CN112080523A - 携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建 - Google Patents

携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建 Download PDF

Info

Publication number
CN112080523A
CN112080523A CN202010975479.6A CN202010975479A CN112080523A CN 112080523 A CN112080523 A CN 112080523A CN 202010975479 A CN202010975479 A CN 202010975479A CN 112080523 A CN112080523 A CN 112080523A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hhgf
hvegf165
cells
adenovirus
cloning
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010975479.6A
Other languages
English (en)
Inventor
王家宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shiyan Peoples Hospital
Original Assignee
Shiyan Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shiyan Peoples Hospital filed Critical Shiyan Peoples Hospital
Priority to CN202010975479.6A priority Critical patent/CN112080523A/zh
Publication of CN112080523A publication Critical patent/CN112080523A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提出了携带血管内皮生长因子（VEGF）165及肝细胞生长因子（HGF）双基因腺病毒载体的构建，利用携带内源性核糖体进入位点（IRES）元件的穿梭载体，构建表达VEGF和HGF的腺病毒载体，为CLI患者进行生物治疗提供一种新的选择。方法：利用PCR扩增得到目的片段，经两轮定向克隆，得到重组穿梭载体；将线性化的穿梭质粒与骨架质粒进行同源重组，筛选得到的阳性重组用PacI酶切，经脂质体转染AD293细胞，进行腺病毒包装和扩增。利用穿梭载体pShuttle‑IRES成功构建同时高效表达hVEGF165和hHGF蛋白的重组腺病毒，并在hVSMCs中高效表达，为双基因治疗提供了强有力的工具和方法。

Description

携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体 的构建
技术领域
本发明属于腺病毒载体的构建领域，涉及携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建。
背景技术
目前，粥样硬化是动脉疾病的主要病因之一；随着经济发展，人民生活水平的显著提高，动脉粥样硬化性疾病的发病率逐渐增高，而且患病人群呈现年轻化的趋势。外周动脉疾病（PAD）患病率高，发达国家普通人群达15%，年人群高达30 % ，而发展中国家更高。PAD患者一般都有严重的肢体缺血（CLI），有些患者甚至面临截肢，PAD越重，则心肌梗死和脑卒中死亡的风险越大，严重的症状性大血管PAD，未来12个月内血管相关死亡率高达25% ，与冠心病、中枢血管病具有相同、相似的血管相关死亡风险，甚至更高。进行了数年的血管内介入治疗使一部分PAD患者受益，但对于另一部分患者来说，由于动脉闭塞性疾病的解剖范围和分布，使得他们不适合任何血管重建术。因此，血管再生治疗就成为了这部分患者的希望，而使用基因或细胞疗法诱导治疗性血管生成，则为治疗CLI开辟了新的治疗方法。
基因治疗最关键的环节之一就是如何有效地将外源基因导入靶细胞内并使其稳定表达，而腺病毒载体被认为是高效表达的基因转移载体。由于腺病毒载体的诸多优点，如宿主范围广，不仅可感染复制分裂的细胞，也可感染静止期细胞；包装容量大，可以插入7.5kb的外源性基因片段；不整合到宿主细胞的染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险；病毒经扩增、纯化，可达到很高滴度，且感染效率可达100%；性质较稳定，对人类相对安全等，使其在体内基因转移中具有较大优势，成为目前基因治疗研究中最有前途的载体。
重组腺病毒制备的关键技术是同源重组和对重组体的筛选及鉴定。传统的细胞内同源重组法是将腺病毒骨架质粒和携带目的基因的穿梭质粒共转染293细胞，这一方法要求两种质粒同时转移至同一293细胞中，并在该细胞中发生同源重组。由于两种质粒共转染同一293细胞的可能性已经很小，发生同源重组的机率就更小，因此提高同源重组率是制备腺病毒一直致力要解决的首要问题。
组织中血管的形成需要大量细胞和蛋白质的协同作用；其中，血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是这一过程中的关键、初始参与者，它能够刺激内皮细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡；VEGF的活性是由细胞表面的VEGF受体决定的，VEGF-A在体内的过度表达可引起损伤或缺血组织的血管新生，而成熟和稳定的血管形成则需要肝细胞生长因子（HGF）等其他生长因子的存在。HGF是一种异二聚体蛋白，被认为是最有力的细胞增殖和迁移的激活剂。据推测，HGF可能影响VEGF受体2（VEGFR2）的表达。释放到细胞外基质中的HGF使新生血管形成过程中VEGF的活性倍增。在美国和日本进行的几项使用表达HGF的裸质粒DNA的早期临床试验中发现，试验中没有引起任何严重的不良反应，踝臂指数（ABI）和经皮血氧饱和度（TcPO2）增加，疼痛和溃疡的视觉模拟评分（VAS）减少了，提示HGF能够促进血管生成，诱导侧支形成。
发明内容
为了提高携带两种目的基因两种质粒腺病毒骨架质粒发生同源重组的机率，解决由于常规表达载体启动子间相互干扰导致的目的基因表达水平低的问题，本发明提出携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建。
为解决技术问题，本发明的技术方案为：携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建，步骤如下：
（1）引物设计与合成
根据人源血管内皮生长因子（hVEGF165）的基因序列，设计两条扩增hVEGF165（1-576bp）的引物，上游引物（hVEGF165-F）为5’ ata ggc tag cct cga g gccacc atg aac tttctg ctg tct tgg 3’，下游引物（hVEGF165-R）为5’ cgc gtg aat tct cga g tca ccg cctcgg ctt gtc aca 3’，下划线序列分别代表XhoI酶切位点；根据人源肝细胞生长因子（hHGF）的基因序列，设计两条扩增hHGF（1-2187 bp）的引物，上游引物（hHGF -F）为5’ atcctc tag agt cga c gccacc atg tgg gtg acc aaa ctc ctg 3’，下游引物（hHGF-R）为 5’ggc cgc ccg ggt cga c cta tga ctg tgg tac ctt ata 3’，下划线序列分别代表SalI酶切位点；
（2）hVEGF165的扩增与克隆
以phVEGF165-cDNA为模板，hVEGF165-F和hVEGF165-R为引物，扩增hVEGF165片段；pShuttle-IRES经XhoI酶切后，利用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒与hVEGF165进行定向克隆，PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下进行转化，完成定向克隆；后续采用酶切及测序进行鉴定，得到了重组载体pShuttle-hVEGF165-IRES；
（3）hHGF的扩增与克隆
以phHGF-cDNA为模板，hHGF-F和hHGF-R为引物，扩增hHGF片段； pShuttle-hVEGF165-IRES经SalI酶切后，利用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒与hHGF（2187bp）进行定向克隆，PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下进行转化，完成定向克隆；后续采用酶切及测序进行鉴定，得到了重组载体pShuttle-hVEGF165-IRES-hHGF；
（4）携带双基因重组腺病毒载体pAd-hVEGF65-IRES-hHGF的构建
将pShuttle-hVEGF165-IRES-hHGF用Pme I进行酶切，然后进行低熔点琼脂糖凝胶电脉回收后，再用CIAP去磷酸化，苯酚/氯仿抽提后，转化BJ5183-AD-1感受态细胞，通过细菌内同源重组法获得的阳性重组质粒命名为pAd-hVEGF165-IRES-hHGF；重组质粒采用Pac I 酶切鉴定，证明重组成功；
（5）重组腺病毒Ad-hVEGF165- hHGF的包装
将经Pac I线性化的阳性重组质粒进行苯酚/氯仿抽提，乙醇/醋酸钠共沉淀后加入消毒三蒸水溶解，待完全溶解后加入脂质体Lipofectamine® LTX Plus Reagent转染达到90%以上融合的AD293细胞，置37℃、5%CO2培养箱中孵育，l4-20 d后即可观察到病毒蚀斑的出现，将出现细胞病变的AD293细胞进行倒置相差显微镜观察并行照相，当出现完全细胞病变时收集病变的细胞；
（6）重组腺病毒的扩增、纯化及其滴度测定：
取重组腺病毒上清，加入90%融合的AD293细胞中，在培养箱中培养，镜下观察到95-100%细胞出现细胞病变后，离心收集细胞，并将细胞于-80℃和37℃之间反复冻融3次，离心收集上清，对重组腺病毒上清进行CsCl密度梯度离心纯化两次，并将纯化后的腺病毒采用透析液4℃透析两次，每次24 h；将透析后的病毒液进行滴度测定，采用紫外分光光度计测定病毒的颗粒数和纯度；
（7）Ad-hVEGF165- hHGF转染hVSMC后VEGF165和HGF的表达
待接种的hVSMC生长至70%融合时，加入Ad-GFP病毒液以100感染复数转染hVSMC，2 h后弃去病毒液，PBS洗3次，加入含10% FCS的DMEM培养液培养48 h后收集并裂解细胞，经Western blot检测VEGF165和HGF的表达情况。
对上述技术方案的进一步限定：hVEGF165的扩增与克隆中，扩增条件为95°C for1 min，95°C for 15 sec，68°C for 3 min，30 cycles；克隆条件为50℃反应20 min。
对上述技术方案的进一步限定：hHGF的扩增与克隆中，扩增条件为95°C for 1min，95°C for 15 sec，68°C for 3 min，30 cycles；克隆条件为50℃反应20 min。
对上述技术方案的进一步限定：重组腺病毒Ad-hVEGF165- hHGF的包装中，孵育条件为置37℃、5%CO2培养箱中孵育。
本发明的有益效果是：本发明成功得到了携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因的腺病毒载体，是具有两个克隆位点（Multiple cloning site，MCS），且IRES位于两个MCS中间的载体，检测结果证实构建的携带VEGF和HGF的腺病毒载体，序列同源性为100%，能够成功的转染哺乳动物细胞，并在细胞内高效的表达外源蛋白，这就为临床上利用双基因进行基因治疗提供了强有力的保证。
附图说明
图1是本发明pShuttle-hVEGF165-IRES-hHGF的构建流程图。
图2是PCR扩增VEGF165的琼脂糖凝胶电泳和重组子的酶切鉴定图。
图3是PCR扩增HGF的琼脂糖凝胶电泳和重组子的酶切鉴定图。
图4是琼脂糖凝胶电泳鉴定pAd-hVEGF165-hHGF的酶切结果图。
图5是本发明中VEGF165和HGF均得到了高效表达示意。
具体实施方式
下面，以多个方面更详细地描述本发明。
一、本发明中涉及的材料说明
1、载体、菌株及细胞系
腺病毒穿梭载体pShuttle购自艾礼生物科技（上海）有限公司（Agilent，GenBank序列号：AF334399），pIRES购自大连宝生物科技有限公司(Clontech),经本实验室改造后得到携带双顺反子的腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES。AdEasy™ Adenoviral Vector System，XL10-gold和BJ5183-AD-1 购自美国Stratagene公司。宿主菌Ecoli.DH5α为本实验室保存。AD293细胞购自美国Stratagene公司，为腺病毒El区基因转化的人胚肾细胞系，培养条件为15％新生牛血清的高糖DMEM培养液，在37℃、5% CO2孵箱中培养。
2、试剂与酶
聚合酶Advantage2 PCR Kit（Clontech，Cat.639207）购自大连宝生物工程公司，一步法快速克隆试剂盒Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自上海翊圣生物科技有限公司；各种限制性内切酶、DMEM、Lipofectamine®LTX Plus Reagent均购自Thermo Fisher公司。特级新生牛血清及胎牛血清购自兰州民海生物科技有限公司。
二、根据上述材料，进一步描述本发明：携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建，步骤如下：
（1）引物设计与合成
根据人源血管内皮生长因子（hVEGF165）的基因序列，设计两条扩增hVEGF165（1-576bp）的引物。上游引物（hVEGF165-F）: 5’ ata ggc tag cct cga g gccacc atg aac tttctg ctg tct tgg 3’，下游引物（hVEGF165-R）: 5’ cgc gtg aat tct cga g tca ccg cctcgg ctt gtc aca 3’，下划线序列分别代表XhoI酶切位点。根据人源肝细胞生长因子（hHGF）的基因序列，设计两条扩增hHGF（1-2187 bp）的引物。上游引物（hHGF -F）: 5’ atcctc tag agt cga c gccacc atg tgg gtg acc aaa ctc ctg 3’，下游引物（hHGF-R）: 5’ggc cgc ccg ggt cga c cta tga ctg tgg tac ctt ata 3’，下划线序列分别代表SalI酶切位点（引物由南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成）；
（2）hVEGF165的扩增与克隆
以phVEGF165-cDNA为模板，hVEGF165-F和hVEGF165-R为引物，扩增hVEGF165片段；扩增条件为95°C for 1 min，95°C for 15 sec，68°C for 3 min，30 cycles；pShuttle-IRES经XhoI酶切后，利用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒与hVEGF165（576bp）进行定向克隆，PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，50℃反应20min后进行转化，完成定向克隆；后续采用酶切及测序进行鉴定，得到重组载体pShuttle-hVEGF165-IRES；
（3） hHGF的扩增与克隆
以phHGF-cDNA为模板，hHGF-F和hHGF-R为引物，扩增hHGF片段；扩增条件为95°C for 1min，95°C for 15 sec，68°C for 3 min，30 cycles；pShuttle-hVEGF165-IRES经SalI酶切后，利用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒与hHGF（2187bp）进行定向克隆，PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下， 50℃反应20 min后进行转化，完成定向克隆。后续采用酶切及测序进行鉴定。得到重组载体pShuttle-hVEGF165-IRES-hHGF；
（4）携带双基因重组腺病毒载体pAd-hVEGF65-IRES-hHGF的构建
将pShuttle-hVEGF165-IRES-hHGF用Pme I进行酶切，然后进行低熔点琼脂糖凝胶电脉回收后，再用CIAP去磷酸化，苯酚/氯仿抽提后，转化BJ5183-AD-1感受态细胞（含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞），通过细菌内同源重组法获得的阳性重组质粒命名为pAd-hVEGF165-IRES-hHGF。重组质粒采用Pac I 酶切鉴定，若出现4.5 Kb或3.0 Kb的酶切片段及大于23Kb的大片段，则说明重组成功；构建策略如图1所示；
（5）重组腺病毒Ad-hVEGF165- hHGF的包装
将经Pac I线性化的阳性重组质粒进行苯酚/氯仿抽提，乙醇/醋酸钠共沉淀后加入40μl消毒三蒸水溶解，待完全溶解后加入脂质体Lipofectamine® LTX Plus Reagent转染达到90%以上融合的AD293细胞，置37℃、5%CO2培养箱中孵育，l4-20 d后即可观察到病毒蚀斑的出现；将出现细胞病变的AD293细胞进行倒置相差显微镜观察并行照相。当出现完全细胞病变(95%-100%细胞变圆，10%-20%细胞漂浮)时收集病变的细胞；
（6）重组腺病毒的扩增、纯化及其滴度测定：
取重组腺病毒上清500 μl ，加入90%融合的AD293细胞中，37℃ 、5%CO2培养箱中培养，镜下观察到95%-100%细胞出现细胞病变后，离心收集细胞。并将细胞于-80℃和37℃之间反复冻融3次，以3000 rpm/min离心5 min收集上清，对重组腺病毒上清进行CsCl密度梯度离心纯化两次，并将纯化后的腺病毒采用透析液(10 mmol/L Tris-HCI，l mmol/L MgCl2，10％甘油)4℃透析两次，每次24 h，将透析后的病毒液进行滴度测定．采用紫外分光光度计测定；取纯化后的病毒液100 μl，10% SDS 20 μl、PBS 880 μl，65℃热浴30 min后，旋涡3次，离心后测定病毒基因组DNA的OD260nm和OD280nm，据此计算病毒的颗粒数和纯度，1OD260=1012pfu/ml，若OD260／OD280>1.3表明纯度较高，病毒滴度pfu/ml=A260×dilution×1012 ；
（7）Ad-hVEGF165- hHGF转染hVSMC后VEGF165和HGF的表达
待接种的hVSMC生长至70%融合时，加入Ad-GFP病毒液以100感染复数 (MOI)转染hVSMC，2 h后弃去病毒液，PBS洗3次，加入含10% FCS的DMEM培养液培养48 h后收集并裂解细胞，经Western blot检测VEGF165和HGF的表达情况。
三、本发明中涉及的鉴定方法
1、hVEGF165的扩增和克隆的鉴定
见图2，图2中标号所示，1、Marker：DL2000；2、VEGF165的PCR产物；3、Marker：DL2000；4、pShuttle- hVEGF165+XhoI；通过XhoI酶切鉴定重组质粒pShuttle- hVEGF165，有约600bp的预期目的片段；测序结果表明，hVEGF165被正确插入了pShuttle-IRES载体的A克隆位点，与hVEGF165序列进行比较，序列同源性100%，得到重组载体pShuttle- hVEGF165。
2、hHGF的扩增和克隆的鉴定
参见图3，图3中标号所示，1、Marker：DL2000；2、HGF的PCR产物；3、λDNA/HindⅢmarker；4、pShuttle- hVEGF165-hHGF+SalI；通过SalI酶切鉴定重组质粒pShuttle-hVEGF165-IRES-MCS B，有约2.2 kb的预期目的片段；测序结果表明，HGF被正确插入了B克隆位点，得到重组载体pShuttle- hVEGF165-hHGF。
3、重组质粒pAd-hVEGF165-hHGF的酶切鉴定结果
参见图4，图4中标号所示，1、λDNA/HindⅢ marker，2、pAd-hVEGF165-hHGF + PacI；pAd-hVEGF165-hHGF质粒经Pac I 酶切后获得了正确大小的两个片段即1个大于23 Kb和1个4.5 Kb的片段，说明穿梭质粒pShuttle-hVEGF165-hHGF已与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1成功地发生了同源重组，重组发生在复制起始位点与右臂之间，得到重组质粒pAd-hVEGF165-hHGF（见序列表）。
4、重组腺病毒滴度测定结果
重组腺病毒经繁殖、扩增、纯化后经紫外分光光度计测定，病毒滴度为2.4×1012 pfu/ml，OD260/OD280>1. 3，说明病毒纯度和滴度均较高，可满足体内、体外实验的需要。
5、Ad-hVEGF165-hHGF转染hVSMC后双基因的表达
为了观察hVEGF165和hHGF的表达水平，将Ad-hVEGF165-hHGF以100 MOI转染hVSMC，培养48 h后，收集并裂解细胞，提取细胞总蛋白，经Western blot检测，与对照组相比，VEGF165和HGF均得到了高效表达，如图5所示；图5中，Ctrl:转染了Ad-Null的hVSMC细胞的总蛋白，AVH：转染了Ad-hVEGF165-hHGF的hVSMC细胞的总蛋白；anti-HGF(SC-374422，1:1000)，anti-VEGF（ab69479，1:1000）。
四、分析本发明的优势和情景
重组腺病毒制备的关键技术是同源重组和对重组体的筛选、鉴定。传统的细胞内同源重组法是将腺病毒骨架质粒和携带目的基因的穿梭质粒共转染293细胞，这一方法要求两种质粒同时转移至同一293细胞中，并在该细胞中发生同源重组。由于两种质粒共转染同一293细胞的可能性已经很小，发生同源重组的机率就更小。因此提高同源重组率是制备腺病毒一直致力要解决的首要问题。本研究采用了细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒质粒，与传统方法不同的是两种质粒的重组是在E.coli BJ5183中完成。由于质粒转化细菌的效率极高，细菌繁殖速度快，且BJ5183菌中的RecA可表达很强的重组酶活性，因此细菌中同源重组法克服了细胞内质粒共转染效率低和同源重组率低的缺点，大大缩短了实验周期，且显著提高了成功率；
在基因治疗的研究中，常常需要评价腺病毒的基因转染效率、外源基因的表达效率。本研究根据双顺反子表达蛋白的理论，将腺病毒的穿梭载体pShuttle进行改造优化，成功获得用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭载体，来解决由于常规表达载体启动子间相互干扰导致的目的基因表达水平低的问题。这样的得到的双顺反子真核表达载体，是具有两个多克隆位点（Multiple cloning site，MCS），且IRES位于两个MCS中间的载体，插入的两个外源基因的表达不受启动子干扰，这样能满足不同实验目的的需要。Western blot检测结果也证实了，我们构建的携带VEGF和HGF的腺病毒载体，能够成功的转染哺乳动物细胞，并在细胞内高效的表达外源蛋白。这就为临床上利用双基因进行基因治疗提供了强有力的保证。
序列表
<110>十堰市人民医院
<120>携带血管内皮生长因子和肝细胞生长因子的腺病毒载体的构建
<160> 3
<170> PatentIn Version 2.1
<210> 1
<211> 11205
<212> DNA
<213> 腺病毒（AdEasy vector pShuttle）
<220>
<221> misc_feature
<222> (80,100,112)
<223> n =a或g或c或t
<220>
<221> CDS
<222> 1..11205
<400> 1
ttttggattg aagccaatat gataatgagg gggtggagtt tgtgacgtgg cgcggggcgt 60
gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg cggaagtgtg atgttgcaag tgtggcggaa 120
cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg acgtttttgg tgtgcgccgg tgtacacagg 180
aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg atgttgtagt aaatttgggc gtaaccgagt 240
aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga ataagaggaa gtgaaatctg aataattttg 300
tgttactcat agcgcgtaat actggtacct caatattggc cattagccat attattcatt 360
ggttatatag cataaatcaa tattggctat tggccattgc atacgttgta tctatatcat 420
aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca atatgaccgc catgttggca ttgattattg 480
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 540
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 600
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 660
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 720
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 780
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 840
accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 900
ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 960
cgggactttc caaaatgtcg taacaactgc gatcgcccgc cccgttgacg caaatgggcg 1020
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatca 1080
ctagaagctt tattgcggta gtttatcaca gttaaattgc taacgcagtc agtgcttctg 1140
acacaacagt ctcgaactta agctgcagtg actctcttaa ggtagccttg cagaagttgg 1200
tcgtgaggca ctgggcaggt aagtatcaag gttacaagac aggtttaagg agaccaatag 1260
aaactgggct tgtcgagaca gagaagactc ttgcgtttct gataggcacc tattggtctt 1320
actgacatcc actttgcctt tctctccaca ggtgtccact cccagttcaa ttacagctct 1380
taaggctaga gtacttaata cgactcacta taggctagcc tcgagatgaa ctttctgctg 1440
tcttgggtgc attggagcct tgccttgctg ctctacctcc accatgccaa gtggtcccag 1500
gctgcaccca tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat 1560
gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac 1620
cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc 1680
tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag 1740
attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt cctacagcac 1800
aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcaagac aagaaaatcc ctgtgggcct 1860
tgctcagagc ggagaaagca tttgtttgta caagatccgc agacgtgtaa atgttcctgc 1920
aaaaacacag actcgcgttg caaggcgagg cagcttgagt taaacgaacg tacttgcaga 1980
tgtgacaagc cgaggcggtg actcgagaat tcacgcgtcg agcatgcatc tagggcggcc 2040
aattccgccc ctctccctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag 2100
gccggtgtgc gtttgtctat atgtgatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga 2160
gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg 2220
ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt 2280
gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca 2340
ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc 2400
agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat 2460
tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc 2520
ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga 2580
accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata agcttgccac aacccgggat 2640
cctctagagt cgacatgtgg gtgaccaaac tcctgccagc cctgctgctg cagcatgtcc 2700
tcctgcatct cctcctgctc cccatcgcca tcccctatgc agagggacaa aggaaaagaa 2760
gaaatacaat tcatgaattc aaaaaatcag caaagactac cctaatcaaa atagatccag 2820
cactgaagat aaaaaccaaa aaagtgaata ctgcagacca atgtgctaat agatgtacta 2880
ggaataaagg acttccattc acttgcaagg cttttgtttt tgataaagca agaaaacaat 2940
gcctctggtt ccccttcaat agcatgtcaa gtggagtgaa aaaagaattt ggccatgaat 3000
ttgacctcta tgaaaacaaa gactacatta gaaactgcat cattggtaaa ggacgcagct 3060
acaagggaac agtatctatc actaagagtg gcatcaaatg tcagccctgg agttccatga 3120
taccacacga acacagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaagaccta caggaaaact 3180
actgtcgaaa tcctcgaggg gaagaagggg gaccctggtg tttcacaagc aatccagagg 3240
tacgctacga agtctgtgac attcctcagt gttcagaagt tgaatgcatg acctgcaatg 3300
gggagagtta tcgaggtctc atggatcata cagaatcagg caagatttgt cagcgctggg 3360
atcatcagac accacaccgg cacaaattct tgcctgaaag atatcccgac aagggctttg 3420
atgataatta ttgccgcaat cccgatggcc agccgaggcc atggtgctat actcttgacc 3480
ctcacacccg ctgggagtac tgtgcaatta aaacatgcgc tgacaatact atgaatgaca 3540
ctgatgttcc tttggaaaca actgaatgca tccaaggtca aggagaaggc tacaggggca 3600
ctgtcaatac catttggaat ggaattccat gtcagcgttg ggattctcag tatcctcacg 3660
agcatgacat gactcctgaa aatttcaagt gcaaggacct acgagaaaat tactgccgaa 3720
atccagatgg gtctgaatca ccctggtgtt ttaccactga tccaaacatc cgagttggct 3780
actgctccca aattccaaac tgtgatatgt cacatggaca agattgttat cgtgggaatg 3840
gcaaaaatta tatgggcaac ttatcccaaa caagatctgg actaacatgt tcaatgtggg 3900
acaagaacat ggaagactta catcgtcata tcttctggga accagatgca agtaagctga 3960
atgagaatta ctgccgaaat ccagatgatg atgctcatgg accctggtgc tacacgggaa 4020
atccactcat tccttgggat tattgcccta tttctcgttg tgaaggtgat accacaccta 4080
caatagtcaa tttagaccat cccgtaatat cttgtgccaa aacgaaacaa ttgcgagttg 4140
taaatgggat tccaacacga acaaacatag gatggatggt tagtttgaga tacagaaata 4200
aacatatctg cggaggatca ttgataaagg agagttgggt tcttactgca cgacagtgtt 4260
tcccttctcg agacttgaaa gattatgaag cttggcttgg aattcatgat gtccacggaa 4320
gaggagatga gaaatgcaaa caggttctca atgtttccca gctggtatat ggccctgaag 4380
gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca ggcctgctgt cctggatgat tttgttagta 4440
cgattgattt acctaattat ggatgcacaa ttcctgaaaa gaccagttgc agtgtttatg 4500
gctggggcta cactggattg atcaactatg atggcctatt acgagtggca catctctata 4560
taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc atcgagggaa ggtgactctg aatgagtctg 4620
aaatatgtgc tggggctgaa aagattggat caggaccatg tgagggggat tatggtggcc 4680
cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa tggttcttgg tgtcattgtt cctggtcgtg 4740
gatgtgccat tccaaatcgt cctggtattt ttgtccgagt agcatattat gcaaaatgga 4800
tacacaaaat tattttaaca tataaggtac cacagtcata ggtcgacccg ggcggccgct 4860
tccctttagt gagggttaat gcttcgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga 4920
caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt 4980
gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacagatctg ggcgtggtt aagggtggga 5040
aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag ttttgtatct gttttgcagc agccgccgcc 5100
gccatgagca ccaactcgtt tgatggaagc attgtgagct catatttgac aacgcgcatg 5160
cccccatggg ccggggtgcg tcagaatgtg atgggctcca gcattgatgg tcgccccgtc 5220
ctgcccgcaa actctactac cttgacctac gagaccgtgt ctggaacgcc gttggagact 5280
gcagcctccg ccgccgcttc agccgctgca gccaccgccc gcgggattgt gactgacttt 5340
gctttcctga gcccgcttgc aagcagtgca gcttcccgtt catccgcccg cgatgacaag 5400
ttgacggctc ttttggcaca attggattct ttgacccggg aacttaatgt cgtttctcag 5460
cagctgttgg atctgcgcca gcaggtttct gccctgaagg cttcctcccc tcccaatgcg 5520
gtttaaaaca taaataaaaa accagactct gtttggattt ggatcaagca agtgtcttgc 5580
tgtctttatt taggggtttt gcgcgcgcgg taggcccggg accagcggtc tcggtcgttg 5640
agggtcctgt gtattttttc caggacgtgg taaaggtgac tctggatgtt cagatacatg 5700
ggcataagcc cgtctctggg gtggaggtag caccactgca gagcttcatg ctgcggggtg 5760
gtgttgtaga tgatccagtc gtagcaggag cgctgggcgt ggtgcctaaa aatgtctttc 5820
agtagcaagc tgattgccag gggcaggccc ttggtgtaag tgtttacaaa gcggttaagc 5880
tgggatgggt gcatacgtgg ggatatgaga tgcatcttgg actgtatttt taggttggct 5940
atgttcccag ccatatccct ccggggattc atgttgtgca gaaccaccag cacagtgtat 6000
ccggtgcact tgggaaattt gtcatgtagc ttagaaggaa atgcgtggaa gaacttggag 6060
acgcccttgt gacctccaag attttccatg cattcgtcca taatgatggc aatgggccca 6120
cgggcggcgg cctgggcgaa gatatttctg ggatcactaa cgtcatagtt gtgttccagg 6180
atgagatcgt cataggccat ttttacaaag cgcgggcgga gggtgccaga ctgcggtata 6240
atggttccat ccggcccagg ggcgtagtta ccctcacaga tttgcatttc ccacgctttg 6300
agttcagatg gggggatcat gtctacctgc ggggcgatga agaaaacggt ttccggggta 6360
ggggagatca gctgggaaga aagcaggttc ctgagcagct gcgacttacc gcagccggtg 6420
ggcccgtaaa tcacacctat taccgggtgc aactggtagt taagagagct gcagctgccg 6480
tcatccctga gcaggggggc cacttcgtta agcatgtccc tgactcgcat gttttccctg 6540
accaaatccg ccagaaggcg ctcgccgccc agcgatagca gttcttgcaa ggaagcaaag 6600
tttttcaacg gtttgagacc gtccgccgta ggcatgcttt tgagcgtttg accaagcagt 6660
tccaggcggt cccacagctc ggtcacctgc tctacggcat ctcgatccag catatctcct 6720
cgtttcgcgg gttggggcgg ctttcgctgt acggcagtag tcggtgctcg tccagacggg 6780
ccagggtcat gtctttccac gggcgcaggg tcctcgtcag cgtagtctgg gtcacggtga 6840
aggggtgcgc tccgggctgc gcgctggcca gggtgcgctt gaggctggtc ctgctggtgc 6900
tgaagcgctg ccggtcttcg ccctgcgcgt cggccaggta gcatttgacc atggtgtcat 6960
agtccagccc ctccgcggcg tggcccttgg cgcgcagctt gcccttggag gaggcgccgc 7020
acgaggggca gtgcagactt ttgagggcgt agagcttggg cgcgagaaat accgattccg 7080
gggagtaggc atccgcgccg caggccccgc agacggtctc gcattccacg agccaggtga 7140
gctctggccg ttcggggtca aaaaccaggt ttcccccatg ctttttgatg cgtttcttac 7200
ctctggtttc catgagccgg tgtccacgct cggtgacgaa aaggctgtcc gtgtccccgt 7260
atacagactn nngtttaaac gaattcnnnt ataaaatgca aggtgctgct caaaaaatca 7320
ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca tcgtagtcat gctcatgcag ataaaggcag 7380
gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac accatttttc tctcaaacat gtctgcgggt 7440
ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa aaaacattta aacattagaa gcctgtctta 7500
caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa gacggactac ggccatgccg gcgtgaccgt 7560
aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca ccaccgacag ctcctcggtc atgtccggag 7620
tcataatgta agactcggta aacacatcag gttgattcat cggtcagtgc taaaaagcga 7680
ccgaaatagc ccgggggaat acatacccgc aggcgtagag acaacattac agcccccata 7740
ggaggtataa caaaattaat aggagagaaa aacacataaa cacctgaaaa accctcctgc 7800
ctaggcaaaa tagcaccctc ccgctccaga acaacataca gcgcttcaca gcggcagcct 7860
aacagtcagc cttaccagta aaaaagaaaa cctattaaaa aaacaccact cgacacggca 7920
ccagctcaat cagtcacagt gtaaaaaagg gccaagtgca gagcgagtat atataggact 7980
aaaaaatgac gtaacggtta aagtccacaa aaaacaccca gaaaaccgca cgcgaaccta 8040
cgcccagaaa cgaaagccaa aaaacccaca acttcctcaa atcgtcactt ccgttttccc 8100
acgttacgta acttcccatt ttaagaaaac tacaattccc aacacataca agttactccg 8160
ccctaaaacc tacgtcaccc gccccgttcc cacgccccgc gccacgtcac aaactccacc 8220
ccctcattat catattggct tcaatccaaa ataaggtata ttattgatg atnnnttaatt 8280
aaggatccnn ncggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 8340
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 8400
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 8460
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 8520
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 8580
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 8640
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacc tgtccgccttt ctcccttcgg 8700
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 8760
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 8820
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 8880
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 8940
ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 9000
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 9060
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 9120
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 9180
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 9240
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 9300
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 9360
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 9420
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 9480
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 9540
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gnnnnnnaaa 9600
aaggatcttc acctagatcc ttttcacgta gaaagccagt ccgcagaaac ggtgctgacc 9660
ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa aacgcaagcg caaagagaaa 9720
gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac tgggcggttt tatggacagc 9780
aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 9840
aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca 9900
agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 9960
ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 10020
tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 10080
cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 10140
gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 10200
gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 10260
agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 10320
attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 10380
tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 10440
caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 10500
cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 10560
gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 10620
tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 10680
gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attttgttaa aatttttgtt 10740
aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa catcccttat aaatcaaaag 10800
aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga 10860
acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg 10920
aaccatcacc caaatcaagt tttttgcggt cgaggtgccg taaagctcta aatcggaacc 10980
ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg 11040
aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc 11100
gcgtaaccac cacacccgcg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcca ttcgccattc 11160
aggatcgaat taattcttaa ttaacatcat caataatata cctta 11205
序列表
<110> 十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院）
<120> 携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建
<141> 2020-09-16
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11235
<212> DNA
<213> 腺病毒(AdEasy vector pShuttle)
<400> 1
atntnrsnda syvctrhttm scatrnagct ttttggattg aagccaatat gataatgagg 60
gggtggagtt tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg 120
cggaagtgtg atgttgcaag tgtggcggaa cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg 180
acgtttttgg tgtgcgccgg tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg 240
atgttgtagt aaatttgggc gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga 300
ataagaggaa gtgaaatctg aataattttg tgttactcat agcgcgtaat actggtacct 360
caatattggc cattagccat attattcatt ggttatatag cataaatcaa tattggctat 420
tggccattgc atacgttgta tctatatcat aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca 480
atatgaccgc catgttggca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 540
tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 600
cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 660
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 720
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac 780
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg 840
cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc 900
aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 960
aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactgc 1020
gatcgcccgc cccgttgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 1080
gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatca ctagaagctt tattgcggta gtttatcaca 1140
gttaaattgc taacgcagtc agtgcttctg acacaacagt ctcgaactta agctgcagtg 1200
actctcttaa ggtagccttg cagaagttgg tcgtgaggca ctgggcaggt aagtatcaag 1260
gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggct tgtcgagaca gagaagactc 1320
ttgcgtttct gataggcacc tattggtctt actgacatcc actttgcctt tctctccaca 1380
ggtgtccact cccagttcaa ttacagctct taaggctaga gtacttaata cgactcacta 1440
taggctagcc tcgagatgaa ctttctgctg tcttgggtgc attggagcct tgccttgctg 1500
ctctacctcc accatgccaa gtggtcccag gctgcaccca tggcagaagg aggagggcag 1560
aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc 1620
gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca 1680
tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg 1740
cccactgagg agtccaacat caccatgcag attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag 1800
cacataggag agatgagctt cctacagcac aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat 1860
agagcaagac aagaaaatcc ctgtgggcct tgctcagagc ggagaaagca tttgtttgta 1920
caagatccgc agacgtgtaa atgttcctgc aaaaacacag actcgcgttg caaggcgagg 1980
cagcttgagt taaacgaacg tacttgcaga tgtgacaagc cgaggcggtg actcgagaat 2040
tcacgcgtcg agcatgcatc tagggcggcc aattccgccc ctctccctcc ccccccccta 2100
acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgtgatttt 2160
ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 2220
cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 2280
tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 2340
gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 2400
aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 2460
aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 2520
taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 2580
cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa 2640
cacgatgata agcttgccac aacccgggat cctctagagt cgacatgtgg gtgaccaaac 2700
tcctgccagc cctgctgctg cagcatgtcc tcctgcatct cctcctgctc cccatcgcca 2760
tcccctatgc agagggacaa aggaaaagaa gaaatacaat tcatgaattc aaaaaatcag 2820
caaagactac cctaatcaaa atagatccag cactgaagat aaaaaccaaa aaagtgaata 2880
ctgcagacca atgtgctaat agatgtacta ggaataaagg acttccattc acttgcaagg 2940
cttttgtttt tgataaagca agaaaacaat gcctctggtt ccccttcaat agcatgtcaa 3000
gtggagtgaa aaaagaattt ggccatgaat ttgacctcta tgaaaacaaa gactacatta 3060
gaaactgcat cattggtaaa ggacgcagct acaagggaac agtatctatc actaagagtg 3120
gcatcaaatg tcagccctgg agttccatga taccacacga acacagcttt ttgccttcga 3180
gctatcgggg taaagaccta caggaaaact actgtcgaaa tcctcgaggg gaagaagggg 3240
gaccctggtg tttcacaagc aatccagagg tacgctacga agtctgtgac attcctcagt 3300
gttcagaagt tgaatgcatg acctgcaatg gggagagtta tcgaggtctc atggatcata 3360
cagaatcagg caagatttgt cagcgctggg atcatcagac accacaccgg cacaaattct 3420
tgcctgaaag atatcccgac aagggctttg atgataatta ttgccgcaat cccgatggcc 3480
agccgaggcc atggtgctat actcttgacc ctcacacccg ctgggagtac tgtgcaatta 3540
aaacatgcgc tgacaatact atgaatgaca ctgatgttcc tttggaaaca actgaatgca 3600
tccaaggtca aggagaaggc tacaggggca ctgtcaatac catttggaat ggaattccat 3660
gtcagcgttg ggattctcag tatcctcacg agcatgacat gactcctgaa aatttcaagt 3720
gcaaggacct acgagaaaat tactgccgaa atccagatgg gtctgaatca ccctggtgtt 3780
ttaccactga tccaaacatc cgagttggct actgctccca aattccaaac tgtgatatgt 3840
cacatggaca agattgttat cgtgggaatg gcaaaaatta tatgggcaac ttatcccaaa 3900
caagatctgg actaacatgt tcaatgtggg acaagaacat ggaagactta catcgtcata 3960
tcttctggga accagatgca agtaagctga atgagaatta ctgccgaaat ccagatgatg 4020
atgctcatgg accctggtgc tacacgggaa atccactcat tccttgggat tattgcccta 4080
tttctcgttg tgaaggtgat accacaccta caatagtcaa tttagaccat cccgtaatat 4140
cttgtgccaa aacgaaacaa ttgcgagttg taaatgggat tccaacacga acaaacatag 4200
gatggatggt tagtttgaga tacagaaata aacatatctg cggaggatca ttgataaagg 4260
agagttgggt tcttactgca cgacagtgtt tcccttctcg agacttgaaa gattatgaag 4320
cttggcttgg aattcatgat gtccacggaa gaggagatga gaaatgcaaa caggttctca 4380
atgtttccca gctggtatat ggccctgaag gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca 4440
ggcctgctgt cctggatgat tttgttagta cgattgattt acctaattat ggatgcacaa 4500
ttcctgaaaa gaccagttgc agtgtttatg gctggggcta cactggattg atcaactatg 4560
atggcctatt acgagtggca catctctata taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc 4620
atcgagggaa ggtgactctg aatgagtctg aaatatgtgc tggggctgaa aagattggat 4680
caggaccatg tgagggggat tatggtggcc cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa 4740
tggttcttgg tgtcattgtt cctggtcgtg gatgtgccat tccaaatcgt cctggtattt 4800
ttgtccgagt agcatattat gcaaaatgga tacacaaaat tattttaaca tataaggtac 4860
cacagtcata ggtcgacccg ggcggccgct tccctttagt gagggttaat gcttcgagca 4920
gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa 4980
tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat 5040
aaacagatct gggcgtggtt aagggtggga aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag 5100
ttttgtatct gttttgcagc agccgccgcc gccatgagca ccaactcgtt tgatggaagc 5160
attgtgagct catatttgac aacgcgcatg cccccatggg ccggggtgcg tcagaatgtg 5220
atgggctcca gcattgatgg tcgccccgtc ctgcccgcaa actctactac cttgacctac 5280
gagaccgtgt ctggaacgcc gttggagact gcagcctccg ccgccgcttc agccgctgca 5340
gccaccgccc gcgggattgt gactgacttt gctttcctga gcccgcttgc aagcagtgca 5400
gcttcccgtt catccgcccg cgatgacaag ttgacggctc ttttggcaca attggattct 5460
ttgacccggg aacttaatgt cgtttctcag cagctgttgg atctgcgcca gcaggtttct 5520
gccctgaagg cttcctcccc tcccaatgcg gtttaaaaca taaataaaaa accagactct 5580
gtttggattt ggatcaagca agtgtcttgc tgtctttatt taggggtttt gcgcgcgcgg 5640
taggcccggg accagcggtc tcggtcgttg agggtcctgt gtattttttc caggacgtgg 5700
taaaggtgac tctggatgtt cagatacatg ggcataagcc cgtctctggg gtggaggtag 5760
caccactgca gagcttcatg ctgcggggtg gtgttgtaga tgatccagtc gtagcaggag 5820
cgctgggcgt ggtgcctaaa aatgtctttc agtagcaagc tgattgccag gggcaggccc 5880
ttggtgtaag tgtttacaaa gcggttaagc tgggatgggt gcatacgtgg ggatatgaga 5940
tgcatcttgg actgtatttt taggttggct atgttcccag ccatatccct ccggggattc 6000
atgttgtgca gaaccaccag cacagtgtat ccggtgcact tgggaaattt gtcatgtagc 6060
ttagaaggaa atgcgtggaa gaacttggag acgcccttgt gacctccaag attttccatg 6120
cattcgtcca taatgatggc aatgggccca cgggcggcgg cctgggcgaa gatatttctg 6180
ggatcactaa cgtcatagtt gtgttccagg atgagatcgt cataggccat ttttacaaag 6240
cgcgggcgga gggtgccaga ctgcggtata atggttccat ccggcccagg ggcgtagtta 6300
ccctcacaga tttgcatttc ccacgctttg agttcagatg gggggatcat gtctacctgc 6360
ggggcgatga agaaaacggt ttccggggta ggggagatca gctgggaaga aagcaggttc 6420
ctgagcagct gcgacttacc gcagccggtg ggcccgtaaa tcacacctat taccgggtgc 6480
aactggtagt taagagagct gcagctgccg tcatccctga gcaggggggc cacttcgtta 6540
agcatgtccc tgactcgcat gttttccctg accaaatccg ccagaaggcg ctcgccgccc 6600
agcgatagca gttcttgcaa ggaagcaaag tttttcaacg gtttgagacc gtccgccgta 6660
ggcatgcttt tgagcgtttg accaagcagt tccaggcggt cccacagctc ggtcacctgc 6720
tctacggcat ctcgatccag catatctcct cgtttcgcgg gttggggcgg ctttcgctgt 6780
acggcagtag tcggtgctcg tccagacggg ccagggtcat gtctttccac gggcgcaggg 6840
tcctcgtcag cgtagtctgg gtcacggtga aggggtgcgc tccgggctgc gcgctggcca 6900
gggtgcgctt gaggctggtc ctgctggtgc tgaagcgctg ccggtcttcg ccctgcgcgt 6960
cggccaggta gcatttgacc atggtgtcat agtccagccc ctccgcggcg tggcccttgg 7020
cgcgcagctt gcccttggag gaggcgccgc acgaggggca gtgcagactt ttgagggcgt 7080
agagcttggg cgcgagaaat accgattccg gggagtaggc atccgcgccg caggccccgc 7140
agacggtctc gcattccacg agccaggtga gctctggccg ttcggggtca aaaaccaggt 7200
ttcccccatg ctttttgatg cgtttcttac ctctggtttc catgagccgg tgtccacgct 7260
cggtgacgaa aaggctgtcc gtgtccccgt atacagactn nngtttaaac gaattcnnnt 7320
ataaaatgca aggtgctgct caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca 7380
tcgtagtcat gctcatgcag ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac 7440
accatttttc tctcaaacat gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa 7500
aaaacattta aacattagaa gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa 7560
gacggactac ggccatgccg gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca 7620
ccaccgacag ctcctcggtc atgtccggag tcataatgta agactcggta aacacatcag 7680
gttgattcat cggtcagtgc taaaaagcga ccgaaatagc ccgggggaat acatacccgc 7740
aggcgtagag acaacattac agcccccata ggaggtataa caaaattaat aggagagaaa 7800
aacacataaa cacctgaaaa accctcctgc ctaggcaaaa tagcaccctc ccgctccaga 7860
acaacataca gcgcttcaca gcggcagcct aacagtcagc cttaccagta aaaaagaaaa 7920
cctattaaaa aaacaccact cgacacggca ccagctcaat cagtcacagt gtaaaaaagg 7980
gccaagtgca gagcgagtat atataggact aaaaaatgac gtaacggtta aagtccacaa 8040
aaaacaccca gaaaaccgca cgcgaaccta cgcccagaaa cgaaagccaa aaaacccaca 8100
acttcctcaa atcgtcactt ccgttttccc acgttacgta acttcccatt ttaagaaaac 8160
tacaattccc aacacataca agttactccg ccctaaaacc tacgtcaccc gccccgttcc 8220
cacgccccgc gccacgtcac aaactccacc ccctcattat catattggct tcaatccaaa 8280
ataaggtata ttattgatga tnnnttaatt aaggatccnn ncggtgtgaa ataccgcaca 8340
gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 8400
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 8460
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 8520
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 8580
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 8640
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 8700
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 8760
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 8820
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 8880
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 8940
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 9000
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 9060
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 9120
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 9180
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 9240
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 9300
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 9360
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 9420
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 9480
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 9540
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 9600
atagtttgcg caacgttgtt gnnnnnnaaa aaggatcttc acctagatcc ttttcacgta 9660
gaaagccagt ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg 9720
gacaagggaa aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg 9780
atagctagac tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc 9840
ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat 9900
ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 9960
tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 10020
tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 10080
ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga 10140
cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 10200
cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 10260
cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 10320
gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 10380
gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 10440
tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga 10500
ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 10560
cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 10620
gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 10680
gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 10740
gttcttctga attttgttaa aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 10800
aaatcggcaa catcccttat aaatcaaaag aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc 10860
cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 10920
ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc caaatcaagt tttttgcggt 10980
cgaggtgccg taaagctcta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 11040
ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 11100
gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcg cgcttaatgc 11160
gccgctacag ggcgcgtcca ttcgccattc aggatcgaat taattcttaa ttaacatcat 11220
caataatata cctta 11235

Claims (2)

1.携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建，步骤如下：
（1）引物设计与合成
根据人源血管内皮生长因子（hVEGF165）的基因序列，设计两条扩增hVEGF165（1-576bp）的引物，上游引物（hVEGF165-F）为5’ ata ggc tag cct cga g gccacc atg aac tttctg ctg tct tgg 3’，下游引物（hVEGF165-R）为5’ cgc gtg aat tct cga g tca ccg cctcgg ctt gtc aca 3’，下划线序列分别代表XhoI酶切位点；根据人源肝细胞生长因子（hHGF）的基因序列，设计两条扩增hHGF（1-2187 bp）的引物，上游引物（hHGF -F）为5’ atcctc tag agt cga c gccacc atg tgg gtg acc aaa ctc ctg 3’，下游引物（hHGF-R）为 5’ggc cgc ccg ggt cga c cta tga ctg tgg tac ctt ata 3’，下划线序列分别代表SalI酶切位点；
（2）hVEGF165的扩增与克隆
以phVEGF165-cDNA为模板，hVEGF165-F和hVEGF165-R为引物，扩增hVEGF165片段；pShuttle-IRES经XhoI酶切后，利用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒与hVEGF165进行定向克隆，PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下进行转化，完成定向克隆；后续采用酶切及测序进行鉴定，得到了重组载体pShuttle-hVEGF165-IRES；
（3）hHGF的扩增与克隆
以phHGF-cDNA为模板，hHGF-F和hHGF-R为引物，扩增hHGF片段； pShuttle-hVEGF165-IRES经SalI酶切后，利用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒与hHGF（2187bp）进行定向克隆，PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下进行转化，完成定向克隆；后续采用酶切及测序进行鉴定，得到了重组载体pShuttle-hVEGF165-IRES-hHGF；
（4）携带双基因重组腺病毒载体pAd-hVEGF65-IRES-hHGF的构建
将pShuttle-hVEGF165-IRES-hHGF用Pme I进行酶切，然后进行低熔点琼脂糖凝胶电脉回收后，再用CIAP去磷酸化，苯酚/氯仿抽提后，转化BJ5183-AD-1感受态细胞，通过细菌内同源重组法获得的阳性重组质粒命名为pAd-hVEGF165-IRES-hHGF；重组质粒采用Pac I 酶切鉴定，证明重组成功；
（5）重组腺病毒Ad-hVEGF165- hHGF的包装
将经Pac I线性化的阳性重组质粒进行苯酚/氯仿抽提，乙醇/醋酸钠共沉淀后加入消毒三蒸水溶解，待完全溶解后加入脂质体Lipofectamine® LTX Plus Reagent转染达到90%以上融合的AD293细胞，置37℃、5%CO2培养箱中孵育，l4-20 d后即可观察到病毒蚀斑的出现，将出现细胞病变的AD293细胞进行倒置相差显微镜观察并行照相，当出现完全细胞病变时收集病变的细胞；
（6）重组腺病毒的扩增、纯化及其滴度测定：
取重组腺病毒上清，加入90%融合的AD293细胞中，在培养箱中培养，镜下观察到95-100%细胞出现细胞病变后，离心收集细胞，并将细胞于-80℃和37℃之间反复冻融3次，离心收集上清，对重组腺病毒上清进行CsCl密度梯度离心纯化两次，并将纯化后的腺病毒采用透析液4℃透析两次，每次24 h；将透析后的病毒液进行滴度测定，采用紫外分光光度计测定病毒的颗粒数和纯度；
（7）Ad-hVEGF165- hHGF转染hVSMC后VEGF165和HGF的表达
待接种的hVSMC生长至70%融合时，加入Ad-GFP病毒液以100感染复数转染hVSMC，2 h后弃去病毒液，PBS洗3次，加入含10% FCS的DMEM培养液培养48 h后收集并裂解细胞，经Western blot检测VEGF165和HGF的表达情况。
2.根据权利要求1所述携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建，其特征在于：
hVEGF165的扩增与克隆中，扩增条件为95°C for 1 min，95°C for 15 sec，68°C for3 min，30 cycles；克隆条件为50℃反应20 min；
hHGF的扩增与克隆中，扩增条件为95°C for 1 min，95°C for 15 sec，68°C for 3min，30 cycles；克隆条件为50℃反应20 min；
重组腺病毒Ad-hVEGF165- hHGF的包装中，孵育条件为置37℃、5%CO2培养箱中孵育。
CN202010975479.6A 2020-09-16 2020-09-16 携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建 Pending CN112080523A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010975479.6A CN112080523A (zh) 2020-09-16 2020-09-16 携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010975479.6A CN112080523A (zh) 2020-09-16 2020-09-16 携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112080523A true CN112080523A (zh) 2020-12-15

Family

ID=73736876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010975479.6A Pending CN112080523A (zh) 2020-09-16 2020-09-16 携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112080523A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110760542A (zh) * 2019-11-18 2020-02-07 天津大学 一种共表达znf580和vegf165双基因的质粒及应用
CN112111516A (zh) * 2020-09-16 2020-12-22 十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院） 一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒及构建

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105132461A (zh) * 2015-09-10 2015-12-09 天津农学院 共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105132461A (zh) * 2015-09-10 2015-12-09 天津农学院 共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAVEL MAKAREVICH等: "Combined Transfer of Human VEGF165 and HGF Genes Renders Potent Angiogenic Effect in Ischemic Skeletal Muscle", 《PLOS ONE》 *
郭建强等: "共表达甲型流感病毒 M1和 HA 双基因的重组腺病毒的构建及鉴定", 《病毒学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110760542A (zh) * 2019-11-18 2020-02-07 天津大学 一种共表达znf580和vegf165双基因的质粒及应用
CN110760542B (zh) * 2019-11-18 2022-07-26 天津大学 一种共表达znf580和vegf165双基因的质粒及应用
CN112111516A (zh) * 2020-09-16 2020-12-22 十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院） 一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒及构建

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6156567A (en) Truncated transcriptionally active cytomegalovirus promoters
US6090393A (en) Recombinant canine adenoviruses, method for making and uses thereof
CN112921054B (zh) 一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用
CN112080523A (zh) 携带血管内皮生长因子及肝细胞生长因子双基因腺病毒载体的构建
IL174489A (en) A method for preparing packaging cells containing adenovirus virus sequences encoding e1a, and e1b, recombinant molecules used in the method and cells containing these molecules
CN106755103B (zh) 溶瘤腺病毒，用于制备该腺病毒的载体及其应用
CN110628821B (zh) 一种细胞模型及其制备方法、应用
CN113604482A (zh) 一种表达hpv68l1的多核苷酸及其表达载体、宿主细胞和应用
CN109234318B (zh) 一种提高红曲霉菌胞外色素的方法
CN111235118A (zh) 一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建方法及应用
CN112980799B (zh) 一种构建klf12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用
CN113667683B (zh) 一种表达hpv 39l1的多核苷酸及其表达载体、宿主细胞和应用
US20040198683A1 (en) Ex vivo and in vivo expression of the thrombomodulin gene for the treatment of cardiovascular and peripheral vascular diseases
CN109266686A (zh) 一种基因组核苷酸定点替换的方法
CN114540355A (zh) Hhex软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法
CN112760342B (zh) 一种用于glp-1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株
CN113755442B (zh) 一种用于药物活性测定的细胞株及其制备方法与应用
CN111593057B (zh) 一种增加香石竹花朵直径的基因与应用
CN107267538A (zh) 一种植物质体表达载体的构建方法及应用
CN113621650A (zh) 一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用
CN110452893A (zh) 一种高保真CRISPR/AsCpf1突变体的构建及其应用
CN109777829A (zh) 一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法
CN109265562B (zh) 一种切刻酶及其在基因组碱基替换中的应用
CN111304214B (zh) 一种增加香石竹花瓣数量的基因与应用
KR102476901B1 (ko) 대장암 세포 특이적 감염 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 대장암 치료용 암용해성 바이러스 및 이를 이용한 대장암 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20201215