CN103820498A - 一种基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体及其应用，包括重组慢病毒，在其内包含有携带SEQ.ID.NO.1所示的NICD1基因的表达载体。所构建的基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体能够制备抗骨质疏松的药物中，促骨髓间充质干细胞增殖并促其向成骨细胞分化。

Description

一种基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体及其应用

技术领域

本发明属于hBMSCs诱导增殖分化技术领域，涉及一种基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体及其应用。

背景技术

骨质疏松症是一种以骨量低下，骨微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。好发于55岁以上老年患者。《骨质疏松症防治中国白皮书》（2008年）指出，我国至少有6944万人患有骨质疏松，有2.1亿人罹患低骨量即存在骨质疏松症的风险。随着我国人口老龄化加剧，预计到2020年我国骨质疏松和低骨量患者将增加至2.8亿。因此，研究骨质疏松症的发病机制，预防和治疗骨质疏松症迫在眉睫。

目前骨质疏松症的研究，多是针对增强的破骨细胞骨吸收作用给予骨吸收抑制剂（雌激素、孕激素、选择性雌激素受体调节剂、双膦类药物、降钙素等），辅助以促进成骨的矿化剂（钙剂，活性维生素D等）。虽然雌激素补充替代（estrogen replacement therapy，ERT）对增加绝经后骨量（bone mineraldensity，BMD）效果明显，也能减少骨质疏松症患者骨折的发生率，但是其也增加了患者罹患乳腺癌、子宫内膜癌的发生率，更因其可以对血脂代谢产生影响，增加了患者心肌梗塞、中风、深静脉血栓，肺栓塞的发生率。双膦类（bisphosphonates，BP）药物被破骨细胞吸收后干扰破骨细胞的多个生化过程，抑制骨吸收，可以增加骨量，降低脆性骨折的发生率。但其也存在着诱发视力模糊，食道、胃溃疡，肾功能不全，血栓栓塞等并发症的危险。维生素D可以促进肠道、肾脏钙的吸收，但单独使用效果不理想。单纯补钙效果也不明显，骨密度（BMD）仅能增加1.13％～2.05％，而且一旦停药效果不能持续，且效果与剂量间关系不大。

最新的研究表明，骨质疏松症所引起的成骨活性减低，骨量减少常常伴发有骨髓中成脂活性增加，脂肪组织集聚。骨髓中成骨细胞和成脂细胞的共同祖细胞—骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成脂分化增强，成骨分化减弱是导致骨质疏松的另一种主要机制。

BMSCs的分化同时受到成骨分化因子—Runt相关转录因子2（Runx2）和成脂分化基因—过氧化物酶增殖体激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）调控。现有的研究表明，Runx2在骨形态发生蛋白（bonemorphogenetic protein，BMP）等上游分子的作用下促进下游Osterix等分子的表达，进而促进BMSCs分化为成骨细胞。而PPAR和CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP）等分子在其它调节因子的作用下促进脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding protein，aP2）等下游基因的表达，进而促进BMSCs成脂分化。

组蛋白去乙酰化酶（sirtuin type1，SIRT1）被激活后能抑制PPARγ的生成，抑制BMSCs成脂分化（Wang H，Qiang L，Farmer SR.Identification of adomain within peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulatingexpression of a group of genes containing fibroblast growth factor21that areselectively repressed by SIRT1in adipocytes.Mol Cell Biol.2008;28（1）:188-200）。庞婷婷等提出可将SIRT1作为切入点，利用高表达SIRT1开展抑制BMSCs成脂、促进成骨的研究，其实验结果尚未见公开报道。FanQ等着眼于骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化平衡，选择CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP-α）为靶基因，研究它在细胞成骨-成脂转分化过程中的调节作用。他们发现过表达C/EBPα可以抑制BMP-2诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化，进而提出通过抑制C/EBPα的表达而达到促进骨形成，抑制脂肪异常增生的研究，但其进一步的实验结果也未见报道。

羟固醇（Oxysterols）、淫羊藿酮（Epimedium-derived flavonoids）、三七总皂苷（Panax notoginseng saponins）等化合物和中药提取物均被报道具有抑制BMSCs成脂分化，促进其成骨分化的作用，但其作用机理并未被研究透彻。

Notch信号通路是一种在多细胞器官的发育中进化保守的信号通路。该信号的不同表达可以影响多种不同的细胞学进程，包括增殖、分化、凋亡、干细胞维护以及细胞转分化等。对于人和鼠，Notch信号系统有4个配体（Notch1-4）和5个受体（Jagged1-2、Delta-like1、3、4）[KOPAN R,ILAGANMX.The canonical Notch signaling pathway:unfolding the activation mechanism.Cell.2009;137:216–233.]。Notch信号通路要求细胞间的跨膜受体配体直接接触，才能将信号传递予细胞质内的Notch信号胞内域（Notch IntracellularDomain，NICD），进而进入细胞核内启动RBPj和MAML1,2,3，最终启动Hes1、Hey1等靶基因，发挥其生物学作用。Notch信号对于造血来源、神经来源、胰脏来源和肠来源等多种来源的干细胞自我更新、增殖和分化都十分重要。使用hBMSCs的体外实验证实Notch信号和Jagged1可以促进hBMSCs的增殖并调节其分化[Vujovic,S.,Henderson,S.R.,Flanagan,A.M.andClements,M.O.Inhibition of gamma-secretases alters both proliferation anddifferentiation of mesenchymal stem cells.Cell Prolif.2007;40,185-195.Oldershaw,R.A.,Tew,S.R.,Russell,A.M.,Meade,K.,Hawkins,R.,McKay,T.R.,Brennan,K.R.and Hardingham,T.E.Notch signaling through Jagged-1isnecessary to initiate chondrogenesis in human bone marrow stromal cells butmust be switched off to complete chondrogenesis.Stem Cells.2008;26,666-674.Fernando Ugartea,Martin Ryser,et al.Notch signaling enhances osteogenicdifferentiation while inhibiting adipogenesis in primary human bone marrowstromal cells.Experimental Hematology2009;37:867–875]。但这些研究都是使用的Notch信号的配体Jagged-1和/或Notch信号核内靶分子MAML-1来上调Notch信号，进而观察细胞的变化，而没有直接使用更直观有效的Notch信号胞内域NICD来上调Notch信号。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体及其应用，构建出可表达的Notch信号胞内域NICD1的慢病毒表达载体，可应用于促hBMSCs的增殖、成骨分化和骨质疏松症防治。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体，包括重组慢病毒，在其内包含有携带SEQ.ID.NO.1所示的NICD1基因的表达载体。

所述的重组慢病毒是由包装质粒混合物（Lenti-Easy Packaging Mix）和慢病毒载体质粒（Lentiviral Vector）包装而成，所述的携带基因的骨架载体表达载体为pGC-FU-INSERT-3FLAG，克隆位点为Age I和Nhe I。

所述的基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体在制备抗骨质疏松的药物中的应用。

所述的药物是能够促骨髓间充质干细胞增殖并促其向成骨细胞分化的药物。

所述的药物是能够提高骨髓间充质干细胞成骨分化中ALP的活性和骨基质矿化的药物。

所述的药物是能够提高成骨基因Runx2、Osterix表达水平的药物。

所述的基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体在制备预防抗骨质疏松的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明在Notch信号胞内域NICD1基因的基础上构建载体

本发明构建的NICD1表达质粒是一种高效的Notch信号表达质粒，该质粒在目的基因NICD1上下游含有pGC-FU-INSERT-3FLAG以及AgeI/NheI酶切位点，将载体用Age I和Nhe I进行双酶切回收载体片段，将NICD用Age I和Nhe I进行双酶切回收目的基因片段。载体与目的基因按摩尔比1：5连接过夜后转化TOP10大肠杆菌感受态细胞并平铺于含有卡那霉素(30g/m1)的LB培养基(Luria-Benani medium,LB)平板上，随机挑选阳性克隆扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定。这样有利于Notch基因功能的分析和蛋白质的表达，其他基因载体在原核扩增、真核表达时需要繁复的酶切鉴定具有反应简便、高保真的优点。

2、本发明同时生产出高效安全的NICD1慢病毒

病毒载体具有转染效率高的优点。目前约85%的基因治疗临床实验采用病毒载体。常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等，但是这些载体存在着潜在的致癌性、自身免疫原性以及目的基因容量小等的缺点。在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题，是无法高效转导非分裂期细胞，而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞，但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。

慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞，转移基因片段容量较大，目的基因表达时间较长，不易引发宿主免疫反应等诸多优点，以慢病毒载体系统的安全性甚至超过了目前临床试验正在使用的致癌性逆转录病毒载体。因此，慢病毒载体已成为基因治疗中载体研究的热点。本发明中生产的NICD1基因慢病毒是基于第3代慢病毒载体系统为基础的慢病毒生产体系，具有高效安全的特点。

3、本发明构建的NICD1慢病毒在hBMSCs成脂-成骨转分化中抑制成脂、促进成骨的作用

骨质疏松症患者骨髓内存在MSCs分化的失衡，过高的成脂活性和脂细胞聚集危害到成骨细胞的形成和骨形成。若能阻断MSCs向脂细胞分化的过程，或将骨髓中的脂细胞和潜在的“成脂前体细胞”转分化为成骨细胞，可能会达到抑制成脂，促进成骨的作用。

本发明细胞转分化实验证实NICD1慢病毒对hMSC成脂-成骨转分化具有促进作用：可以促进未分化hBMSCs细胞增殖和成骨分化。

可考虑将NICD1基因及其表达载体与缓释基质载体相结合（geneactivated matrix，GAM），通过局部注射的方式应用于骨质疏松症患者的股骨颈、腰椎或桡骨远端，以起到促进成骨，预防骨折的作用。

4、本发明构建的NICD1慢病毒能够避免服用骨吸收抑制剂（雌激素、孕激素、选择性雌激素受体调节剂、双膦类药物、降钙素等），克服了服用其所导致的副作用的风险。

附图说明

图1为PCR扩增目的基因的凝胶电泳图；

图2为RT-PCR（图A）与B.Western blotting（图B）验证NICD在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞内表达结果；

图3为NICD对于绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞增殖的影响；其中图A为转染NICD之前细胞形态不规则，生长较为分散；B为转染NICD后，细胞形态较为规则，成纤维样生长；C为MTT检测的生长曲线，D为MTT检测结果；

图4为3、7、14天时Realtime-PCR检测成骨的相关基因（Runx2、ALP以及Osterix）的表达情况；

图5为碱性磷酸酶染色、茜素红染色NICD对成骨相关基因的影响。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、人Notch1(NM_017617-3')胞内活性区域NICD开放阅读框序列（+921～+2409AA）过表达慢病毒载体构建

1.1真核表达载体酶切

①载体信息：以GV205作为骨架载体，具体的购于上海基凯基因化学技术有限公司，其中含有Ubi-MCS-3FLAG，以及AgeI/NheI酶切位点。

②酶切反应体系

将上述混合物置于37，2小时。

③琼脂糖凝胶电泳

吸取上述进行载体酶切后的产物20μl，加入上样缓冲液进行混合后，煮沸10分钟，取15μl加入到已经配置好的琼脂糖凝胶电泳中，浓缩胶浓度为5，分离胶浓度为15%，恒流20mA，电泳时间2小时，加入考马斯亮兰进行染色一小时后进行观察，然后使用脱色液脱

1.2目的基因片段的获取

以人Notch1(NM_017617-3')胞内活性区域NICD开放阅读框序列（+921～+2409AA）作为目的基因，其克隆按照以下步骤操作：

①目的基因引物设计如下

②PCR基因扩增目的基因片段，反应体系如下

③PCR反应程序

1.3对PCR产物进行酶切消化

获取PCR产物之后进行琼脂糖凝胶电泳分离，所扩增的目的基因其大小为2453bp，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，从图中可以了看出对于目的基因的PCR扩增成功。

大小：

酶切反应体系与1.1部分的酶切体系相同，在酶切。

1.4重组质粒构建

①PCR产物交换入线性化表达载体

以真核表达载体pGC-FU-INSERT-3FLAG作为骨架载体，具体的购于上海基凯基因化学技术有限公司，图谱见其说明书。

步骤：将载体用Age I和Nhe I进行双酶切回收载体片段，将NICD用Age I和NheH I进行双酶切回收目的基因片段。载体与目的基因按摩尔比1：5连接过夜后转化TOP10大肠杆菌感受态细胞并平铺于含有卡那霉素(30g/m1)的LB培养基(Luria-Benani medium,LB)平板上，随机挑选阳性克隆扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定。经酶切鉴定正确的克隆送公司测序。

②制备感受态细胞

A.从在37培养16小时的平板中挑取单菌落TOP10大肠杆菌感受态细胞，购自Tiangen公司，将其转入含有100ml LB

培养基的烧瓶中，与37进行摇菌；

B.3小时后，在无菌条件现将细菌转移到预冷的无菌50ml离心管内，置于冰上15分钟，使得培养物冷却至0；

C.于4离心10分钟（4000转/分），弃去培养液回收细胞；

D.将以上回收细胞放置于冰浴上，使用15ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬以上细胞。

E.于4离心10分钟（4000转/分），弃去培养液回收细胞，使用2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬以上细胞，将细胞分为小份，放于-70保存，从而完成感受态细胞的制备。

③转化

A.用冷却的无菌吸头吸取200感受态细胞悬液转移到微量离心管中，每管加入已经制备好的连接液10，混匀，于冰上放置30分钟。

B.将微量离心管静置于已经预加热到42的水浴锅中的EP管架上，放置90s，然后迅速将EP管移入冰块中，使细胞冷却2分钟。

C.每管加入已经预热至37的LB培养基800，而后置于30孵箱内孵育45分钟。

D.吸取150已经转化的感受态细胞转移到AMP（+）的LB琼脂培养基中，然后置于室温直至液体被吸收。

E.与37将平皿导致培养16小时候，挑出长出的单克隆进行后续PCR鉴定。

④阳性克隆PCR鉴定如下图。相关PCR同前。

1.4阳性克隆测序

在获取阳性克隆之后，提取DNA并进行测序，具体的测序交由上海基凯基因化学技术有限公司完成。

阳性转化子PCR确认目的基因确实插入成功，而且又降低了检测结果假阳性的可能。若同时检测到阳性转化子和目的基因的序列，那么假阳性的可能性将会非常小。阳性克隆测序是为了检测转入的基因序列与目的基因之间是否存在突变，若存在无意义突变，可忽略；若存在有意义的突变，则需要进一步的调整和修饰，以确保载体中的目的基因的准确性。

测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，包含目的基因前后的一些非目的基因的编码序列，而目的基因为2453bp。

1.5慢病毒包装与滴度检测

病毒包装是将所构建的载体，采用第3代慢病毒载体系统（请说明具体的名称、构成）来进行构建，具体的病毒包装（按操作说明书进行即可）、滴度检测交由上海基凯基因化学技术有限公司完成。

所构建的慢病毒的滴度为2.00E+8TU/ml。

转染病毒在293T细胞内的表达结果表明，目的基因融合蛋白大小：91KD。

2、人骨髓间充质干细胞的分离和培养

征得无血液系统及感染性疾病志愿者同意，经医学伦理委员会批准（批准号：20110405-5）。临床髋关节置换，扩髓时干骺端的红骨髓。20ml注射器吸取5～10ml髂骨松质骨内骨髓，注射器内用稀释的2500U/ml肝素钠0.5ml进行涮洗，以防止抽出骨髓凝集。将无菌肝素化骨髓5～10ml，与等体积培养基（培养基提前预热，也可用无菌PBS，使抽出骨髓达到完全悬浮状态，利于离心）于离心管里充分混合，离心1000转，5min。离心结束可见试管内混合物分为三层。用吸管吸取脂肪层和血清层，然后将血液沉积层吸出（新吸管，若出现血凝块，小心吸出弃去，因其影响离心效果，小骨块可以保留，继续后续步骤），细胞悬液贴壁缓慢注入到预置有等体积Ficoll细胞分离液试管内，使两者间形成清晰接口。2500r/min离心25min，此时可见试管内分为四层。吸取中间的乳白色云雾状单核细胞层，PBS缓冲液充分漂洗（800r/min离心5min）3次，弃掉上清。重悬于加入含20%FBS及100U/ml青链霉素的α-MEM培养液中，接种于75cm²培养瓶（可适量增加培养液，因搁置时间较长）。置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中，（完全静止，切勿移动）7～10天后（视骨髓量而定）全量换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后每3天全量换液一次。待细胞汇合成单层后加入胰酶消化，以1:2～3(视骨髓量而定)进行传代接种培养（此为第一代p1），以此类推。骨髓穿刺分别获得一名76岁绝经后骨质疏松患者髂骨骨髓，经密度梯度离心法分离并培养其骨髓间充质干细胞至P3（传代第三代）用于实验。

3、绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞NICD1转染

①细胞处理：取P3细胞，用0.25%胰酶常规消化细胞，离心收集细胞沉淀，重悬细胞，并以10^5个细胞密度接种于六孔板中进行常规培养；

②隔日观察细胞，待细胞生长融合至60%左右后，按照MOI=10加入病毒稀释液2X10^8TU/ml,每孔加10μl，按照1：1000的比例加入Polybrane（polybrene能显著提高病毒对细胞的接触并提高病毒的感染效率，在一般细胞上有3-4倍的作用，对有些细胞可以提高10-20倍），同时使用无双抗培养基进行常规培养；

③12小时以后进行半量换液，24小时候进行全量换液，培养条件同前。

4、总RNA提取

采用OMEGA E.Z.N.A.Total RNA Kit I试剂盒提取细胞内RNA。

实验步骤：

①细胞处理：取P3细胞一瓶，倒掉培养基，尽可能的使其中的培养基去除干净，直接加入配制好的TRK裂解液600μl，室温放置2-3min，用枪头反复冲洗，以达到完全消化。

②将以上细胞裂解物加入1.5ml离心管中（DEPC水处理），加入等体积的70%配制好的乙醇，上下轻柔晃动混匀。

③将试剂盒中的离心柱加入收集管中，并将上述混合液体加入离心柱，

10000rpm离心1.5min。然后弃去收集管中液体，加入350μl的RNAWash buffer I冲洗离心柱，10000rpm离心1.5min离心弃收集管中液体。此步骤重复一次。

④再加入350μl的RNA Wash buffer II冲洗柱子，10000rpm,离心1.5min，弃收集管中液体。此步骤重复一次。弃离心管中液体后将柱子放入收集管中空离心一次。

⑤丢弃收集管，将离心柱放入干净的1.5ml离心管中（自备），加入30预热的DEPC水，在室温下放置10min，或者37℃放置5min，10000rpm离心2min，也可再次将洗脱液加入到离心管中再次洗脱。

⑥将获得的总RNA进行浓度测定后，放入-80保存，以备后期的反转录和基因表达检测。

5、RNA反转录

采用TaKaRa Code:DRR037A试剂盒提取进行RNA反转录。

实验步骤：

①按下表配制反转录反应液（反应液配制请在冰上进行）

②反转录反应条件如下：

1)37℃15min（反转录反应）

2)85℃5sec(反转录酶的失活反应)

将得到的RT反应液加入到下一步的Real Time RT-PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time RT-PCR反应体积的1/10（v/v)量。

6、实时定量PCR（Realtime-PCR）

采用SYBR Green进行相对定量分析基因表达，实验按照Ct解析法来进行设计，主要测定在人骨髓间充质干细胞表达的Notch信号通路关键分子（Notch1，Jagged1以及Hes1），来判断Notch信号通路在转染与未转染两组之间是否存在差异，引物又上海生工生物工程公司合成，引物如下表：

实验步骤：

①RT-PCR反应体系如下表：

②Realtime-PCR反应程序(两步法)

③采用2-△△Ct值法对于RT-PCR结果进行分析。

7、细胞总蛋白提取

①待各组细胞生长特定天数后，将六孔板从细胞培养箱中取出，倾斜放于事先准备好的冰块上，吸出其中培养基。

②用预先冷却的PBS轻柔的冲洗细胞3遍，每遍5分钟。

③按RIPA：PMSF=1：1的比例混匀，将混合液加入到六孔板孔中，使其能够充分覆盖孔中细胞，在冰上静置10分钟，使用细胞刮反复刮除细胞，同时转动六孔板，使所有区域细胞均被刮下，使细胞充分裂解，反复15分钟左右。

④将细胞裂解混合液移至1.5ml EP管中，4℃、12000rpm离心分钟。

⑤取上清分装于0.5ml EP管中,进行蛋白定量，同时向其余的蛋白样品中加入其1/4体积（5X上样缓冲液）的上样缓冲液，煮沸5分钟。

⑥12000rpm离心5分钟，即为制备好的蛋白样品。保存于-80℃冰箱备用。

8、Western blotting检测

①按下表配制5%Western blotting浓缩胶

②按下表配制8%Western blotting分离胶

③灌制Western blotting SDS-PAGE胶，放置30分钟后，蛋白样品上样，每个蛋白样品30μg。

④进行SDS-PAGE电泳，进行恒压电泳，电压设置分别为：浓缩胶80V，30分钟，分离胶120V，60分钟。

⑤转膜：从上到下分别按照滤纸-浓缩胶-NC膜-滤纸的顺序进行放置，转膜电压为20V，30分钟。

⑥转完后将膜用1×丽春红染液染5min。然后用水冲洗掉没染上的染液以确认蛋白转膜成骨。

⑦将NC膜浸入抗体封闭液中，置于摇床上室温摇晃30分钟。

⑧封闭一抗：将相应的一抗用TBST稀释（1：1000）至适当浓度，于4孵育过夜，用TBST在室温摇床上洗三次，每次15分钟。

⑨封闭二抗：同上方法将二抗使用TBST稀释（1：1000）至适当浓度，室温下孵育60分钟后，用TBST在室温摇床上洗两次，每次10分钟；再用TBST洗一次，每次10分钟。进行化学发光反应。

⑩按照A液：B液=1：1进行混合，滴于NC膜表面。然后进行曝光，显影并拍照。

通过Realtime-PCR验证Notch1胞内段NICD在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞内稳定表达，同时通过检测Flag蛋白表达情况间接的反应NICD蛋白的表达情况，检测结果如图2所示，其中表明从RT-PCR检测的基因水平与Western blotting检测的蛋白水平均表明NICD在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞内稳定表达，可以进一步验证其对细胞增殖及分化的影响。

9、细胞增殖实验（MTT与平板克隆实验）

MTT实验是一种检测细胞存活与生长的方法。其根据在活细胞当中，线粒体内的琥珀酸脱氢酶（SDH）能够与MTT发生反应产生蓝紫色的结晶沉积于细胞中，而死细胞无此功能的原理。通过DMSO溶解该结晶后，在490nm波长处检测吸光度值，从而了解细胞生长情况。具体步骤：

①细胞处理：取P3细胞，用0.25%胰酶常规消化细胞，离心收集细胞沉淀，重悬细胞，并以10^4个细胞密度接种于96孔板中，将细胞分为以下三种培养基：

A.NICD转染组；

B.阴性对照转染组；

C.空白对照组。

隔日换液。

②分别在第1～7天取出96孔板，每孔加入MTT20μl。

③37℃孵育4小时后，弃去孔内上清，然后每孔加入DMSO，室温下震荡10分钟，使得洁净完全溶解。

④在酶联免疫分析仪上，选择波长490nm测定吸光度值。

平板克隆实验可以反映单个细胞形成克隆的能力，进而间接反映细胞增殖状况，具体步骤：

①细胞处理：取P3细胞，用0.25%胰酶常规消化细胞，离心收集细胞沉淀，重悬细胞，并以100个细胞密度接种于6孔板中，十字摇晃，使得细胞充分分散，将细胞分为以下三种培养基：

A.NICD转染组；

B.阴性对照转染组；

C.空白对照组。

②培养21天后，弃去培养基，使用预冷的PBS将细胞洗涤三次，然后加入预冷的多聚甲醛，室温下固定30分钟。

③加入吉姆萨染液，室温下进行染色30分钟，然后晾干拍照，并计数。

④计算克隆形成率：克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）100%

通过转染NICD改变绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的Notch信号通路，并使用Negative control（NC）作为阴性对照，我们发现当通过NICD慢病毒转染使得Notch信号通路激活后，绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞形态上有原先的不规则形态以及宽大扁平的形态逐渐转变为形态较为规则，成纤维样生长，同时研究Notch信号通路对于绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞增殖的影响，通过MTT与平板克隆实验进行评估，发现转染后细胞的增殖能力有所增加；检测结果如图3所示，其中A.转染NICD之前细胞形态不规则，生长较为分散；B.转染NICD后，细胞形态较为规则，成纤维样生长；C及D为MTT检测结果；平板克隆实验证明Notch信号通路激活后可以促进绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的增殖。

10、人骨髓间充质干细胞不同条件下成骨诱导

①细胞处理：取P3细胞，用0.25%胰酶常规消化细胞，离心收集细胞沉淀，重悬细胞，并以10^5个细胞密度接种于六孔板中进行常规培养。

②隔日观察细胞，待细胞生长融合至60%左右后，将细胞分为以下三种培养基：

A.NICD转染组；

B.阴性对照转染组；

C.空白对照组。

以后隔日更换相关培养基。

③分别在成骨诱导的第3、7，14天检测相关Notch信号通路分子的表达情况。在第7天进行ALP染色，第14天进行茜素红染色。

改变绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞Notch信号通路后，分别在成骨诱导3、7、14天时通过Realtime-PCR检测成骨的相关基因，包括Runx2、ALP以及Osterix的表达情况，结果如图4所示，发现NC组与普通成骨组表达无差异，但是NICD转染后，成骨基因Runx2以及Osterix表达水平显著增高，P0.05，有统计学差异。

Runx2、ALP以及Osterix三个基因只是说明hBMSCs的成骨分化性能的，Runx2是成骨分化早期的指标，ALP是分化中期的指标，Osterix是成骨分化晚期的指标。在这里检测只是为了说明在慢病毒转染后，hBMSCs的Notch信号上调，确实可以促进其向成骨方向的分化。这里并不是为了说明Notch信号与这三种基因有何相关性，这三种基因只是作为成骨分化的检测指标出现。也可以作为Notch信号上调后促进hBMSCs成骨分化的下游基因，可检测出其确有的变化。

11、成骨碱性磷酸酶染色

①细胞成骨诱导7天后，PBS进行冲洗三遍，4℃多聚甲醛固定30分钟，PBS再重新三遍，每次5分钟，使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对于碱性磷酸酶显色。

②按照BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒说明书配置染色液。

③PBS洗毕后，加入适量的已配制好的BCIP/NBT染色液，以刚好可以铺盖细胞表面为准。

④37℃避光保存30分钟。

⑤去除BCIP/NBT染色液，使用PBS清洗三遍终止染色，并拍照观察。

12、茜素红染色

茜素红是一种阴离子染料，其能够与钙离子通过螯合作用形成复合物产生橘红色的沉积，即钙结节，进而识别组织细胞中的钙盐成分。

①茜素红染液的配制：称取0.1g茜素红溶于Tris-HCl100ml（PH=8.3）中，4℃保存。

②将以上成骨培养组培养14天后，弃去培养基，使用预冷的PBS将细胞洗涤三次，然后加入预冷的多聚甲醛，室温下固定30分钟。

③加入事先配制好的茜素红染液，室温下进行染色5分钟，然后晾干拍照。

在基因水平上对于成骨分化的影响之后，进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色，从而明确骨基质矿化情况。检测结果如图5所示，结果与对成骨相关基因的影响相似。结果表明Notch信号通路激活后可以显著提高绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化中ALP的活性和骨基质矿化能力。

上述实验表明，从基因水平以及大体染色观察，均表明Notch信号通路可以上调绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞已经减弱的增殖和成骨能力。

Claims (7)

1.一种基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体，其特征在于，包括重组慢病毒，在其内包含有携带SEQ.ID.NO.1所示的NICD1基因的表达载体。

2.如权利要求1所述的基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体，其特征在于，所述的重组慢病毒是由包装质粒混合物（Lenti-EasyPackaging Mix）和慢病毒载体质粒（Lentiviral Vector）包装而成，所述的携带基因的骨架载体表达载体为pGC-FU-INSERT-3FLAG，克隆位点为Age I和Nhe I。

3.权利要求1所述的基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体在制备抗骨质疏松的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物是能够促骨髓间充质干细胞增殖并促其向成骨细胞分化的药物。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的药物是能够提高骨髓间充质干细胞成骨分化中ALP的活性和骨基质矿化的药物。

6.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的药物是能够提高成骨基因Runx2、Osterix表达水平的药物。

7.权利要求1所述的基于Notch信号胞内域NICD1构建的慢病毒表达载体在制备预防抗骨质疏松的药物中的应用。

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