CN107353408A - 一种主客体自组装作用构建表面氨基的核‑壳超结构树状大分子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种主客体自组装作用构建表面氨基的核‑壳超结构树状大分子的方法,包括:主客体分子修饰的聚酰胺‑胺树状大分子的合成及表征;基于主客体自组装作用的核‑壳超结构树状大分子纳米复合物的构建及表征。本发明制备的表面氨基的核‑壳超结构树状大分子作为基因转染载体时,具有低毒安全、转染条件简单、转染效率高等优点,在基因治疗等方面有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于高分子纳米载体领域,特别涉及一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法。
背景技术
基因治疗是指通过一定的方式把外源治疗基因导入到靶细胞,以纠正或者补偿因基因缺陷与异常所引起的疾病,进而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为一种革命性的治疗手段,已经广泛应用于遗传病、肿瘤和病毒性疾病的治疗当中,并且取得了一定的成效,已成为生命科学和临床科学领域中最热门的研究课题之一。
构建安全高效的基因传递载体是基因治疗所面临的最大挑战。聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子由于其表面丰富的氨基,良好的单分散性和稳定性,作为基因传递的优良载体受到了广泛的研究。研究表明,聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子的转染效率主要取决于树状大分子的代数,代数越高,转染效率越高(Baker,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1996,93,4897-4902.)。然而,用传统的方法合成更高代的、结构更精确的树状大分子时,要重复的合成步骤太多,反应控制困难(PAMAM G9树状大分子,尺寸10nm,需要18步反应)。因此需找到一种简易、快速、可控的合成方法获得具有更高基因转染效率的高代聚酰胺-胺树状大分子。有人使用表面氨基的较高代树状大分子做核,表面羧基的较低代树状大分子做壳,通过EDC催化羧基与氨基的反应,构建核壳结构的树状大分子(Uppuluri,etal.Adv.Mater.,2000,12(11):796-800.)。但这种方法构建的表面羧基的树状大分子无法作为基因载体负载基因。
基于超分子化学中的主-客体分子识别作用是构建超分子结构的常用方法。由于超分子化学中作为主体分子的β-环糊精与结构稳定且高度疏水的客体分子金刚烷有较高的结合常数,因此利用金刚烷与环糊精的主客体作用构建超分子结构得到了广泛应用。检索国内外相关文献和专利结果表明:利用超分子化学中的主客体自组装作用构建核壳超结构树状大分子用于基因转染的方法,尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法,该方法以聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子为反应单元,利用主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子,该方法具有易操作,转染条件简单,转染效率高等优点,在基因治疗方面有良好的应用前景。
本发明的一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法,包括:
(1)在溶有1-金刚烷乙酸Ada-COOH的DMSO溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酸亚胺NHS,搅拌反应3~5h,得到活化的Ada-COOH;然后将活化的Ada-COOH加入到溶有第三代聚酰胺-胺树状大分子(G3)的DMSO溶液中,搅拌反应3~4天,得到客体分子金刚烷修饰的G3-AD溶液;
(2)在DMSO溶液中分别加入β-环糊精β-CD和N,N’-羰基二咪唑CDI,然后将二者混合,搅拌反应6-7h,得到反应液;将第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5)溶解在DMSO中,然后滴加到反应液中,室温搅拌反应60-70h,得到主体分子β-环糊精修饰的G5-β-CD溶液;
(3)将步骤(1)、(2)所得的溶液透析,然后进行冷冻干燥处理,得到干燥的G3-AD、G5-β-CD,记为M1、M2;
(4)将步骤(3)得到的干燥的G3-AD、G5-β-CD按摩尔比1:10分别溶入超纯水中,混合搅拌反应24~28h,通过自组装作用得到表面氨基的核-壳超结构树状大分子G5-β-CD/AD-G3溶液;最后进行透析、冷冻干燥,得到G5-β-CD/AD-G3,记为M3。
所述步骤(1)中的EDC/NHS与Ada-COOH的摩尔比为10:1;Ada-COOH与G3的摩尔比为1.5:1。
所述步骤(2)中的β-CD与CDI的摩尔比为1:10;β-CD与G5的摩尔比为24:1。
所述步骤(2)中的G5的DMSO溶液浓度为0.5mg/mL。
所述步骤(3)中的透析具体为:G3-AD溶液以截留分子量为1000Da的透析袋透析;G5-β-CD溶液以截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析。
所述步骤(4)中的G3-AD的超纯水溶液的浓度为4mg/mL;G5-β-CD的超纯水溶液的浓度为2mg/mL。
所述步骤(4)中的透析具体为:以截留分子量为10000Da的透析袋透析。
基因转染效率的评价方法包括如下步骤:
(1)取M1、M2、M3,分别用超纯、无菌水配制成2mg/mL溶液,按照合适的N/P比,与相同量的质粒DNA(pDNA)混合,轻微振荡混合均匀,并置于37℃下孵育20-30min,得到不同N/P比的载体/pDNA纳米复合物;其中N/P比为材料的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比,数值范围为0.125-60:1;
(2)将HeLa细胞种于24孔板中,37℃、5%CO2下过夜培养,待细胞长满到整个孔板的70%-80%时,更换成无血清培养基,分别加入步骤(1)所得的三种载体/pDNA纳米复合物,混合均匀,在培养箱中培养4-6h,然后将培养基换成有血清的培养基继续培养24h,评价每一种载体/pDNA纳米复合物的基因转染效率。转染HeLa细胞时选取的N/P分别为20:1,40:1,60:1。
本发明旨在通过β-环糊精修饰的第五代树状大分子作核,金刚烷修饰的第三代树状大分子做壳,利用主客体分子的自组装作用构建表面氨基的核壳超结构树状大分子,进而作为基因载体,实现高效率的基因转染。进行主客体分子自组装时,根据主客体分子的个数,控制G5-β-CD与G3-AD的投料摩尔比为1:10,使得G5-β-CD上的环糊精都能与G3-AD上的金刚烷结合,构成超分子结构。
本发明基于β-环糊精与金刚烷的主客体相互作用,构建由不同代数聚酰胺-胺树状大分子构成的核壳超结构树状大分子,得到类似于高代树状大分子的聚集体,并用于基因转染应用的研究。由于β-环糊精与金刚烷间较高的结合常数,使得构建的超分子结构具有良好的稳定性,有利于与基因形成复合物,提高基因转染效率。另外,β-环糊精是一类生物相容性较好的分子,修饰在树状大分子上以后可以提高载体的生物相容性,降低细胞毒性,从而提高基因转染效率。本发明不仅为快速合成高代聚酰胺-胺树状大分子提供了一个新方法,同时也为提高基因转染效率提供了新思路。
本发明通过核磁共振(1H-NMR)对修饰在树状大分子上的β-CD(主体分子)和Ada(客体分子)的数量进行了表征;二维核磁(2D-NOESY)对通过主客体相互作用构建的核壳超分子树状大分子进行表征;透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)对主客体单元以及构建的超分子结构复合物的表面形貌和尺寸大小进行了表征;凝胶阻滞实验对载体负载pDNA的能力进行了表征;通过水动力学直径对核壳超分子树状大分子/pDNA纳米复合物的粒径进行了表征分析;通过CCK-8分析测试载体对细胞的毒性;通过荧光素酶基因(Luc)、增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的转染对载体的基因转染能力进行了评价;通过流式细胞术对载体负载pDNA的基因转染能力进行研究;通过共聚焦显微镜对载体负载pDNA后在细胞内的定位进行观察。
有益效果
(1)本发明制备的核壳超结构树状大分子表面具有丰富氨基,具有良好的基因转染效果,为构建安全高效的基因载体,用于基因治疗提供了应用前景;
(2)本发明反应条件简单,合成制备易操作,转染条件简单,转染效率高,在癌症的基因治疗等方面具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的M1(a)和M2(b)的核磁共振氢谱图;
图2为本发明制备的M3的2D-NOESY谱图;
图3为本发明制备的M1(a),M2(b)和M3(c)的原子力显微镜(AFM)图;
图4为本发明制备的M3的透射电子显微镜(TEM)图;
图5为本发明制备的M1(a),M2(b)和M3(c)的凝胶阻滞实验琼脂糖凝胶电泳图谱;
图6为本发明制备的M3在不同N/P比条件下与pDNA形成的复合物粒径大小图;
图7为本发明制备的M1,M2和M3在不同浓度下的对HeLa细胞毒性实验图;
图8为本发明制备的M1,M2和M3在不同N/P比下对HeLa细胞的荧光素酶基因转染效率图;
图9为本发明制备的M1,M2和M3在不同N/P比下对HeLa细胞的增强型绿色荧光蛋白基因转染的荧光显微镜图;
图10为本发明制备的M1,M2和M3在N/P=60下,与Cy3标记的pDNA所形成的复合物被HeLa细胞内吞的流式细胞仪检测结果图;
图11为本发明制备的M1,M2和M3在N/P=60下,与Cy3标记的pDNA所形成的复合物被HeLa细胞内吞入细胞的胞内定位的激光共聚焦显微镜检测结果图;
图12为本发明的工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
称取1-金刚烷乙酸(Ada-COOH)2.11mg,溶于5mL DMSO。称取20.81mg EDC和12.49mg NHS,分别溶于2mL DMSO中,先后将EDC溶液和DMSO溶液滴加到Ada-COOH溶液中,搅拌反应3h,得到活化的Ada-COOH溶液。称取第三代聚酰胺-胺树状大分子(G3)50mg,溶于5mLDMSO中。然后将上述经活化的Ada-COOH溶液逐滴加入到G3溶液中,室温下搅拌反应3天。待反应结束后,将反应溶液转移到截留分子量为1000Da的透析袋中,于磷酸盐(PBS)缓冲液中透析1天后,更换为超纯水透析2天。最后经冷冻干燥得到淡黄色粉末状产物G3-AD(M1),储存于-20℃。
称取21.82mgβ-CD和31.17mg CDI分别溶于5mL DMSO中,两者混合搅拌反应6h。称取第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5)溶于30mL DMSO中,然后将其缓慢滴加到上述溶液中,室温下搅拌反应60h。待反应结束后,将反应液转移至截留分子量为8000-14000Da的透析袋中,于磷酸盐(PBS)缓冲液中透析1天后,更换为超纯水透析2天。最后经冷冻干燥得到白色絮状产物G5-β-CD(M2),储存于-20℃。
称取干燥的M1 20mg,M2 10mg,分别溶于5mL超纯水中,然后将两者混合,室温下搅拌反应24小时,待反应结束后,将反应液转移至截留分子量为10000Da的透析袋中,于超纯水中透析3天。最后经冷冻干燥得到白色粉末状产物G5-β-CD/AD-G3(M3),储存于-20℃。
实施例2
对实施例1制备的M1、M2、M3进行表征。1H NMR表征结果如图1a所示,在化学位移1.6-1.9ppm处的质子峰代表金刚烷基团分子结构中的质子峰,化学位移2.2-3.4ppm处的质子峰代表G3中酰胺键上的质子峰,表明Ada-COOH已成功修饰在G3表面。通过对这两个区域中的质子峰进行积分得出每一个G3上面修饰了1.3个Ada分子;1H NMR表征结果如图1b所示,在化学位移2.3-3.2ppm处的质子峰代表G5中酰胺键上的质子峰,在化学位移3.5-4.1ppm以及5.1ppm处的质子峰代表β-CD分子结构中的质子峰,表明β-CD已成功修饰在G5表面。通过对G5和β-CD的质子峰区域进行积分,计算出每个G5表面修饰了8.7个β-CD分子。2D-NOESY表征结构如图2所示。化学位移1.6-1.9ppm处的金刚烷基团与化学位移3.5-4.1ppm处β-CD基团出现了明显的相关交叉信号,由此可以说明金刚烷基团与β-CD发生了相互作用,紧密结合。同时证明了主体单元G5-β-CD与客体单元G3-AD通过金刚烷与环糊精的主客体作用成功构建出了表面氨基的核壳超结构树状大分子G5-β-CD/AD-G3。AFM结果如图3所示,制备的M1、M2、M3形状接近球形,M1的粒径为3.1nm,M2的粒径为5.2nm,M3的粒径为8.4nm,由此可以进一步证明M1和M2通过主客体的自组装作用形成了粒径更大的超分子结构M3。TEM结果如图4所示,制备的M3平均粒径在8nm左右,与AFM结果相符。
实施例3
将实施例1所制备的3种材料M1、M2、M3以不同的N/P制备载体/pDNA复合物,并进行凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的1%的琼脂糖凝胶,室温放置待琼脂糖凝胶凝固。N/P比值分别为:0.125:1,0.25:1,0.5:1,1:1,2:1,5:1。每孔加1μg pDNA,配制载体/pDNA复合物,37℃下孵育30min。以不加载体的单独pDNA作为对照。制成载体/pDNA复合物后,将对应的复合物分别加到琼脂糖凝胶的孔中,在80V电压下,电泳30min。电泳结束后将凝胶放置于凝胶成像仪中对pDNA在凝胶中的迁移进行分析。结果如图5所示。三种材料均可在较低的N/P(N/P=2)下与pDNA很好复合,阻滞了pDNA的迁移。同时可以看到M2和M3在N/P=1时就表现出了对pDNA迁移的阻滞,具有更强的DNA压缩能力。压缩、包裹DNA的能力是将pDNA成功传递到靶细胞内的前提。
实施例4
将实施例1所制备的M3在不同N/P比条件下(0,1,5,10,20,40,60)分别与5μg pDNA制备成不同的载体/pDNA复合物,使总体积为100μL,室温下孵育30min,然后加入1mL PBS。通过马尔文激光粒度仪(Malvern,MK,633nm激光)对其水动力学直径进行表征,结果如图6所示。结果表明,在N/P=10时载体/pDNA复合物的粒径达到最大,然后随着N/P比的增加,复合物粒径下降。当N/P比为60时,复合物粒径为227nm。当复合物粒径在200nm左右时有利于复合物通过细胞内吞而进入细胞,有益于基因转染,因此选择N/P比为20,40,60进行后续基因转染效率的评价。
实施例5
以HeLa细胞为模型细胞来评价实施例1所制备的3种材料的细胞毒性。以8000/孔的密度将HeLa细胞种于96孔板中,在添加了100U/mL青霉素,100U/mL链霉素和10%FBS的100μL DMEM培养液中,37℃,5%CO2浓度下过夜培养。然后将培养基换成材料浓度分别为0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM、3000nM的含M1、M2、和M3/1μg pDNA复合物的细胞培养基与细胞共培养24h,随后加入含10μL CCK-8的DMEM培养基溶液,继续培养2h。随后,在测试波长450nm下于多功能酶标仪中测试吸光值,结果如图7所示。结果表明,随着材料浓度的增加,细胞存活率下降,但在一定范围内具有良好的细胞相容性。M1和M2通过自组装后形成的M3较M1的细胞毒性有明显的下降,这说明β-CD的修饰,以及超分子结构的形成降低了材料的细胞毒性。
实施例6
以HeLa细胞作为模型细胞,选用带有荧光素酶基因的质粒作为pDNA,以此作为模型评价实施例1制备的3种材料作为基因载体的基因转染效率。以5x 104/孔的密度将HeLa细胞种于24孔板中,在添加了100U/mL青霉素,100U/mL链霉素和10%FBS的100μL DMEM培养液中,37℃,5%CO2浓度下过夜培养。待细胞长满到整个孔板的70%-80%时,按照N/P值为20,40,60,制备载体/pDNA复合物,其中每孔中pDNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基,再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后更换含10%FBS的新鲜DMEM培养基,继续培养24h。培养结束后,将细胞裂解,并通过Promega公司的Luciferase assay来检测荧光素酶活性,结果如图8所示。结果表明,通过主客体自组装形成的超分子复合物M3在3种N/P下相比于自组装之前的反应单元均具有最高的基因转染效率。其中,在N/P为60时M3的转染效率是M2的20倍,是M1的170倍。这说明通过β-CD的修饰降低了细胞毒性,有利于基因的转染。另外,超分子结构的形成可能促进了细胞对载体/pDNA复合物的内吞,从而提高了基因转染效率。
实施例7
以HeLa细胞作为模型细胞,选用带有增强型绿色荧光蛋白基因的质粒作为pDNA,以此作为模型评价实施例1制备的3种材料作为基因载体时的基因转染效率。以5x 104/孔的密度将HeLa细胞种于24孔板中,在添加了100U/mL青霉素,100U/mL链霉素和10%FBS的100μL DMEM培养液中,37℃,5%CO2浓度下过夜培养。待细胞长满到整个孔板的70%-80%时,按照N/P值为20、40、60,制备载体/pDNA复合物,其中每孔中pDNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基,再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后更换含10%FBS的新鲜DMEM培养基,继续培养24h。培养结束后,用荧光显微镜观察,结果如图9所示。结果表明,与荧光素酶基因表达实验结果相一致,在不同N/P比下,主客体自组装形成的超分子复合物M3在3种N/P下相比于主客体单元均具有最高的绿色荧光强度,即具有最高的基因转染效率。
实施例8
以HeLa细胞作为模型细胞,选用带有Cy3标记的pDNA,以此为模型评价实施例1制备的3种材料作为基因载体时被细胞吞噬的效率。以1x 105/孔的密度将HeLa细胞种于12孔板中,在添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的100μL DMEM培养液中,37℃,5%CO2浓度下过夜培养。待细胞长满到整个孔板的70%-80%时,按照N/P比为60制备载体/pDNA复合物,其中每孔中pDNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基,再加入上述复合物与细胞共培养4h。培养结束后,胰酶消化,并收集细胞,采用流式细胞仪检测细胞对载体/pDNA复合物的内吞。结果如图10所示。结果表明,对照和未加载体的pDNA组都未检测到明显的荧光。主客体自组装形成的超分子复合物M3相比于主客体单元具有最高的荧光强度,说明M3有更高细胞内吞效率,这是其具有最高的基因转染效率的重要原因之一。此结果与以上基因转染效率实验的结果保持一致。
实施例9
以HeLa细胞作为模型细胞,选用带有Cy3标记的pDNA,以此为模型评价实施例1制备的3种材料作为基因载体时被细胞吞噬后的胞内定位。以1x 105/孔的密度将HeLa细胞种于12孔板中,在添加了100U/mL青霉素,100U/mL链霉素和10%FBS的100μL DMEM培养液中,37℃、5%CO2浓度下过夜培养。待细胞长满到整个孔板的70%-80%时,按照N/P比为60制备载体/pDNA复合物,其中每孔中pDNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基,再加入上述复合物与细胞共培养4h。培养结束后,采用激光共聚焦显微镜对结果进行观察。结果如图11所示。结果表明,转染4小时后,各载体均能负载pDNA进入细胞,到达细胞核周围。比较红色荧光点的数量和强度发现,主客体自组装形成的超分子复合物M3相比于主客体单元具有更强的红色荧光,这进一步印证了实施例8所得出的结果。
Claims (7)
1.一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法,包括:
(1)在溶有1-金刚烷乙酸Ada-COOH的DMSO溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酸亚胺NHS,搅拌反应3~5h,得到活化的Ada-COOH;然后将活化的Ada-COOH加入到溶有第三代聚酰胺-胺树状大分子G3的DMSO溶液中,搅拌反应3~4天,得到客体分子金刚烷修饰的G3-AD溶液;
(2)在DMSO溶液中分别加入β-环糊精β-CD和N,N’-羰基二咪唑CDI,然后将二者混合,搅拌反应6-7h,得到反应液;将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5溶解在DMSO中,然后滴加到反应液中,室温搅拌反应60-70h,得到主体分子β-环糊精修饰的G5-β-CD溶液;
(3)将步骤(1)、(2)所得的溶液透析,然后进行冷冻干燥处理,得到干燥的G3-AD、G5-β-CD;
(4)将步骤(3)得到的干燥的G3-AD、G5-β-CD按摩尔比1:10分别溶入超纯水中,混合搅拌反应24~28h,通过自组装作用得到表面氨基的核-壳超结构树状大分子G5-β-CD/AD-G3溶液;最后进行透析、冷冻干燥,得到G5-β-CD/AD-G3。
2.根据权利要求1所述的一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法,其特征在于:所述步骤(1)中的EDC/NHS与Ada-COOH的摩尔比为10:1;Ada-COOH与G3的摩尔比为1.5:1。
3.根据权利要求1所述的一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法,其特征在于:所述步骤(2)中的β-CD与CDI的摩尔比为1:10;β-CD与G5的摩尔比为24:1。
4.根据权利要求1所述的一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法,其特征在于:所述步骤(2)中的G5的DMSO溶液浓度为0.5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的透析具体为:G3-AD溶液以截留分子量为1000Da的透析袋透析;G5-β-CD溶液以截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析。
6.根据权利要求1所述的一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法,其特征在于:所述步骤(4)中的G3-AD的超纯水溶液的浓度为4mg/mL;G5-β-CD的超纯水溶液的浓度为2mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种主客体自组装作用构建表面氨基的核-壳超结构树状大分子的方法,其特征在于:所述步骤(4)中的透析具体为:以截留分子量为10000Da的透析袋透析。
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