CN112773904A - 一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统及其制备方法和应用，首先制备不同质量比的预混基因溶液，再构筑不同质量比的双基因递送系统，即可取得具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统。与现有技术相比，本发明制备的具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统具有纳米尺度和适中的正电位，是细胞转染的一种优化表面性质，显著提升了相关mRNA和蛋白的表达量，实现了“1+1＞2”的协同效果，增强了基因治疗的效果。
Description
技术领域
本发明属于基因载体材料技术领域，具体涉及一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，科研人员主要致力于设计制备高效的基因载体来提高基因治疗的效果，并取得了令人满意的研究成果。同时，由于生理环境和功能的复杂性以及材料本身的缺陷，单纯从基因载体的角度做基因治疗研究也使得治疗效率达到了一个上限，很难再取得重大突破。这催促着新思路或新技术的出现进一步增强基因治疗的效果。在本专利中，我创造性地提出了一种“增强基因表达”的研究思路，并通过协同相互作用实现了提高关键基因在mRNA和蛋白水平上的表达，从而增强了基因的血管生成效果，为基因治疗用递送系统的设计提供了新型能量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统及其制备方法和应用，以实现增强基因的血管生成效果，为基因治疗用递送系统的设计提供了新型能量。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现。
一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统及制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1，制备预混基因溶液
将携带第一基因的第一质粒和携带第二基因的第二质粒进行混合，以得到预混基因溶液，第一质粒和第二质粒的质量比为(0.5—2)：1
第一基因为如下核苷酸序列(即第一基因)为：
atgctgctgctgccgccgcggccaccccaccctcggtcctcctctccggaggccatggacccaccgccccccaaggctccccctttccccaaggcggaaggcccctcctccactccttcctcggcggcggggccccgacccccgcggctgggccgccacctcctcatcgacgccaatggggtcccctacacatacacggtgcagctggaggaggagccccggggcccgccccagcgcgaggcgcccccaggagagcccggccctcgcaagggctacagctgcccggagtgcgcccgtgtctttgccagccctctgcggctgcagagccaccgcgtgtcgcactcggacctcaagcccttcacgtgcggcgcctgcggcaaggccttcaagcgctccagccacctgtcgcggcatcgcgccacgcaccgcgcccgcgccgggccgccgcacacctgcccgctctgcccacgccgcttccaggacgccgcggagctggcgcagcacgtgcgcctccactaa。
第二基因为核苷酸序列(即第二基因)为：
atgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctctacctccaccatgccaagtggtcccaggctgcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaagtggtgaagttcatggatgtctatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtggacatcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgcccctgatgcgatgcgggggctgctgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagtccaacatcaccatgcagattatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatgagcttcctacagcacaacaaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaagaaaatccctgtgggccttgctcagagcggagaaagcatttgtttgtacaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggcgaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgtgacaagccgaggcggtga。
第一质粒为质粒pZNF580；第二质粒为质粒pVEGF165；第一质粒和第二质粒的质量比为(1—2)：1
选择将第一质粒和第二质粒分别均匀分散在水中，以形成水溶液，再将两种水溶液进行混合，在室温20—25摄氏度静置，得到预混基因溶液，静置时间为40—60min。
步骤2，制备双基因递送系统
将多肽RH-34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合，以得到三种基因递送系统，即具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统；多肽RH-34与步骤1预混基因溶液中第一质粒和第二质粒质量之和的质量比为(3—6)：1
在多肽RH-34的缓冲溶液中，将RH-34均匀分散在pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中。
将多肽RH-34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合后，在室温20—25摄氏度下静置，得到双基因递送系统，静置时间为20—30min。
多肽RH-34为多肽的缩写，其序列如下，具体序列为Arg-Glu-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His。
多肽RH-34与步骤1预混基因溶液中两者质粒质量之和的质量比为(5—6)：1。
在步骤1中，采用第一质粒和第二质粒分别携带第一基因、第二基因。
与现有技术相比，本发明制备的具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统具有纳米尺度和适中的正电位，是细胞转染的一种优化表面性质。此外，该系统可将pZNF580和pVEGF165高效递送至血管内皮细胞，并且pZNF580和pVEGF165在细胞内协同表达，显著提升了相关mRNA和蛋白的表达量，实现了“1+1＞2”的协同效果,并且在血管生成实验中协同效果也被证实，增强了基因治疗的效果。
附图说明
图1为本发明中双基因递送系统的粒径和电位测试结果图。
图2为本发明中被基因递送系统转染的内皮细胞的相关mRNA表达图。
图3为本发明中被基因递送系统转染的内皮细胞的体外血管生成图。
具体实施方式
以下通过实施例的具体实施方式对本发明的上述内容作进一步的详细说明。在本发明实施例中，多肽RH-34购于吉尔生化(上海)有限公司，第一质粒pZNF580和第二质粒pVEGF165购买与生工生物工程(上海)股份有限公司。
第一质粒pZNF580的核苷酸序列(即第一基因，目标基因如序列表No.1所示)为：
atgctgctgctgccgccgcggccaccccaccctcggtcctcctctccggaggccatggacccaccgccccccaaggctccccctttccccaaggcggaaggcccctcctccactccttcctcggcggcggggccccgacccccgcggctgggccgccacctcctcatcgacgccaatggggtcccctacacatacacggtgcagctggaggaggagccccggggcccgccccagcgcgaggcgcccccaggagagcccggccctcgcaagggctacagctgcccggagtgcgcccgtgtctttgccagccctctgcggctgcagagccaccgcgtgtcgcactcggacctcaagcccttcacgtgcggcgcctgcggcaaggccttcaagcgctccagccacctgtcgcggcatcgcgccacgcaccgcgcccgcgccgggccgccgcacacctgcccgctctgcccacgccgcttccaggacgccgcggagctggcgcagcacgtgcgcctccactaa。
第二质粒pVEGF165的核苷酸序列(即第二基因，目标基因如序列表No.2所示)为：
atgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctctacctccaccatgccaagtggtcccaggctgcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaagtggtgaagttcatggatgtctatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtggacatcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgcccctgatgcgatgcgggggctgctgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagtccaacatcaccatgcagattatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatgagcttcctacagcacaacaaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaagaaaatccctgtgggccttgctcagagcggagaaagcatttgtttgtacaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggcgaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgtgacaagccgaggcggtga。
多肽RH-34为多肽缩写，其具体序列为，如序列表No.3所示
Arg-Glu-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His。
实施例1：不同质量比的预混基因溶液的制备
分别取质量浓度为50μg/mL的pZNF580水溶液和pVEGF165水溶液，按照pZNF580和pVEGF165的质量比为1:2，1:1和2:1将上述两个溶液混匀，室温下静置60min，得到预混基因溶液，分别记作p1:2，p1:1和p2:1。
实施例2：不同质量比的双基因递送系统的制备
取RH-34溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，按RH-34与总基因(即实施例1中两个质粒质量之和)的质量比为5：1与步骤1中制备的三种比例的预混基因溶液进行混匀，室温下静置30min，得到三种基因递送系统，即具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统，分别记作dual-p1:2，dual-p1:1和dual-p2:1。
RH-34为多肽的缩写，其序列为Arg-Glu-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-Hi s。
实施例3：单pZNF580基因递送系统的制备
取RH-34溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，按RH-34与pZNF580的质量比为5:1与50μg/mL的pZNF580水溶液进行混匀，室温下静置30min，得到单pZNF580基因递送系统，记作single-pZNF580。
实施例4：单pVEGF165基因递送系统的制备
取RH-34溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，按RH-34与pVEGF165的质量比为5:1与50μg/mL的pVEGF165水溶液进行混匀，室温下静置30min，得到单pVEGF165基因递送系统，记作single-pVEGF165。
实施例5：单和双基因递送系统的粒径和Zeta电位。
取实施例2中的样品，通过Zetasizer Nano ZS测试上述样品的粒径和Zeta电位数值。结果见图1，横坐标表示双基因递送系统中pZNF580和pVEGF165的质量比，左纵坐标为粒径，右纵坐标为Zeta电位，在每一组柱状图中，左侧柱状图对应该组的粒径数值，右侧柱状图对应该组的Zeta电位数值。实验结果表明：各系统的粒径和Zeta电位数值非常接近，分别为120±2nm和+20±2mV，利于细胞转染。
实施例6：基因递送系统的体外生物学性能评价
(1)蛋白印迹实验
取实施例2，实施例3和实施例4中制备的基因递送系统，将人脐静脉内皮细胞以3×105/孔接种到6孔板，在37℃环境孵化24h，换成无血清DMEM培养基。培养12h后，加入新鲜制备的基因递送系统，继续培养4h，换成新鲜完全培养基，继续培养24h。倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液洗三遍，加100μL细胞裂解液，在冰上裂解30min，收集到EP管中。4℃，13000rpm条件离心，取上清液，标准化浓度，水煮沸腾5min，检测蛋白的表达水平，然后用Image J软件分析实验结果，见图2。A为对照组；B为实施例3中的基因递送系统single-pZNF580；C为实施例4的基因递送系统single-pVEGF165；D为实施例2获得的基因递送系统dual-p1:2；E为实施例2获得的基因递送系统dual-p1:1；F为实施例2获得的基因递送系统dual-p2:1；在每一组柱状图中，左侧柱状图对应该组的ZNF580蛋白表达水平，右侧柱状图对应该组的VEGF165蛋白表达水平。实验结果表明，相比于单基因递送系统，双基因递送系统组能够同时显著提高ZNF580和VEGF165蛋白在内皮细胞中的表达。
(2)体外血管形成实验
根据基质胶的使用说明，在4℃进行解胶，用含有5％FBS的培养基将其稀释至10mg/mL的浓度，然后向96孔板中加入50μL稀释后的基质胶/孔，孵化1h。同时，用实施例2，实施例3和实施例4中制备的基因递送系统转染内皮细胞24h。取出转染的细胞，用胰酶消化，离心，重悬于无血清培养基，以4×104细胞/孔的密度将其接种于基质胶上。37℃、5％CO2环境下培养6h凝胶化。用显微镜下观察血管形成情况，拍照保存，并用Image J统计各组的血管数量，见图3。A为对照组；B为实施例3中的基因递送系统single-pZNF580；C为实施例4的基因递送系统single-pVEGF165；D为实施例2获得的基因递送系统dual-p1:2；E为实施例2获得的基因递送系统dual-p1:1；F为实施例2获得的基因递送系统dual-p2:1。实验结果表明，相比于单基因递送系统，双基因递送系统组能够同时显著提高内皮细胞的体外血管化能力，即本发明的双基因递送系统在制备提高内皮细胞的体外血管化能力药物中的应用。
根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现基因递送系统的制备，且表现出与本发明基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 519
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> unknown
<400> 1
atgctgctgc tgccgccgcg gccaccccac cctcggtcct cctctccgga ggccatggac 60
ccaccgcccc ccaaggctcc ccctttcccc aaggcggaag gcccctcctc cactccttcc 120
tcggcggcgg ggccccgacc cccgcggctg ggccgccacc tcctcatcga cgccaatggg 180
gtcccctaca catacacggt gcagctggag gaggagcccc ggggcccgcc ccagcgcgag 240
gcgcccccag gagagcccgg ccctcgcaag ggctacagct gcccggagtg cgcccgtgtc 300
tttgccagcc ctctgcggct gcagagccac cgcgtgtcgc actcggacct caagcccttc 360
acgtgcggcg cctgcggcaa ggccttcaag cgctccagcc acctgtcgcg gcatcgcgcc 420
acgcaccgcg cccgcgccgg gccgccgcac acctgcccgc tctgcccacg ccgcttccag 480
gacgccgcgg agctggcgca gcacgtgcgc ctccactaa 519
<210> 2
<211> 576
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> unknown
<400> 2
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120
gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180
atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240
atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480
tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540
gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga 576
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> Thermosynechococcus vulcanus
<400> 3
Arg Glu Asp Val Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro
1 5 10 15
Lys Lys Lys Arg Lys Val His His His His His His His His His His
20 25 30
His His
Claims (10)
1.一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤1，制备预混基因溶液
将携带第一基因的第一质粒和携带第二基因的第二质粒进行混合，以得到预混基因溶液，第一质粒和第二质粒的质量比为(0.5—2)：1；第一基因如序列表No.1序列所示，第二基因如序列表No.2序列所示；
步骤2，制备双基因递送系统
将多肽RH-34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合，以得到三种基因递送系统，即具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统；多肽RH-34与步骤1预混基因溶液中第一质粒和第二质粒质量之和的质量比为(3—6)：1；多肽RH-34如序列表No.3序列所示。
2.根据权利要求1所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统，其特征在于，第一质粒为质粒pZNF580；第二质粒为质粒pVEGF165；第一质粒和第二质粒的质量比为(1—2)：1。
3.根据权利要求1所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统，其特征在于，选择将第一质粒和第二质粒分别均匀分散在水中，以形成水溶液，再将两种水溶液进行混合，在室温20—25摄氏度静置，得到预混基因溶液，静置时间为40—60min。
4.根据权利要求1所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统，其特征在于，在多肽RH-34的缓冲溶液中，将RH-34均匀分散在pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中；将多肽RH-34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合后，在室温20—25摄氏度下静置，得到双基因递送系统，静置时间为20—30min。
5.根据权利要求1所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统，其特征在于，多肽RH-34与步骤1预混基因溶液中两者质粒质量之和的质量比为(5—6)：1。
6.一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤1，制备预混基因溶液
将携带第一基因的第一质粒和携带第二基因的第二质粒进行混合，以得到预混基因溶液，第一质粒和第二质粒的质量比为(0.5—2)：1；第一基因如序列表No.1序列所示，第二基因如序列表No.2序列所示；
步骤2，制备双基因递送系统
将多肽RH-34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合，以得到三种基因递送系统，即具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统；多肽RH-34与步骤1预混基因溶液中第一质粒和第二质粒质量之和的质量比为(3—6)：1；多肽RH-34如序列表No.3序列所示。
7.根据权利要求6所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统的制备方法，其特征在于，选择将第一质粒和第二质粒分别均匀分散在水中，以形成水溶液，再将两种水溶液进行混合，在室温20—25摄氏度静置，得到预混基因溶液，静置时间为40—60min；第一质粒为质粒pZNF580；第二质粒为质粒pVEGF165；第一质粒和第二质粒的质量比为(1—2)：1。
8.根据权利要求6所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统的制备方法，其特征在于，在多肽RH-34的缓冲溶液中，将RH-34均匀分散在pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，多肽RH-34与步骤1预混基因溶液中两者质粒质量之和的质量比为(5—6)：1。
9.根据权利要求6所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统的制备方法，其特征在于，将多肽RH-34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合后，在室温20—25摄氏度下静置，得到双基因递送系统，静置时间为20—30min。
10.如权利要求1—5之一所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统在在制备提高内皮细胞的体外血管化能力药物中的应用。
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| CN103740728A (zh) * | 2013-12-30 | 2014-04-23 | 中国人民武装警察部队后勤学院 | 稀有密码子改造的人znf580基因及该基因原核表达的蛋白及多克隆抗体 |
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| CN107629118A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-01-26 | 天津大学 | 基于组氨酸的靶向性穿膜肽载体及用途 |
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2019
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