CN110760542A - 一种共表达znf580和vegf165双基因的质粒及应用 - Google Patents

一种共表达znf580和vegf165双基因的质粒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒及应用，所述质粒含有ZNF580基因和VEGF165基因，所述ZNF580基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述VEGF165基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述质粒用pZNF580‑ln‑VEGF165所示。本发明一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，其中的ZNF580和VEGF165基因具有协同作用，有更好的促内皮细胞增殖、迁移和血管生成。

Description

一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒及应用
技术领域
本发明涉及基因治疗技术领域，具体涉及一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒及应用。
背景技术
基因治疗是实现快速内皮化、血管化的理想方法之一，实现理想的基因治疗效果需同时具备安全有效的基因载体和治疗基因。近年来，多功能非病毒基因载体的设计和开发成为热点，其中多肽类载体因其卓越的生物相容性广受关注。在治疗基因方面，关于编码促血管生成生长因子如血管内皮生长因子(VEGFs)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)等基因的研究较多，研究者将这些基因通过基因载体靶向递送至内皮细胞(ECs)，使其在细胞中过表达以促进ECs的增殖、迁移和血管形成能力。
VEGFs能高度特异性地促血管内皮细胞生长，被认为是最有效的内皮生长因子之一。VEGF基因表达的VEGFs分泌到细胞外，与细胞膜上的血管内皮生长因子受体(VEGFR)特异性结合，导致VEGFR自身磷酸化，激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，从而促进ECs的增殖、迁移和血管形成等。
近年来，锌指蛋白基因ZNF580被证明在促进ECs的增殖和迁移中起重要作用。虽然目前其功能机制的研究尚不成熟，但现有证据表明ZNF580蛋白作用于细胞核，可能作为激活剂和抑制剂影响某些基因的转录阶段，如介导一氧化氮合酶(eNOS)基因、基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因和VEGF基因等的表达。
目前，促进血管生成的基因治疗方法通常使用只含有一种治疗基因的递送体系。然而在基因治疗中，单一基因的过表达很难达到所需的治疗效果。研究表明，多基因共表达可能协同提高基因治疗的效果。
构建多基因共表达质粒是同时递送几种疗效相同或不同的基因的有效方式。目前，ZNF580和VEGF165基因已被证实均能够促进ECs的增殖和迁移，但两基因是否具有协同作用效果尚不清晰，目前尚未有共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒。
本发明的第二个目的是提供一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒在制备促血管生成药物的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，所述质粒含有ZNF580基因和VEGF165基因，所述ZNF580基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述VEGF165基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述质粒用pZNF580-ln-VEGF165所示。
所述l的核苷酸序列为GGGGS；所述n＝0-5个，优选的是n＝2-5个。
上述质粒在制备促血管生成药物的应用。
本发明的优点是：
本发明一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，其中的ZNF580和VEGF165基因具有协同作用，有更好的促内皮细胞增殖、迁移和血管生成。
附图说明
图1为转染不同质粒后，HUVECs(人脐静脉内皮细胞)内ZNF580和VEGF165的mRNA相对含量的荧光定量PCR结果图。
图2为Westernblot蛋白表达结果图。
图3为CCK-8细胞增殖结果图。
图4为Transwell细胞迁移结果图。
图5为体外血管形成结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，该实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做改动或修改，该等价形式同样落于本申请的权利要求所限定的范围。
ZNF580基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述VEGF165基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
l的核苷酸序列为GGGGS。
pIRES2-EGFP质粒(商品)。
实施例1
一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，所述质粒含有ZNF580基因和VEGF165基因，所述质粒用pZNF580-ln-VEGF165所示，其中n＝0。
实施例2
一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，所述质粒含有ZNF580基因和VEGF165基因，所述质粒用pZNF580-ln-VEGF165所示，其中n＝2。
实施例3
一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，所述质粒含有ZNF580基因和VEGF165基因，所述质粒用pZNF580-ln-VEGF165所示，其中n＝5。
实施例4
pZNF580-VEGF165(实施例1)的制备：
委托生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成ZNF580和VEGF165基因，核苷酸序列分别用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，并将合成的ZNF580和VEGF165基因直接连接到pIRES2-EGFP质粒载体上，得到重组的一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，即pZNF580-ln-VEGF165，其中n＝0。
实施例5
pZNF580-l2-VEGF165(实施例2)的制备：
委托生工生物工程(上海)股份有限公司先将合成的ZNF580和VEGF165基因通过ln(l的核苷酸序列为GGGGS；n＝2)连接起来，再将其整体连接到pIRES2-EGFP质粒载体上，得到重组的一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，即pZNF580-ln-VEGF165，其中n＝2。
实施例6
pZNF580-l5-VEGF165(实施例3)的制备：
委托生工生物工程(上海)股份有限公司先将合成的ZNF580和VEGF165基因通过ln(l的核苷酸序列为GGGGS；n＝5)连接起来，再将其整体连接到pIRES2-EGFP质粒载体上，得到重组的一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，即pZNF580-ln-VEGF165，其中n＝5。
实施例7
pZNF580的制备：
委托生工生物工程(上海)股份有限公司先将合成的ZNF580基因直接连接到pIRES2-EGFP质粒载体上，得到重组ZNF580质粒，即pZNF580。
实施例8
pVEGF165的制备：
委托生工生物工程(上海)股份有限公司先将合成的VEGF165基因直接连接到pIRES2-EGFP质粒载体上，得到重组VEGF165质粒，即pVEGF165。
实施例9
负载不同质粒的基因复合物的制备：
将多肽载体REDV-TAT-NLS-H12(其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)与不同质粒pZNF580，pVEGF165和pZNF580-ln-VEGF165(n＝0,2,5)复合，制备质量比为5：1的基因复合物：
取浓度为200μg/mL的pZNF580，pVEGF165和pZNF580-ln-VEGF165(n＝0,2,5)水溶液15μL，分别滴加到30μL浓度为500μg/mL的REDV-TAT-NLS-H12载体的PBS溶液(10mM,pH＝7.2)中，混合均匀并室温孵育30min，得到负载不同质粒的基因复合物，即REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580,REDV-TAT-NLS-H12/pVEGF165,REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l0-VEGF165,REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-12-VEGF165和REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-15-VEGF165。
实施例10
通过荧光定量PCR实验评估HUVECs(人脐静脉内皮细胞，商品)转染不同基因复合物后的ZNF580和VEGF165的mRNA表达水平。
步骤为：将HUVECs接种到具有完全培养基的6孔板中培养至约80％细胞融合，饥饿12小时后，将实施例7制备的REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580,REDV-TAT-NLS-H12/pVEGF165,REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l0-VEGF165,REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-12-VEGF165和REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-15-VEGF165复合物分别加入到1mL的无血清培养基中并替换掉6孔板中细胞培养基，加入相同体积PBS溶液的一组作为空白对照。培养4小时后更换为完全培养基，并在培养箱中继续培养24小时。为表征不同组mRNA水平的转染效率。对转染24小时后的HUVECs进行实时定量PCR实验以估计HUVECs的mRNA表达量。用PBS溶液洗涤HUVECs三次后，每孔加入500μL的TRIzol试剂裂解以提取总RNA。然后，将RNA逆转录成cDNA用于7500实时PCR系统上完成实时荧光定量PCR分析。
所述PBS溶液为10mM,pH＝pH＝7.2；
分析结果：图1为转染不同质粒后，HUVECs内ZNF580和VEGF165 mRNA相对含量的荧光定量PCR结果图，其中，
A为对照组HUVECs中VEGF165和ZNF580的mRNA表达量；
B为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的mRNA表达量；
C为转染REDV-TAT-NLS-H12/pVEGF165基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的mRNA表达量；
D为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l0-VEGF165基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的mRNA表达量；
E为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l2-VEGF165基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的mRNA表达量；
F为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l5-VEGF165基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的mRNA表达量。
与空白对照组相比，REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580复合物转染的HUVECs的ZNF580mRNA表达较高，VEGF165 mRNA表达量也提升明显，同时REDV-TAT-NLS-H12/pVEGF165复合物转染组的VEGF165和ZNF580 mRNA的表达也均升高，这表明VEGF165和ZNF580两种基因具有互相促进效果。此外，双基因质粒转染的HUVECs比单基因质粒转染组具有更高的mRNA水平，且ZNF580和VEGF165基因之间的核苷酸序列越长，mRNA表达越高。同时转染含ZNF580和VEGF165双基因的质粒更有利于ZNF580和VEGF165的mRNA转录，可能是两基因在HUVECs内的协同作用和正反馈造成的。REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l5-VEGF165转染的HUVECs的ZNF580和VEGF165 mRNA表达量最高，可能是由于较长的核苷酸序列减少了两个基因同时转录的空间位阻，使得mRNA转录更加顺畅。
实施例11
通过蛋白印迹实验Western blot评价HUVECs转染不同基因复合物后的ZNF580和VEGF165的蛋白表达水平。
步骤为：转染步骤与实施例10相同。将蛋白质裂解液RIPA和PSMF(v/v＝100/1)加入转染24小时后的细胞中冰上裂解细胞30分钟，随后进一步超声破裂并以1,3000rpm转速离心6分钟后，取上清液获得总蛋白质。然后将定量蛋白质和上样缓冲液(5×)配置好用于12％SDS-PAGE胶电泳，并将电泳完的PAGE胶上的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5％牛奶密封2小时，并在4℃下分别用含与兔抗人ZNF580多克隆抗体和兔抗人VEGF165多克隆抗体的TBST封存过夜，β-actin蛋白用作对照。过夜后，TBST洗膜3次并抗兔二抗孵育2小时。再将膜用TBST洗涤三次并通过ECLWestern Blotting Substrate Kit显色。
分析结果：图2为转染不同质粒后，HUVECs内ZNF580和VEGF165蛋白相对含量的Westernblot结果图，(1)为显影图，(2)为定量统计图，其中，A为对照组HUVECs中VEGF165和ZNF580的蛋白表达量；
B为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的蛋白表达量；
C为转染REDV-TAT-NLS-H12/pVEGF165基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的蛋白表达量；
D为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l0-VEGF165基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的蛋白表达量；
E为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l2-VEGF165基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的蛋白表达量；
F为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l5-VEGF165基因复合物后HUVECs中VEGF165和ZNF580的蛋白表达量。
与对照组相比，VEGF165的相对蛋白水平在所有其他组中均增加，其中双基因质粒转染的HUVECs高于单基因组，REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l5-VEGF165转染组的VEGF165蛋白表达最高。ZNF580蛋白表达的趋势与VEGF165相同。这些结果与荧光定量PCR结果一致，进一步证实了VEGF165基因和ZNF580基因对相互基因表达的协同作用。
实施例12
通过CCK-8细胞增殖实验来评价HUVECs转染不同基因复合物后的增殖能力。
在96孔板中接种约2500个HUVECs，并在完全培养基中培养至约60％细胞融合度。用无血清培养基饥饿处理12小时后，同时以3μg/mL的浓度滴加不同的基因复合物至无血清培养基中，每个样品设置四个重复孔。转染4小室后所有孔更换为正常培养基并继续培养12,24,48小时，每孔加入10μL的CCK-8试剂并进一步培养2小时。通过酶标仪测量450nm处的吸光度值反应细胞的相对活力，可计算获得HUVECs的增殖情况。
分析结果：图3为转染12，24，48小时后HUVECs的增殖曲线。
不同基因复合物转染的HUVECs与等体积PBS缓冲液处理的HUVECs相比，细胞数量随时间变化呈明显的增长趋势，且双基因质粒转染组的细胞活力明显高于单基因质粒处理组，其中REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l5-VEGF165处理的组在72小时时显示出最佳增殖率(相对细胞存活率高达126％)。这些结果表明，双基因质粒转染HUVECs引起ZNF580和VEGF165基因的高表达的同时，有利于HUVECs的增殖。
实施例13
利用Transwell细胞迁移实验来评价HUVECs转染不同基因复合物后的迁移能力。
步骤如下：转染步骤与实施例10相同。将转染24小时后的细胞消化下来并用无血清DMEM培养基分散，取200μL细胞悬液接种于Transwell上室内(8×104细胞/孔)，下室加入500μL完全培养基。孵箱中培养6小时后，取出Transwell小室于PBS缓冲液中清洗除去未粘附细胞，随后用4％的多聚甲醛固定10分钟，再用无菌棉签轻轻擦掉Transwell上室内的细胞。然后，用结晶紫染料将迁移过Transwell滤膜到达下表面的HUVECs染色5分钟，PBS缓冲液洗去浮色后用显微镜观察并拍照。
分析结果：图4(1)为6小时后的细胞迁移图，(2)为由Image-ProPlus6.0计算的细胞迁移数量。其中，
A为对照组HUVECs的迁移数量；
B为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580基因复合物后HUVECs的迁移数量；
C为转染REDV-TAT-NLS-H12/pVEGF165基因复合物后HUVECs的迁移数量；
D为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l0-VEGF165基因复合物后HUVECs的迁移数量；
E为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l2-VEGF165基因复合物后HUVECs的迁移数量；
F为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l5-VEGF165基因复合物后HUVECs的迁移数量。
相对于对照组，用不同的REDV-TAT-NLS-H12/pDNA复合物处理的HUVECs显示出更强的细胞迁移能力，双基因质粒转染的HUVECs迁移能力强于单基因质粒转染组，双基因质粒处理的组之间没有显着差异。这说明ZNF580和VEGF165基因均可促进HUCECs的迁移，双基因质粒的转染与单基因质粒相比，更加有利于促进HUVECs的迁移能力。
实施例14
通过体外血管形成实验评价转染后HUVECs的血管生成能力。
步骤如下：转染步骤与实施例10相同。提前将基质胶放在4℃下过夜融化，同时将96孔板和所需枪头放在-20℃冰箱中预冷。实验时，先取60μL基质胶加入96孔板所需孔中，并在37℃孵箱中孵育30分钟使基质胶固化。将6孔板中的转染24小时后的细胞消化下来，用无血清DMEM分散并接种在基质胶表面(4×104细胞/孔)，继续培养6小时后观察。用显微镜拍下基质胶表面形成的血管环，并用ImageJ 2.1计算和统计成管的数量。
分析结果：图5(1)为各组的血管形成情况图，(2)为由ImageJ 2.1计算统计的血管数量。A为对照组细胞形成的血管环数；
B为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580基因复合物后HUVECs形成的血管环数；
C为转染REDV-TAT-NLS-H12/pVEGF165基因复合物后HUVECs形成的血管环数；
D为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l0-VEGF165基因复合物后HUVECs形成的血管环数；
E为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l2-VEGF165基因复合物后HUVECs形成的血管环数；
F为转染REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l5-VEGF165基因复合物后HUVECs形成的血管环数。与对照组相比，REDV-TAT-NLS-H12/pDNA复合物处理的HUVECs显示出强的血管生成能力，其中双基因质粒复合物处理组的HUVECs成管数更多，且REDV-TAT-NLS-H12/pZNF580-l5-VEGF165复合物的促血管生成能力最强。这是由于双基因共表达质粒转染后，使细胞内ZNF580和VEGF165基因同时过表达，协同促进了两基因的mRNA和蛋白质表达水平，从而促进了HUVECs的增殖、迁移和血管形成能力。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggaaggcat ttgagccatt ttggggtgta tagatgtagt aagacgatgg gttccgtagt 60
ggggagaggt gactagactt cgaggtgcta agtgtaggaa caggatggaa aagccctagt 120
gaaatgtggg gaattgggtt agtggggctc tggggaggta cctagagagg aagtgaggga 180
ggccacggaa tatgaagatg gggaggccct gcggcatgta gtggggacgg agggccagga 240
ggccgatacg ggggccggtg ggggggtagg gggcggcaaa gggaggggaa gtaaactgaa 300
ctggggctgg gcaacaggaa aaaagaagaa accacagatt agagaaatct cggcggtcag 360
gaggcccggg gtctaagatg taaagaggta aacagattta gggattgatt gtctgctggg 420
gtgggttgag aggagaaaag ggaagaaaag tcgggggact acgtcctcag acctgacctg 480
agtggtgaga ggtggaccca ggaggagtgg caggtggtgg cggggttttg cagagctcag 540
ttggaggccc tctccgaggc agcttgatgg aacgtgggag agccgggctg gagtcacagt 600
ttttattttg ctagggaggt agtcagtggc gcacaaaggg taacaagcag tgatagtggg 660
gatgctttcc attttaggaa acttttccta aaaggaagtg gcaattttaa ctaatctccc 720
ctccgccgct cccagctgcc actccagatg ctgctgctgc cgccgcggcc accccaccct 780
cggtcctcct ctccggaggc catggaccca ccgcccccca aggctccccc tttccccaag 840
gcggaaggcc cctcctccac tccttcctcg gcggcggggc cccgaccccc gcggctgggc 900
cgccacctcc tcatcgacgc caatggggtc ccctacacat acacggtgca gctggaggag 960
gagccccggg gcccgcccca gcgcgaggcg cccccaggag agcccggccc tcgcaagggc 1020
tacagctgcc cggagtgcgc ccgtgtcttt gccagccctc tgcggctgca gagccaccgc 1080
gtgtcgcact cggacctcaa gcccttcacg tgcggcgcct gcggcaaggc cttcaagcgc 1140
tccagccacc tgtcgcggca tcgcgccacg caccgcgccc gcgccgggcc gccgcacacc 1200
tgcccgctct gcccacgccg cttccaggac gccgcggagc tggcgcagca cgtgcgcctc 1260
cactaagctc gagacccggc ctgtgctgcc ctgcccgtct cagggccacc aagtctgacc 1320
cacacagcgt cactcactcc cacacacacc ccctggctct gctgaggtta ctgccttacc 1380
ctgggcctca gccccacctt ccaaagggag gagcatcatt ccttccttac cccctttcta 1440
gctgtgtgat gtagaccaaa gtcgttgccc ctccctgggc ctgggaacca gtcggaactg 1500
ggttccagtc cagctgtgct gtgtgagcct gtgcaagtga catgacctct ctaaaccttg 1560
gttttctgct ctctggagcg gtgaaccggt ggttgtctgc ggggaagaga tgataaagag 1620
cacgggcacg gtctggttca tttctgtatc tacccccctt ccgcccacgc ccccgaccct 1680
ttgctcaata aacattccgc actccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1726
<210> 2
<211> 1651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgcggaggc ttggggcagc cgggtagctc ggaggtcgtg gcgctggggg ctagcaccag 60
cgctctgtcg ggaggcgcag cggttaggtg gaccggtcag cggactcacc ggccagggcg 120
ctcggtgctg gaatttgata ttcattgatc cgggttttat ccctcttctt ttttcttaaa 180
catttttttt taaaactgta ttgtttctcg ttttaattta tttttgcttg ccattcccca 240
cttgaatcgg gccgacggct tggggagatt gctctacttc cccaaatcac tgtggatttt 300
ggaaaccagc agaaagagga aagaggtagc aagagctcca gagagaagtc gaggaagaga 360
gagacggggt cagagagagc gcgcgggcgt gcgagcagcg aaagcgacag gggcaaagtg 420
agtgacctgc ttttgggggt gaccgccgga gcgcggcgtg agccctcccc cttgggatcc 480
cgcagctgac cagtcgcgct gacggacaga cagacagaca ccgcccccag ccccagctac 540
cacctcctcc ccggccggcg gcggacagtg gacgcggcgg cgagccgcgg gcaggggccg 600
gagcccgcgc ccggaggcgg ggtggagggg gtcggggctc gcggcgtcgc actgaaactt 660
ttcgtccaac ttctgggctg ttctcgcttc ggaggagccg tggtccgcgc gggggaagcc 720
gagccgagcg gagccgcgag aagtgctagc tcgggccggg aggagccgca gccggaggag 780
ggggaggagg aagaagagaa ggaagaggag agggggccgc agtggcgact cggcgctcgg 840
aagccgggct catggacggg tgaggcggcg gtgtgcgcag acagtgctcc agccgcgcgc 900
gctccccagg ccctggcccg ggcctcgggc cggggaggaa gagtagctcg ccgaggcgcc 960
gaggagagcg ggccgcccca cagcccgagc cggagaggga gcgcgagccg cgccggcccc 1020
ggtcgggcct ccgaaaccat gaactttctg ctgtcttggg tgcattggag ccttgccttg 1080
ctgctctacc tccaccatgc caagtggtcc caggctgcac ccatggcaga aggaggaggg 1140
cagaatcatc acgaagtggt gaagttcatg gatgtctatc agcgcagcta ctgccatcca 1200
atcgagaccc tggtggacat cttccaggag taccctgatg agatcgagta catcttcaag 1260
ccatcctgtg tgcccctgat gcgatgcggg ggctgctgca atgacgaggg cctggagtgt 1320
gtgcccactg aggagtccaa catcaccatg cagattatgc ggatcaaacc tcaccaaggc 1380
cagcacatag gagagatgag cttcctacag cacaacaaat gtgaatgcag accaaagaaa 1440
gatagagcaa gacaagaaaa tccctgtggg ccttgctcag agcggagaaa gcatttgttt 1500
gtacaagatc cgcagacgtg taaatgttcc tgcaaaaaca cagactcgcg ttgcaaggcg 1560
aggcagcttg agttaaacga acgtacttgc agatgtgaca agccgaggcg gtgagccggg 1620
caggaggaag gagcctccct cagggtttcg g 1651
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Glu Asn Val Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro
1 5 10 15
Lys Lys Lys Arg Lys Val His His His His His His His His His His
20 25 30
His His

Claims (4)

1.一种共表达ZNF580和VEGF165双基因的质粒，其特征是所述质粒含有ZNF580基因和VEGF165基因，所述ZNF580基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述VEGF165基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述质粒用pZNF580-ln-VEGF165所示。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征是在所述l的核苷酸序列为GGGGS；所述n＝0-5的个。
3.根据权利要求2所述的质粒，其特征是在所述n＝2-5个。
4.权利要求1-3之一所述质粒在制备促血管生成药物的应用。
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