CN105132461A - 共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种共表达SAL-2基因和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒载体的构建方法及重组腺病毒和应用，采用从金黄色葡萄球菌噬菌体基因组和人乳体细胞总RNA中分别扩增出的SAL-2基因和hLYZ基因，将获得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含上述目的基因的重组腺病毒质粒Ad-SAL-LYZ；将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得高滴度的重组腺病毒；评价SAL-2基因和hLYZ基因在腺病毒介导下对奶牛乳房炎主要致病菌的联合抑制作用。

Description

共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用

技术领域

本发明涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。

背景技术

奶牛乳房炎又被称为奶牛乳腺炎，是奶牛乳腺受到外界刺激或致病菌感染时所发生的一种炎症反应。其不仅会引起奶牛产乳量的下降，缩短奶牛的更替周期，严重时甚至会造成患病奶牛泌乳能力的完全丧失。因此，奶牛乳房炎的临床防治却是一直困扰奶牛养殖业的一大难题。目前该病的防治主要通过提过规范化养殖管理及使用抗生素和化疗药物，但由于不同地区致病菌的差异以及抗生素等的长期不规范使用，在治疗过程中产生的细菌耐药性等问题常常给地区性奶牛乳房炎的治疗带来困难。因此，临床上亟需一种新的研究策略来防治奶牛乳房炎，应对以上问题。

目前，随着基因疗法的日益兴起，使用基因药物代替常规抗生素预防和治疗奶牛乳房炎，已成为应对抗生素滥用导致的细菌耐药性增强等一系列问题的研究重点和热点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。将SAL-2对金黄色葡萄球菌的广谱抑菌效果、hLYZ广泛高效抑菌且不会损伤哺乳动物细胞的特性和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，构建出可以共表达上述基因的重组腺病毒，最终检验在腺病毒介导下SAL-2和hLYZ对奶牛乳房炎主要致病菌的联合抑菌作用。为进一步利用重组腺病毒在体内外抑制奶牛乳房炎致病菌的生长及研制奶牛乳房炎治疗和预防疫苗奠定实验基础。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：

1)从金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA和人乳体细胞总RNA中分别扩增出SAL-2基因序列GI:NC_009875和hLYZ基因序列GI:NM_000239；

所述的SAL-2基因和hLYZ基因的扩增包括：以SAL-FSEQIDNO：1和SAL-RSEQIDNO：2为引物，以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA为模版，扩增SAL-2基因序列；以LYZ-FSEQIDNO：3和LYZ-RSEQIDNO：4为引物，以人乳体细胞总RNA为模版，扩增hLYZ基因序列；以rSAL-FSEQIDNO：5和rSAL-RSEQIDNO：6为引物，以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA为模版，扩增两端为不同限制性酶切位点的SAL-2基因序列；

2)将获得的目的基因分别克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ；

3)将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-SAL-LYZ。

所述的构建共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒。

所述的构建共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒在防治乳房炎小鼠模型中细菌性疾病生物制品方面的应用。

本发明的有益效果是：SAL-2对金黄色葡萄球菌的广谱抑菌效果、hLYZ广泛抑菌且不会损伤动物细胞的特性和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，构建出可以共表达上述基因的重组腺病毒，检验在腺病毒介导下SAL-2和hLYZ基因对奶牛乳房炎小鼠模型主要致病菌的联合抑菌作用。通过检测重组腺病毒在HEK293细胞中表达蛋白对大肠杆菌(K88)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、停乳链球菌(ATCC9809)和无乳链球菌等多株乳房炎致病菌的抑菌活性和最小抑菌浓度(MIC)，综合评价了重组腺病毒对奶牛乳房炎小鼠模型主要致病菌的抑菌作用，研究结果显示重组腺病毒在体外表达的目的蛋白可以有效抑制除K88之外的其他菌株，且葡萄球菌最为敏感。本发明最终研制出一种针对乳房炎动物模型细菌性疾病的广谱疫苗。

附图说明

图1是SAL-2和hLYZ基因PCR/RT-PCR扩增结果(M:DL250bpDNA分子质量标准；1：SAL-2基因PCR扩增产物；2：hLYZ基因RT-PCR扩增产物)。

图2是腺病毒穿梭载体的PCR扩增结果(M：DL250bpDNAMarker；1：SAL-2基因PCR扩增产物；2：hLYZ基因PCR扩增产物；3：SAL-LYZPCR扩增产物)。

图3是腺病毒穿梭载体双酶切鉴定结果(M：DL1kbDNAMarker；1：pShuttle-LYZ经ScaI和XhoI的双酶切产物；2：pShuttle-SAL经ScaI和XhoI的双酶切产物；3：pShuttle-SAL-LYZ经BglII和XhoI的双酶切产物；4：pShuttle-SAL-LYZ经ScaI和XhoI的双酶切产物；5：pShuttle-SAL-LYZ经BglII和NotI的双酶切产物)。

图4是重组腺病毒质粒的电泳结果(M：DL1KbDNAMarker；1：重组腺病毒质粒pAd-SAL；2：重组腺病毒质粒pAd-LYZ；3：重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ；4：重组腺病毒质粒pAd-GFP)。

图5是重组腺病毒质粒的PacI酶切鉴定结果(M：DL1KbDNAMarker；1：重组腺病毒质粒pAd-SAL的PacI酶切产物；2：重组腺病毒质粒pAd-LYZ的PacI酶切产物；3：重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ的PacI酶切产物；4：重组腺病毒质粒pAd-GFP的PacI酶切产物)。

图6是重组腺病毒质粒转染HEK293细胞产生CPE图(10×)(A：正常HEK293细胞图；B：重组腺病毒质粒pAd-SAL转染HEK293细胞CPE图；C：重组腺病毒质粒pAd-LYZ转染HEK293细胞CPE图；D：重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ转染HEK293细胞CPE图；E：重组腺病毒质粒pAd-GFP转染HEK293细胞CPE图)。

图7是重组腺病毒感染HEK293细胞荧光检测图(20×)(A：重组腺病毒Ad-SAL感染HEK293细胞后24h荧光图；B：重组腺病毒Ad-LYZ感染HEK293细胞后24h荧光图；C：重组腺病毒Ad-SAL-LYZ感染HEK293细胞后24h荧光图；D：重组腺病毒Ad-GFP感染HEK293细胞后24h荧光图)。

图8是重组腺病毒感染HEK293细胞后经RT-PCR检测目的基因的结果图(M：DL250bpDNAMarker；1：重组腺病毒Ad-LYZ感染后RT-PCR检测hLYZ基因；2：重组腺病毒Ad-SAL感染后RT-PCR检测SAL-2基因；3：重组腺病毒Ad-SAL-LYZ感染后RT-PCR检测SAL-2基因；4：重组腺病毒Ad-SAL-LYZ感染后RT-PCR检测hLYZ基因；5：重组腺病毒Ad-SAL-LYZ感染后RT-PCR检测SAL-LYZ基因)。

图9是Westernblotting检测重组腺病毒感染HEK293细胞后各目的蛋白的表达情况。

图10是BCA定量方法测定重组腺病毒感染HEK293细胞后蛋白提取物浓度所绘制的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

随着分子生物学、免疫学、病理学及相关学科的发展，基因治疗现已成为疾病防治研究的热点。目前，腺病毒(adenovirus,Ad)载体疗法是基因治疗中最有前景的基因转移方法之一，它能有效的将外源基因传递到各种靶细胞或组织中，载体的构建和操作简单，宿主范围广，感染性强，可经不同途径进入不同组织，还能感染分化后的非分裂期细胞。

大量研究结果表明，内溶素(virolysin)是噬菌体感染宿主菌后实现裂解功能的主要成分，其通过在感染后期水解宿主菌细胞壁成分间的连接键而达到裂解细菌的目的，对无细胞壁机构的机体细胞无损伤作用。内溶素对细菌存活所必须的细胞壁糖基有着较高的亲和力，在快速高效杀灭细菌的同时，细菌很难对内溶素产生抗性，因此，内溶素应用于细菌性疾病的防治拥有快速、高效、安全且不易产生耐药性等优点。SAL-2是由短尾病毒科的金黄色葡萄球菌噬菌体SAP-2的第14个开放阅读框编码的内溶素蛋白，研究表明其对14种不同来源的多种葡萄球菌均具有良好的抑菌作用，同时可以有效去除金黄色葡萄球菌外的菌膜，有效抑制含有菌膜的金黄色葡萄球菌的生长，所有以上特性均表明SAL-2是葡萄球菌性疾病的优选防治基因。

人溶菌酶(Humanlysozyme，hLYZ)是c型溶菌酶的一种，由单核细胞和粒细胞持续合成分泌，与其他激素或维生素以复合物的形式存在并参与免疫反应，最终随机体眼泪、鼻涕、唾液、尿液和乳汁等分泌物排出，其在乳汁、唾液和鼻涕等分泌物中含量较高。hLYZ通过水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4-糖苷键，在内部渗透压的作用下胀裂细胞，从而起到裂解细菌的作用。hLYZ在人乳中的含量很高，是牛乳中溶菌酶含量的3000倍。研究还发现，溶菌酶对革兰氏阳性菌具有直接的溶解作用，在分泌性IgA和补体参与下，对革兰氏阴性菌有间接的溶解作用。与SAL-2相似的是，hLYZ不仅具有广谱的抗菌活性，而且对人和动物细胞没有毒性，安全且不易产生耐药性，因此，选择上述两个基因构建重组腺病毒，利用腺病毒载体的高效表达活性，实现目的蛋白对多种细菌的协同抑菌作用。

本发明构建共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒的方法，包括以下步骤：

1)金黄色葡萄球菌噬菌体内溶素SAL-2基因和人溶菌酶hLYZ基因的克隆；

2)共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒质粒的构建；

3)共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒质粒的包装与鉴定；

4)重组腺病毒介导杀伤奶牛乳房炎主要致病菌的体外抑菌效果评价。

具体包括步骤如下：

1)从金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA和人乳体细胞总RNA中分别扩增出SAL-2基因序列GI:NC_009875和hLYZ基因序列GI:NM_000239；

所述的SAL-2基因和hLYZ基因的扩增包括：以SAL-FSEQIDNO：1和SAL-RSEQIDNO：2为引物，以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA为模版，扩增SAL-2基因序列；以LYZ-FSEQIDNO：3和LYZ-RSEQIDNO：4为引物，以人乳体细胞总RNA为模版，扩增hLYZ基因序列；以pSAL-FSEQIDNO：5和pSAL-RSEQIDNO：6为引物，以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA为模版，扩增两端为不同限制性酶切位点的SAL-2基因序列；

2)将获得的目的基因分别克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ；

3)将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-SAL-LYZ。

所述的构建共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒。

所述的构建共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒在防治小鼠细菌性疾病生物制品方面的应用。

也就是说：从金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA和人乳体细胞总RNA中分别扩增出SAL-2基因和hLYZ基因；将获得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含上述目的基因的重组腺病毒质粒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SAL-LYZ；将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒；应用RT-PCR、Westernblotting对重组腺病毒在HEK293细胞中表达情况进行鉴定；通过荧光显微技术检测病毒感染HEK293细胞后的形态变化；利用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法纯化病毒并测定其滴度；将获得的高滴度重组腺病毒体外转染HEK293细胞，通过组织活性蛋白提取试剂盒提取细胞内表达蛋白并通过BCA法测定蛋白浓度。分别通过纸片法和试管二倍稀释培养法测定待测菌株对蛋白提取液的敏感性及最小抑菌浓度(MIC)。最后根据测定的MIC检测在该浓度下共表达双蛋白对待测菌株的抑菌活性并与常用抗生素进行比较，评价在腺病毒载体介导下共表达的SAL-2和hLYZ对奶牛乳房炎主要致病菌的体外抑菌效果。

下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：

1材料与方法

1.1SAL-2基因和hLYZ基因的扩增

收集采集牛奶前清洗乳房下来的污水，4℃1000×g离心10min，去除其中所包含的细菌、杂质等污染物。随后用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，进一步去除其中所含有的细菌，并进行无菌检测。通过三次循环富集法得到高浓度的噬菌体原液，常规双层琼脂培养平板培养的方法对噬菌体进行筛选和纯化。参考《分子克隆实验指南》中λ噬菌体基因组DNA的提取方法提取所分离噬菌体基因组。根据Genebank中SAL-2基因序列(NC_009875)，设计一对PCR扩增引物，并进行目的片段的扩增，将扩增产物克隆至pMD19-T载体上，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-SAL，于-20℃保存备用。

采用常规离心法，通过不同的离心力和离心时间分离并收集乳汁中的体细胞，加入1mLTrizol试剂，按照产品说明书操作，提取总RNA。根据GenBank中的人溶菌酶hLYZ基因序列(NM_000239)，设计一对RT-PCR扩增引物，按Takara公司PrimeScript^TMOneStepRT-PCRkit说明书采用一步法进行hLYZ基因序列的扩增，将扩增产物克隆至pMD19-T载体上，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-LYZ，于-20℃保存备用。

PCR(反应体系见表1)、RT-PCR扩增(反应体系见表2)和T-A克隆(反应体系见表3)，引物序列见下表4。

表1PCR反应体系

注：反应程序：95℃，预变性5min；{94℃，1min；60℃，50s；72℃，1min}30个循环，72℃延伸10min。4℃保存备用。

表2RT-PCR反应体系

注：反应程序：50℃，1h，94℃，预变性5min；{95℃，1min；60℃，50s；72℃，1min}30个循环，72℃延伸10min。4℃保存备用。

表3T-A克隆连接体系

表4扩增目的片段的引物

1.2亚克隆穿梭腺病毒载体的构建

回收纯化产物SAL-2基因片段及载体pShuttle-IRES-hrGFP-2分别用ScaI、XhoⅠ进行双酶切。将双酶切获得的目的基因SAL-2与pShuttle-IRES-hrGFP-2相连，16℃连接过夜。连接反应体系为10×T₄DNALigaseBuffer2.0μL，载体片段4.0μL，目的片段10.0μL，T4DNALigase0.5μL。经卡那霉素抗性筛选，菌液PCR、酶切及测序鉴定，构建pShuttle-SAL重组穿梭质粒。

回收纯化产物hLYZ基因片段及载体pShuttle-IRES-hrGFP-2分别用ScaI、XhoⅠ进行双酶切。将双酶切获得的目的基因与pShuttle-IRES-hrGFP-2相连，16℃连接过夜。连接反应及后续鉴定参照上述，构建pShuttle-LYZ重组穿梭质粒。

回收纯化产物pSAL-2基因片段及载体pShuttle-LYZ分别用BgIⅡ、NotI进行双酶切。将双酶切获得的目的基因与pShuttle-LYZ相连，16℃连接过夜。连接反应及后续鉴定参照上述，构建pShuttle-SAL-LYZ重组穿梭质粒。

1.3重组腺病毒质粒的构建

用限制性内切酶PmeⅠ分别酶切pShuttle-SAL、pShuttle-LYZ、pShuttle-SAL-LYZ和pShuttle-IRES-hrGFP-2，使其线性化。37℃酶切过夜，0.7％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，切胶回收目的片段(用去离子水洗脱)。取线性化1μg穿梭载体与1μgpAdEasy-1质粒共转化BJ5183感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑取针尖样小菌落进行菌液PCR筛选及PacⅠ酶切鉴定，获得同源重组腺病毒质粒，命名为pAd-SAL、pAd-LYZ、pAd-SAL-LYZ、和pAd-GFP。

1.4重组腺病毒的包装

重组腺病毒质粒的质粒提取按照Tiangen质粒大提试剂盒说明书进行。取经PacⅠ酶切重组腺病毒质粒5μg，由12.0μL脂质体Lipofectamine2000介导，转染HEK293细胞，包装后获得重组腺病毒。利用RT-PCR检测目的基因mRNA转录，Westernblotting检测目的蛋白的表达，通过荧光显微镜检测重组腺病毒的细胞转染情况，对重组腺病毒转染HEK293细胞的情况进行鉴定；采用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法纯化所扩增的病毒，参照TCID₅₀法进行病毒滴度测定。

1.5重组腺病毒介导目的蛋白的体外抑菌实验

为评价共表达SAL-2和hLYZ蛋白的重组腺病毒在动物细菌性疾病基因防治中的作用，本研究选择了包括金黄色葡萄球菌等在内的五种菌株为研究对象，分别为大肠杆菌(K88)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、停乳链球菌(ATCC9809)和无乳链球菌。将构建成功的高滴度重组腺病毒感染HEK293细胞，通过组织活性蛋白提取试剂盒提取细胞内表达蛋白，观察目的蛋白对待测菌株的体外抑菌活性。

实验中利用纸片法检测待测菌株对目的蛋白的敏感性，通过组织活性蛋白提取试剂盒获得在HEK293中表达的目的蛋白，通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白提取液的浓度。将直径为6mm的无菌圆滤纸片浸泡在细胞蛋白提取液中，过夜后自然风干。将风干的滤纸片按照正三角形贴于制备的含有待测菌株的琼脂平板上，37℃恒温恒湿培养16～18h后通过游标卡尺测量抑菌圈直径并记录数据。根据抑菌圈的直径来初步判定待测菌株对目的蛋白的敏感性：抑菌圈直径大于15mm为高度敏感；直径在10～15mm为中度敏感；直径小于10mm为低度敏感；无抑菌圈则表示待测菌株不敏感。

利用试管二倍稀释培养法测定目的蛋白对待测菌株的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration，MIC)，将倍比稀释的蛋白提取液与无菌液体培养基转移至无菌试管中，各试管中加入100μL等浓度的待测菌液后37℃恒温恒湿培养24h，不添加蛋白提取液的无菌液体培养基作为空白对照。培养结束后分别检测各菌液在620nm处的吸光值，与对照组吸光值一致的菌液认定为无菌生长，用“--”表示；吸光值大于对照组且目测有菌体生长的认定为有细菌生长，用“+”表示；液体培养基中没有菌体生长的最低蛋白浓度即为其最低抑菌浓度。

为更好的评价目的蛋白的体外抑菌效果，采用纸片法测定MIC目的蛋白对待测菌株的体外抑菌试验，并与常用抗生素进行比较。目的蛋白药敏纸片和含有待测菌株的琼脂平板的制备方法如上所述。37℃恒温恒湿培养24h后通过游标卡尺测量抑菌环的直径，记录数值并进行比较。

2结果与分析

2.1金黄色葡萄球菌噬菌体内溶素SAL-2基因和人溶菌酶hLYZ基因的克隆与序列分析

利用特异性引物，分别以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA和人乳体细胞总RNA为模板，通过PCR/RT-PCR方法，分别扩增出750bp的SAL-2基因片段和447bp的hLYZ基因片段，条带大小与位置均与预期相符(见图1)。

测序结果与GeneBank中的数据进行Blast分析，表明SAL-2和hLYZ基因序列同源性均为99％以上。通过DNAMAN软件对该同源序列做进一步分析。

2.2亚克隆穿梭腺病毒载体的构建

分别对pMD-SAL、pMD-LYZ和腺病毒穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2进行双酶切，胶回收目的片段，以T4DNA连接酶连接，得到亚克隆质粒pShuttle-SAL和pShuttle-LYZ。以T4DNA连接酶连接特异性引物扩增并回收纯化的pSAL-2基因片段和双酶切回收的pShuttle-LYZ目的片段，得到亚克隆质粒pShuttle-SAL-LYZ。对以上亚克隆质粒进行PCR鉴定，分别得到750bp、447bp和1197bp目的片段，表明穿梭载体的亚克隆成功(见图2)。

分别对亚克隆质粒pShuttle-SAL、pShuttle-LYZ和pShuttle-SAL-LYZ进行双酶切鉴定，分别得到447bp、750bp、1197bp、750bp和447bp的目的片段，表明重组穿梭载体构建成功(见图3)。

用限制性内切酶PmeⅠ分别酶切pShuttle-SAL、pShuttle-LYZ、pShuttle-SAL-LYZ和pShuttle-IRES-hrGFP-2，使其线性化。取线性化1μg穿梭载体与1μgpAdEasy-1质粒共转化BJ5183感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑取针尖样小菌落进行菌液PCR筛选及PacⅠ酶切鉴定，获得同源重组腺病毒质粒，命名为pAd-SAL、pAd-LYZ、pAd-SAL-LYZ和pAd-GFP。

将提取的重组腺病毒质粒，用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，结果(见图4)。PacⅠ酶切pAd-SAL、pAd-LYZ、pAd-SAL-LYZ和pAd-GFP，分别得到4.5kb、3kb、4.5kb和4.5kb的片段(见图5)，表明pAd-SAL、pAd-SAL-LYZ和pAd-GFP的同源重组发生在复制起始位点，而pAd-LYZ的同源重组发生在左臂。

2.3SAL-2、hLYZ和共表达双基因重组腺病毒的构建

将线性化的重组腺病毒质粒经脂质体包裹后，转染HEK293细胞，用DMEM维持液(含有2％胎牛血清)在37℃5％CO₂培养箱内培养，每日于倒置显微镜下观察细胞变化，约第7d，经Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SAL-LYZ和Ad-GFP转染的HEK293细胞出现肿胀、圆缩等典型病毒感染病变(CPE)(见图6)。在荧光显微镜下可见重组腺病毒感染细胞出现绿色荧光，而未感染组细胞未见变化(见图7)。RT-PCR产物的电泳结果显示，750bp、447bp和1197bp处分别出现特异性扩增条带(见图8)。Westernblotting结果显示，含有目的基因的重组腺病毒感染细胞后均检测到相应的目的蛋白条带：其中SAL-2为28.6kDa，hLYZ为14.7kDa，Ad-GFP无相应蛋白表达，与预期结果相符(见图9)。

收集经CsCl密度梯度离心浓缩纯化后的病毒，以50％组织培养感染剂量法(TCID₅₀)测定重组腺病毒的病毒滴度，按照KarBer法计算出重组腺病毒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SAL-LYZ和Ad-GFP的滴度分别为：10^8.17TCID₅₀/mL、10^8.50TCID₅₀/mL、10^8.63TCID₅₀/mL和10^7.60TCID₅₀/mL，符合下一步实验所需滴度要求。

2.4重组腺病毒介导目的蛋白对待测菌株的体外抑菌效果

为评价所构建构建重组腺病毒在动物细菌性疾病基因防治中的作用，本研究选择了包括金黄色葡萄球菌等在内的五种菌株为研究对象，分别为大肠杆菌(K88)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、停乳链球菌(ATCC9809)和无乳链球菌。

用10MOI的重组腺病毒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SAL-LYZ和Ad-GFP分别感染HEK293细胞，48h后收取细胞，通过组织活性蛋白提取试剂盒提取细胞内表达蛋白，通过BCA蛋白定量试剂盒绘制标准曲线(图10)，并测得蛋白浓度分别为2.221mg/mL、1.935mg/mL、3.144mg/mL和1.334mg/mL。将上述蛋白溶液调整至统一浓度后浸泡直径为6mm的无菌圆滤纸片，过夜后风干置于含有待测菌株的琼脂平板上培养16～18h。游标卡尺测量抑菌圈结果显示葡萄球菌对Ad-SAL蛋白提取物较为敏感；除大肠杆菌外的所有菌株均对Ad-LYZ蛋白提取物较为敏感；所有菌株均对Ad-SAL-LYZ蛋白提取物较敏感，且Ad-SAL-LYZ蛋白提取物与前两者相比对待测菌株的抑制作用增强(见表5)。

通过试管二倍稀释培养法测定Ad-SAL-LYZ蛋白提取物对各待测菌株的最低抑菌浓度，生理盐水作为空白对照，结果显示其对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、停乳链球菌(ATCC9809)、无乳链球菌和大肠杆菌(K88)的MIC分别为37.5μg/mL、75μg/mL、150μg/mL、150μg/mL和300μg/mL(见表6)。

表5是待测菌株对各重组腺病毒感染HEK293细胞后蛋白提取物的敏感性测定结果

表6是重组腺病毒Ad-SAL-LYZ感染HEK293细胞后蛋白提取物对各待测菌株最小抑菌浓度的测定结果

为进一步评价腺病毒介导表达的外源蛋白对待测菌株的抑制作用以及临床应用价值，本研究通过纸片法检测了最低抑菌浓度的Ad-SAL-LYZ蛋白提取物对各待测菌株的抑菌效果，纸片的制备和效果检测方法如上所述。同时，和常用抗生素对各待测菌株的抑菌效果进行比较。结果显示，与17种常用抗生素相比，外源蛋白对除大肠杆菌之外的待测菌株都具有良好的抑制作用，抑菌效果与常用抗生素持平，甚至更优(见表7-11)。

表7是MIC重组腺病毒Ad-SAL-LYZ蛋白提取物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)的抑菌效果评价

表8是MIC重组腺病毒Ad-SAL-LYZ蛋白提取物对表皮葡萄球菌(ATCC12228)的抑菌效果评价

表9是MIC重组腺病毒Ad-SAL-LYZ蛋白提取物对停乳链球菌(ATCC9809)的抑菌效果评价

表10是MIC重组腺病毒Ad-SAL-LYZ蛋白提取物对无乳链球菌的抑菌效果评价

表11是MIC重组腺病毒Ad-SAL-LYZ蛋白提取物对大肠杆菌(K88)的抑菌效果评价

3结论

3.1分别从金黄色葡萄球菌噬菌体和人乳体细胞中扩增得到SAL-2基因和hLYZ基因，并分别成功连接到pMD19-T载体上，通过PCR检测、酶切鉴定和序列检测，证实扩增所得目的片段与已发表序列的同源性达到99％。

3.2将目的基因片段SAL-2和hLYZ分别亚克隆至穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-2中，得到穿梭载体pShuttle-SAL和pShuttle-LYZ。以pShuttle-LYZ为载体，将目的基因pSAL-2亚克隆至pShuttle-LYZ得到重组穿梭载体pShuttle-SAL-LYZ。将以上重组穿梭载体分别线性化后与pAdEasy-1骨架载体共转染BJ5183感受态细胞，二者在BJ5183内进行同源重组，成功构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-SAL、pAd-LYZ、pAd-SAL-LYZ和对照腺病毒质粒pAd-GFP。

3.3将重组腺病毒质粒pAd-SAL、pAd-LYZ、pAd-SAL-LYZ和对照腺病毒质粒pAd-GFP经PacⅠ酶切后，转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SAL-LYZ和对照腺病毒Ad-GFP；经RT-PCR证实重组腺病毒质粒成功导入HEK293细胞中；经Westernblotting可检测到HN蛋白的表达，表明构建成功的重组腺病毒具有良好的感染性；上述重组腺病毒经CsCl密度梯度纯化后，应用TCID50法检测其病毒滴度，分别为10^8.17TCID₅₀/mL、10^8.50TCID₅₀/mL、10^8.83TCID₅₀/mL和10^7.60TCID₅₀/mL，表明腺病毒介导外源基因感染有效，收获的较高滴度和感染性的重组腺病毒符合下一步实验的要求。

3.4重组腺病毒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SAL-LYZ和对照腺病毒Ad-GFP分别感染HEK293细胞后提取细胞内活性蛋白经BCA定量测定蛋白提取物浓度分别为2.221mg/mL、1.935mg/mL、3.144mg/mL和1.334mg/mL。通过纸片法分别检测待测菌株对各蛋白提取物的敏感性，结果显示葡萄球菌对Ad-SAL蛋白提取物较为敏感；除大肠杆菌外的所有菌株均对Ad-LYZ蛋白提取物较为敏感；所有菌株均对Ad-SAL-LYZ蛋白提取物较敏感，且Ad-SAL-LYZ蛋白提取物与前两者相比对待测菌株的抑制作用增强。

3.5通过试管二倍稀释培养法测定Ad-SAL-LYZ蛋白提取物对各待测菌株的最小抑菌浓度(MIC)分别为37.5μg/mL、75μg/mL、150μg/mL、150μg/mL和300μg/mL。为进一步评价腺病毒介导表达的外源蛋白对待测菌株的抑制作用以及临床应用价值，纸片法分别测定MIC蛋白提取物对各待测菌株的抑制效果，并与17种常用抗生素进行比较。结果显示与17种常用抗生素相比，外源蛋白对除大肠杆菌之外的待测菌株都具有良好的抑制作用，抑菌效果与常用抗生素持平，甚至更优。

本发明的创新之处在于，首次将SAL-2对金黄色葡萄球菌的广谱抑菌效果、hLYZ广泛抑菌且不会损伤动物细胞的特性和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，成功构建出共表达上述基因的重组腺病毒Ad-SAL-LYZ。通过检测重组腺病毒在体外HEK293细胞中的复制、转录和外源基因的表达，以及细胞内活性蛋白提取物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、停乳链球菌(ATCC9809)、无乳链球菌和大肠杆菌(K88)等5种菌株的MIC和抑菌活性等，综合评价了重组腺病毒对奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用，阐明了重组腺病毒在体外细胞中的表达规律及介导外源蛋白杀伤细菌的生物学效应，证明了构建的重组腺病毒介导外源蛋白抑制细菌的作用及基因治疗动物细菌性疾病的临床应用前景。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (3)

1.一种共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA和人乳体细胞总RNA中分别扩增出SAL-2基因序列GI:NC_009875和hLYZ基因序列GI:NM_000239；

所述的SAL-2基因和hLYZ基因的扩增包括：以SAL-FSEQIDNO：1和SAL-RSEQIDNO：2为引物，以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA为模版，扩增SAL-2基因序列；以LYZ-FSEQIDNO：3和LYZ-RSEQIDNO：4为引物，以人乳体细胞总RNA为模版，扩增hLYZ基因序列；以rSAL-FSEQIDNO：5和rSAL-RSEQIDNO：6为引物，以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA为模版，扩增两端为不同限制性酶切位点的SAL-2基因序列；

2)将获得的目的基因分别克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ；

3)将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-SAL-LYZ。

2.如权利要求1所述的共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。

3.如权利要求1所述的共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在防治奶牛乳房炎小鼠动物模型中细菌性疾病生物制品方面的应用。