比例涉及到的反应示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
称取NH2-PEG-COOH 11.58mg，溶于5mL DMSO，边搅拌边逐滴滴加溶于1mL DMSO溶液的干重为1.785mg的6-MAL，反应8h，得到MAL-PEG-COOH溶液。将1mL RGD-SH的DMSO溶液(4mg/mL)，逐滴加入到上述的MAL-PEG-COOH溶液中，反应12h，得到RGD-PEG-COOH溶液。称取4.0mg EDC·HCl和2.4mg NHS，分别溶于1mL DMSO中，先后将EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加RGD-PEG-COOH溶液中，搅拌反应3h，得到活化的RGD-PEG-COOH。称取聚乙烯亚胺(PEI)13.9mg，溶于5mL DMSO中，得到PEI溶液。将上述经过活化的RGD-PEG-COOH溶液逐滴加入到PEI溶液中，室温下磁力搅拌，反应24h，得到PEI-(PEG-RGD)10。称取mPEG-COOH 11.58mg，溶于5mL DMSO，得到mPEG-COOH溶液。称取2.0mg EDC和1.2mg NHS，分别溶于1mL DMSO中，先后将EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加到mPEG-COOH溶液中，搅拌反应3h，得到活化的mPEG-COOH。将上述中活化好的mPEG-COOH溶液逐滴加入到PEI-(PEG-RGD)10溶液中，室温下磁力搅拌，反应24h，得到PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10溶液。将PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天(2L×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后将得到的干燥PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10溶于5mL水中，再逐滴加入198.67μL HAuCl4·4H2O水溶液(30mg/mL)混合搅拌30min，然后快速的加入27.4μL的10mg/mL的NaBH4溶液，反应3h，得到{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}溶液。反应结束后，将反应产物{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天(2L×3)。然后进行冷冻干燥处理，得到最终干燥产物{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}。
实施例2
对实施例1制备的{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}和对比例1制备的{(Au0)25-PEI-mPEG20}进行结构表征。1HNMR表征结果如图1所示，在化学位移3.5ppm处有个质子峰，它是PEG分子结构中的特征基团的质子峰，根据积分面积可以求出{(Au0)25-PEI-mPEG20}(a)和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}(b)表面分别连接了20.8和22.5个PEG分子；在化学位移7.2ppm处有个质子峰，它是RGD分子结构中的特征基团的质子峰，根据积分面积可以求出{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}表面接了4.6个RGD。UV-vis结果如图2所示，{(Au0)25-PEI-mPEG20}(a)和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}(b)表面等离子体共振(SPR)峰位于510nm。这表明制备得到了金纳米颗粒。TEM结果如图3所示，制备的{(Au0)25-PEI-mPEG20}(a)和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}(b)形状接近球形，单分散性好，平均直径分别只有2.5nm和2.9nm。
实施例3
根据实施例1和对比例1的方法制备的{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}和{(Au0)25-PEI-mPEG20}与Bcl-2 siRNA形成复合物，并进行凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。按照不同N/P比0.25，0.5，1，2，3,4，5，6。siRNA量为1μg/孔，配制载体/siRNA复合物，孵育30min，并以裸siRNA为对照。然后将对应的载体/Bcl-2 siRNA复合物分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压80V，时间30min。使用凝胶成像仪对siRNA在凝胶中的迁移进行分析。结果如图4所示。结果表明，{(Au0)25-PEI-mPEG20}和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}均可以在较低N/P(N/P＝0.5)下与siRNA很好复合，将siRNA电迁移阻滞；将siRNA完全包裹，说明这两种载体均具有很好的siRNA压缩能力。
实施例4
将实施例1和对比例1制备得到的{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}和{(Au0)25-PEI-mPEG20}在不同的N/P比条件下(5:1，10:1，15:1)分别与5μg Bcl-2 siRNA通过静电作用，形成载体/Bcl-2 siRNA复合物，使终体积固定在100μL，室温下孵育30min，然后加入1mLPBS。通过马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK，633nm激光)对其水动力学粒径和表面电势进行了表征，结果如图5所示。结果表明，随着N/P比的增加，复合物的水动力学粒径(a)减小了，都在200nm左右；而复合物的表面电势(b)都在0～10mV之间，说明复合物的尺寸和电势都在合适的转染范围内。这些说明材料有利于细胞的吸附和内吞，也就有利于载体对目的基因的传递。
实施例5
以具有αVβ3整合素表达的U87MG细胞为模型细胞来检验PEI、实施例1、对比例1制备的材料的细胞毒性。以8×103/孔的密度将U87MG种于96孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。然后将培养基换成浓度分别为0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM和3000nM的含PEI，{(Au0)25-PEI-mPEG20}和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}/1μg Bcl-2siRNA复合物的细胞培养基与细胞共培养24h，随后加入含10μL CCK-8的DMEM培养基溶液，继续培养2h。，用多功能酶标仪测试吸光值，测试波长450nm，结果如图6所示。结果表明，随着材料浓度的增加，细胞存活率下降，但{(Au0)25-PEI-mPEG20}和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}的毒性都比PEI的毒性低。说明PEG和RGD的修饰都降低(中和)了聚乙烯亚胺表面的氨基数目，从而降低了材料的细胞毒性(生物学毒性)。
实施例6
以携带加强绿色荧光蛋白基因的质粒并具有αVβ3整合素表达的U87MG细胞为模型细胞来检验PEI、实施例1、对比例1制备的材料作为载体对U87MG细胞的基因转染效率。以1×105/孔的密度将U87MG种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后按照N/P比为5:1,10:1和15:1，制备载体/pDNA复合物，其中每个孔的pDNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基，继续培养24h。采用了携带加强绿色荧光蛋白基因的质粒，在不同N/P比下对细胞进行转染。在转染24h后，采用荧光显微镜观察结果，结果见图7。从图中可以看出，在N/P比等于10时，{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}的加强荧光蛋白基因的表达强度是较强的，虽然在N/P比为5的时候，PEI负载质粒后绿色荧光表达量最强，但是考虑到在同样浓度下PEI的细胞毒性较大，因此{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}是比较合适的基因载体，表明修饰了PEG与RGD的材料和包裹了金纳米颗粒的材料比没有修饰PEG与RGD的材料和没有包裹金纳米颗粒的材料转染效率高。
实施例7
以带有cy3标记的Bcl-2 siRNA并以具有αVβ3整合素表达的U87MG细胞为模型细胞来研究PEI、实施例1、对比例1制备的材料作为载体负载Bcl-2 siRNA后的基因转染效率。以1×105/孔的密度将U87MG种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后按照N/P比为5:1,10:1和15:1，制备载体/siRNA复合物，其中每个孔的siRNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。采用流式细胞仪对结果进行检测，结果见图8。结果显示，对照组和单独siRNA组都未见明显荧光，而在N/P比为10时，经{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}负载后的基因表达浓度最高，与{(Au0)25-PEI-mPEG20}相比都具有显著性的差异。在高N/P比的时候，Bcl-2 siRNA转染结果为{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}>{(Au0)25-PEI-mPEG20}>PEI，这与上述的加强绿色荧光蛋白基因表达结果相一致。
实施例8
以带有cy3标记的Bcl-2 siRNA并以具有αVβ3整合素表达的U87MG细胞为模型细胞来研究PEI、实施例1、对比例1制备的材料作为载体负载Bcl-2 siRNA后的胞内定位。以1.0×105/孔的密度将U87MG种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后按照N/P比等于10，制备载体/siRNA复合物，其中每个孔的siRNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。采用共聚焦显微镜对结果进行观察，结果见图9。观察结果显示：{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}和{(Au0)25-PEI-mPEG20}负载Bcl-2 siRNA基因后，复合物大部分都进入到细胞内部，还有部分甚至已经进入到了细胞核中，说明载体能够成功将Bcl-2 siRNA运输到细胞内，从而实现后续的基因沉默。
实施例9
以带有cy3标记的Bcl-2 siRNA并以具有αVβ3整合素表达的U87MG细胞为模型细胞来检验PEI、实施例1、对比例1制备的材料作为载体研究对αVβ3整合素被屏蔽后的U87MG细胞的转染效果。以1.0×105/孔的密度将U87MG种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后将自由RGD-SH(5μM)加到含有U87MG细胞的培养液中，培养30min，再在N/P比为10的时候，加入{(Au0)25-PEI-mPEG20}/cy3-Bcl-2 siRNA和{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}/cy3-Bcl-2siRNA复合物与细胞共培养4h，随后通过流式细胞仪检测复合物的荧光强度，结果见图10。测试结果显示：在N/P等于10时，{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}/cy3-Bcl-2 siRNA复合物在低表达αVβ3整合素U87MG细胞(RGD+)的荧光强度显著性的低于其在高表达αVβ3整合素(RGD-)U87MG细胞(RGD-)的荧光强度，而{(Au0)25-PEI-mPEG20}/cy3-Bcl-2 siRNA复合物在两种不同细胞内的荧光强度没有显著性差异，这表明修饰了RGD的材料具有显著的靶向特异性。
实施例10
以具有αVβ3整合素表达的U87MG细胞为模型细胞来检验PEI、实施例1、对比例1制备的材料作为载体负载Bcl-2 siRNA对U87MG细胞的基因沉默效率。以1.0×105/孔的密度将U87MG种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后按照N/P比等于10，制备载体/siRNA复合物，其中每个孔的siRNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后再更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基，继续培养48h，用细胞裂解液裂解细胞，释放出胞内蛋白。通过western blot来检测细胞内Bcl-2蛋白的表达水平，结果见图11。在N/P为10时，未转染的细胞组和单独siRNA细胞组的细胞都有较高的Bcl-2蛋白的表达，而{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}在负载了Bcl-2siRNA后，细胞中的Bcl-2蛋白的表达明显的降低，只有22％，对比PEI的39％和{(Au0)25-PEI-mPEG20}的41％有显著性的差异，说明{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}是一种安全的优秀基因载体，能够很好的负载治疗性的Bcl-2 siRNA诱导U87MG细胞特异性的基因沉默。
对比例1
称取mPEG-COOH 23.16mg，溶于5mL DMSO。称取4.0mg EDC·HCl和2.4mg NHS，分别溶于1mL DMSO中，先后将EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加到mPEG-COOH溶液中，搅拌反应3h。称取聚乙烯亚胺(PEI)13.9mg，溶于5mL DMSO中。将上述中活化好的mPEG-COOH溶液逐滴加入到PEI溶液中，室温下磁力搅拌，反应3d。得到PEI-mPEG20溶液。在上述溶液中逐滴加入198.67μL HAuCl4水溶液(30mg/mL)混合搅拌30min，然后快速的加入27.4μL的10mg/mL的NaBH4溶液，反应3h。反应结束后，将反应产物{(Au0)25-PEI-mPEG20}转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天(2L×3)。然后进行冷冻干燥处理，得到最终干燥产物{(Au0)25-PEI-mPEG20}。

Claims (10)

1.一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，包括：
(1)将NH2-PEG-COOH溶液与6-MAL溶液混合，搅拌反应8h，得到MAL-PEG-COOH溶液，然后加入RGD-SH溶液，搅拌反应12h，得到RGD-PEG-COOH溶液；
(2)将步骤(1)中的RGD-PEG-COOH溶液经过EDC·HCl和NHS活化后，加入聚乙烯亚胺PEI溶液，反应24h，得到PEI-(PEG-RGD)10溶液，然后加入经EDC·HCl和NHS活化的mPEG-COOH溶液，反应24h，得到PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10溶液；
(3)将HAuCl4·4H2O水溶液加入到步骤(2)中的PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10溶液中，搅拌反应30min，然后加入NaBH4溶液，搅拌3h，透析，冷冻干燥，得到{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}；
(4)将步骤(3)中的{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}用无菌水稀释，然后用DEPC水溶液稀释Bcl-2siRNA，再将二者混合均匀后于37℃孵育30min，得到功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA。
2.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中NH2-PEG-COOH、6-MAL和RGD-SH的摩尔比为1：1：1。
3.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中NH2-PEG-COOH溶液、6-MAL溶液和RGD-SH溶液的浓度均为5.8mmol/mL，溶剂均为DMSO。
4.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中EDC·HCl、NHS和mPEG-COOH的摩尔比为1.8：1.8：1；EDC·HCl、NHS和RGD-PEG-COOH的摩尔比为1.8：1.8：1。
5.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中mPEG-COOH与PEI的摩尔比为10：1。
6.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中mPEG-COOH溶液的浓度为5.8mmol/mL；聚乙烯亚胺纳米颗粒溶液的浓度为0.58mmol/mL；溶剂均为DMSO。
7.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中HAuCl4·4H2O与PEI的摩尔比为25：1；NaBH4与HAuCl4·4H2O的摩尔比为5：1。
8.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中HAuCl4·4H2O溶液的浓度为30mg/mL，NaBH4溶液的浓度为10mg/mL；溶剂均为水。
9.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}与Bcl-2siRNA的N/P比为5：1～15：1。
10.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2siRNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中{(Au0)25-PEI-(PEG-RGD)10-mPEG10}作为Bcl-2siRNA的载体应用于诱导特异性癌细胞基因沉默。
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