CN101935351A - 一种人血管内皮细胞生长因子类似物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种内皮细胞生长因子类似物的构建及制备方法。发明的内皮细胞生长因子类似物VEGF192是通过将VEGF165中110位置的Gly突变成Pro，且在其C末端融合有VEGF183(131-158)的氨基酸序列，使之即能与细胞外基质紧密结合，又可在纤溶酶的作用下进行释放。通过毕赤酵母表达的方法进行了制备，用亲和层析的方法进行了纯化，并证明了其具有细胞外基质结合活性且在体外能被纤溶酶切割释放。测定VEGF192在体内的半衰期达到8小时，而野生型VEGF165仅为45分钟左右，说明VEGF192在体内作用时间显著延长。体外实验数据显示VEGF192具有刺激HUVEC增殖的功能，体内实验证明VEGF192可刺激血管生成，可应用于血管再生及相关的生物工程领域。

Description

一种人血管内皮细胞生长因子类似物

发明领域

本发明属于生物工程与生物医药领域，涉及一种人血管内皮细胞生长因子类似物的基因以及该基因所编码的多肽。更具体的说，是突变VEGF165的C末端融合有VEGF183(131-158)的氨基酸序列的多肽及它的制备方法及可能用途。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)特异地作用于血管内皮细胞，是生血管作用特异的刺激剂。VEGF不仅能促进新血管的生成(Science 246：1309-1312；J Clin Invest 84：1470-1478.)，还能保护血管内皮细胞，防止细胞调亡(ExpCell Res 247：495-504；Circulation 91：2802-2809.)，因此，VEGF有希望成为治疗冠心病、创伤、糖尿病性下肢缺血的理想药物。然而，美国基因技术公司(Genetech)用重组的VEGF165治疗心肌缺血时发现，VEGF165的全身用药会舒张血管，引起病人血压快速下降。相反，用表达VEGF165的裸露DNA多位点注射在局部长期持续性的低水平表达却没有出现血压下降，能成功治疗下肢缺血和冠心病。可以预测，对于VEGF这种开发前景诱人的细胞因子而言，需要一种能将VEGF传输到缺血的组织，并将VEGF滞留在局部缓慢释放的方法。这样，既能在缺血组织局部促进血管内皮细胞的生长、防止内皮细胞调亡、诱导新血管的生成。

将VEGF滞留在局部缓慢释放的研究很多，总体上是通过化学偶联将VEGF连接到人工基质上，通过酶解的方法使得VEGF从基质上缓慢释放。例如，Zisch AH等人建立的方法较为典型(FASEB J.2003 Dec；17(15)：2260-2.)，他们将VEGF化学偶联到多分支聚乙二醇上，并进而偶联上细胞黏附肽(RGD三肽)和基质金属蛋白酶可切割的多肽，制作出生物可降解的人工基质。这种人工基质可以黏附细胞，肌体在缺氧状态下基质金属蛋白酶表达上调，从而切割人工基质释放出PEG化的VEGF，在局部发挥促进血管生成的作用。类似的研究还有将VEGF连接到纤维蛋白上，在肌体内通过纤溶酶或基质金属蛋白酶水解纤维蛋白，释放出VEGF(Circulation Research.2004；94：1124.)。

肌体内通常仅发生局部的缺血，如心肌缺血、下肢缺血等，上述的方法不仅能将VEGF限制在局部，而且能根据组织缺氧状态释放VEGF，因此称为Cell-demanded liberation of VEGF(Circulation Research.2004；94：1124.)或称为Cell-demanded release of VEGF(FASEBJ.2003 Dec；17(15)：2260-2.)。然而，这些含VEGF的人工基质制作过程较为复杂，很难重复制作出均一的产品，由于涉及化学偶联，产品的质量很难保证，偶联的时间长一些，VEGF失活多一些，偶联时间短，VEGF失活少，但偶联的VEGF也少。需研制一种注射到缺血组织中能自主结合到细胞表面基质或人工基质上，并能根据肌体需要进行可控释放的新型VEGF，将不需要制作人工基质，也不需要化学偶联，直接多位点注射到缺血部位(如糖尿病下肢缺血病人的下肢多位点注射)，既能在缺血组织局部促进血管内皮细胞的生长、诱导新血管的生成。

刘景晶等发现长型的VEGF183与VEGF189相比，仅在外显子6a的C端少了6个氨基酸，我们称之为6a′(Invest Ophthalmol Vis Sci.1999 Mar；40(3)752-9.)。研究证实VEGF183在肌体内仍可以借助外显子6a′中富含碱性氨基酸残基的肽段将自身锚定在细胞外基质的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)上，在肌体需要的时候以一种类似于旁分泌的方式(Ectodomain shedding)从基质中释放出来并在局部发挥作用。从基质中的释放主要通过酶的水解，在VEGF183的活性中心和细胞表面基质结合肽段之间即VEGF183(132-158)中有纤溶酶、基质金属蛋白酶以及uPA的切割位点(Angiogenesis.2002Jan；4(2)：103-12.)。所以我们将该肽段融合到突变的VEGF165C末端，发现融合有VEGF183(132-158)的VEGF类似物可原位在体内结合细胞外基质，又可以在体内纤溶酶、基质金属蛋白酶以及uPA的作用下进行释放，进行作用。

在VEGF165上同样也有纤溶酶的切割位点，经纤溶酶切割后，N端片段的生物活性仅为切割前VEGF165的100分之1。通过点突变消除VEGF165的酶切割位点，其体内促进生血管活性明显增强(FEBS Lett.2002Nov 6；531(2)：309-13.)，表明虽然在体内纤溶酶的切割是细胞结合型VEGF(如VEGF183)的释放机制，但对于可溶性的VEGF165而言，酶的切割却会使得活性大部分丧失。

所以通过点突变消除VEGF165的纤溶酶的切割位点，生成具有更强生血管活性的VEGF165突变体；再将VEGF183的外显子6a肽段连同紧靠该肽段的N端含纤溶酶切割位点和基质金属蛋白酶的切割位点的肽段移植到VEGF165突变体的C端，得到一种重构的VEGF类似物。

本发明中涉及的内皮细胞生长因子类似物可以自动与细胞外基质结合，与野生型VEGF165相比有较长的半衰期，且在纤溶酶作用下可释放，刺激血管新生。

发明内容

本发明的目的就是提供一种重构的血管内皮细胞生长因子类似物。

本发明的另一目的是提供该内皮细胞生长因子类似物的制备方法。

本发明的再一个目的是提供了该血管内皮细胞生长因子类似物的基本功能和可能用途。

本发明的第一个方面是提供了一种可与细胞外基质粘附的内皮细胞生长因子类似物，具有SEQ ID：2所示的氨基酸序列。

此类新型VEGF是由VEGF165的C末端加上VEGF183的细胞表面基质结合肽段6a′和邻近外显子5中含有纤溶酶(plasmin)、基质金属蛋白酶(MMP)以及尿激酶(uPA)的切割位点的序列即VEGF183(132-158)序列部分，其中VEGF165在110位置由Gly突变成Pro。按照VEGF的命名法则(按照所含氨基酸数目命名)，将之命名为VEGF192。

本发明的第二方面，提供了该类新型内皮细胞因子的制备方法，步骤包括：

1.构建了重构新型VEGF192的基因；

2.获得了表达重构新型VEGF192的毕赤酵母克隆；

3.分离出重构VEGF192蛋白。

本发明的第三个方面是提供了该新型血管内皮细胞生长因子的可能用途。

基因转染实验证明VEGF192可与细胞外基质结合并可显著刺激血管生成，大鼠体内ELISA检测证明相较野生型的VEGF165，VEGF192有较长的半衰期。

附图说明

图1质粒pPIC9K-VEGF192结构图。

图2重组质粒pPIC9K-VEGF192双向测序结果。

图3SDS-PAGE非变性电泳显示VEGF192的酵母优化表达图谱。1.表达第1天上清；2.表达第2天上清；3表达第3天上清；4.表达第4天上清；M.标准分子量蛋白(kDa)。

图4变性与非变性状态的SDS-PAGE电泳显示纯化的VEGF192。

1.纯化VEGF192(非变性)；2.纯化VEGF192(变性)；3.标准分子量蛋白(kDa)。

图5SDS-PAGE显示肝素作用下VEGF165与VEGF192的细胞外基质结合状态。

1.EMT6细胞未加肝素的条件培养基；2.EMT6细胞加肝素的条件培养基；3.表达VEGF165的EMT6细胞未加肝素的条件培养基；4.表达VEGF165的EMT6细胞加肝素的条件培养基；5.表达VEGF192的EMT6细胞未加肝素的条件培养基；6.表达VEGF192的EMT6细胞加肝素的条件培养基。

图6VEGF192基因转染诱导肿瘤周边血管生成。

左图为对照组转染有空质粒的EMT6细胞诱导的血管生成，右图为转染有VEGF192的EMT6诱导的血管生成。

图7SDS-PAGE电泳显示纤溶酶切结果。1.标准分子量蛋白(kDa)；2.纤溶酶切VEGF192；3.VEGF192对照。

图8MTT显示经纤溶酶切割后的VEGF192蛋白对于HUVEC生长的刺激结果。

具体实施方式

(1)菌株和质粒：

宿主菌Escherichia coli(DH5α)是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存；pCDNA3.1plus、毕赤酵母GS115和质粒pPIC9K购自与美国invitrogen公司。

(2)酶和试剂：

分子克隆工具酶和试剂为BBI公司产品；PCR回收试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；质粒抽提试剂盒为美国OMEGA公司产品。

(3)培养基：

LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh EF，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。

YPD、BMGY与BMMY均采用Pichia Expression Kit；A Manual of Methods for Expression ofRecombinant Proteins in Pichia pastoris；Catalog no.K1710-01中的配方。

其中YNB、生物素均为上海生物工程技术服务有限公司产品。

(4)肝素琼脂糖树脂为上海诺蕾公司(Novelab)产品。

方法

质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些在基因工程研究领域都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh EF，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。

重组蛋白表达量的测定：采用武汉博士德生物工程有限公司的人VEGF ELISA检测试剂盒。

实施例1重组VEGF192基因的获得

1.VEGF192基因的获得

根据VEGF165 cDNA与VEGF183(132-158)序列由Oligo6软件设计引物扩增，上游引物，

VEGF165ori 5′-GCCAAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG-3′(SEQ ID NO：4)

Mut110pro  5′-ATTGTCTTGTCTTGGTCTATCTTTCTTTGGTC-3′(SEQ ID NO：5)

VEGF165Mid 5′-CCAAGACAAGACAATCCCTGTGGGCCTTGCTCA-3′(SEQ ID NO：6)

VEGFTer1 5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCA-3′(SEQ ID NO：7)

165JDP1 5′-GTTTTCTTGGCTTGCGCTATCTTTCTTCCGCCTCGGCTT-3′(SEQ ID NO：8)

165JDP2 5′-ACCCTTACCCTTACCACGAACTGATTTGTTTTCTTGGCT-3′(SEQ ID NO：9)

165JDP3 5-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACGGGATTTCTTGCGCTTGCGTTTTTGACCCTTACCCTT-3(SEQ IDNO：10)

VEGF192的构建；首先由引物VEGF165ori与VEGF165Mid组合，以基因VEGF165为模板进行扩增，反应循环参数：94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。回收并纯化PCR产物；然后由引物VEGF165ter与Mut110pro组合，以VEGF165为模板，反应循环参数：94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。回收并纯化PCR产物；以上述两次扩增回收片段为模板，以引物VEGF165ori与VEGFTer1为组合，进行扩增，反应循环参数：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。回收并纯化PCR产物；然后以上次纯化的PCR产物为模板，以引物VEGF165ori与165JDP1组合，进行PCR扩增，反应循环参数：94℃5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。回收并纯化PCR产物；然后以上次纯化的PCR产物为模板，以引物VEGF165ori与165JDP2组合，进行PCR扩增，反应循环参数：94℃5min，94℃1min，57℃1min，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。回收并纯化PCR产物；以上述两次扩增回收片段为模板，以引物VEGF165ori与165JDP3为组合，进行扩增，反应循环参数：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。回收并纯化PCR产物；用EcoRI和NotI分别对PCR产物进行双酶切、纯化，同时对Ppic9k用EcoRI与NotI进行双酶切、纯化；T4DNA连接酶4℃过夜连接。构建成功的质粒结构图见附图1。连接产物转化DH5α感受态细菌，并于含50mg/L氨苄霉素LB固体培养基37℃培养过夜；挑取阳性克隆，扩大培养。用PCR扩增重组质粒进行鉴定后，送南京金思特公司测序，测序图见附图2。

实施例2VEGF192毕赤酵母高表达克隆的获得

1.大规模抽提质粒

经测序验证序列正确的克隆的DH5α菌株转接于200ml氨苄LB培养液中，37℃培养过夜，离心收集菌体，采用OMEGA-midi质粒提取试剂盒进行质粒提取。

2.重组质粒的线性化及回收

重组质粒用Sal I酶切，体系如下：

去离子水            76μl

质粒                100μl

Sal I               4μl

10×buffer          20μl

37℃水浴酶切3小时，65℃灭活20分钟。酶切产物加入1/10倍体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀，12000rpm离心10min，沉淀溶于20μl无菌去离子水。取1μl检测，其余置-20℃保存备用。

3.GS115酵母感受态的制备

从YPD平板上挑取一独立GS115菌落，接种于3mlYPD培养液中，30℃振荡培养过夜，次日转接于100mlYPD培养液中，培养至OD值为1.3，菌液分装于两个50ml的离心管中，1500g离心5min，弃上清，加入100ml无菌预冷去离子水，枪吹打重悬。重复离心一次，再加入50ml无菌去离子水，重悬菌体，1500g离心5min，再加入20ml 1M山梨醇重悬酵母细胞，重复离心一次，弃上清，最后将酵母细胞重悬于500μl山梨醇中，置于冰上待用。

4.线型质粒电转酵母

把BIO-RAD电转仪调好各项参数(电压1500v，电阻200Ω，电容25uF)。将0.2cm的电转杯置80℃烘箱烘干，并放冰上预冷，加15μl线性化质粒于新制100μl感受态酵母细胞中混匀，置冰上预冷5min，将混匀的质粒和感受态细胞加到电转杯的小槽中，点击，脉冲为4.35ms，迅速加入1ml预冷的1M山梨醇混匀，吸取200μl涂布于MD平板上，30℃培养2天，挑选长出的His⁺阳性克隆。

5.G418高拷贝抗性克隆的筛选

将MD平板上长出的菌落用YPD培养液冲洗下来，测定酵母菌悬液的OD值，按照1OD约等于5×10⁷cell/ml的量，将其稀释至每200μl中含有细胞数量级为10⁵。然后涂布于不同G418浓度梯度的G418-YPD平板上(设定浓度为：0.5、2、4mg/ml)。30℃培养2天，挑选最高浓度板上长出的阳性克隆。

实施例3高拷贝Mut⁺基因型酵母的表达与VEGF192的分离纯化

1.VEGF192的诱导表达

接种筛选出的高拷贝Mut⁺基因型酵母菌株于YPD培养液中，30℃振荡培养过夜，次日吸取100μl过夜培养物接种于25ml BMGY培养液中，28-30℃继续振荡培养，至OD＝3.6时，3500g离心收集菌体，重悬于200ml BMMY培养液中，加入甲醇2ml至浓度为1％，28-30℃振荡培养，诱导表达VEGF，连续4天在固定时间补加甲醇2ml，发酵4天后，8000rpm离心10min，每天收集上清1mL，TCA沉淀后用SDS-PAGE检测，见附图3。

2.VEGF192的分离纯化

酵母发酵上清在0.1MNacl 20mmol/LTris-HCl(PH8.0)中4℃透析平衡过夜，经0.45μm滤器过滤，上样于Heparin-Sepharose CL6B亲和柱，用含0.5M NaCl的20mmol/L Tris-HCl(PH8.0)溶液进行洗脱，流速1ml/min，OD₂₈₀nm检测出峰情况，收集最后一个出峰组分。变性与非变性SDS-PAGE检测，见附图4。

实施例4VEGF192半衰期测定

通过ELISA方法研究了VEGF突变体的半衰期，结果显示VEGF突变体大鼠体内的代谢速率远远慢于野生型的VEGF165。野生型VEGF165半衰期在45分钟以内，20μg在大鼠体内1.5小时已经检测不到，而VEGF突变体半衰期在8小时；20μg VEGF192在大鼠体内8小时血液浓度仍达322pg/ml。

实施例5细胞外基质的粘附实验

按照Invitrogen说明书将重构的VEGF192基因与野生型的VEGF165瞬时转染小鼠乳腺癌细胞EMT6转染24孔板4个孔，培养1天后，弃去培养液，然后4个孔中每两个孔分别添加含肝素50μg/mL1640培养基(不含血清)与不含肝素的1640培养基500μL，另外2个对照EMT6孔(未转染)同上操作，超滤管浓缩50倍，进行western blot，见附图5。

实施例6VEGF192体内血管生成实验

将VEGF192稳定转染小鼠乳腺癌细胞EMT6，并筛选出的稳定转染VEGF192的细胞单克隆，25000个细胞注射BAL\B小鼠皮内，5天后剥皮检查它对瘤周边血管生成的影响，见附图6。

实施例7VEGF192的纤溶酶切

依据Roche纤溶酶说明书，将1.6mL solution I，0.2mL solution II，0.4mL solutionIII，0.2mLsolutionIV，混匀，37℃酶切4h，其中2μg VEGF溶于0.4mL solutionIII，0.01U纤溶酶溶于0.2mLsolutionIV，超滤管浓缩至100μL，SDS-PAGE电泳检测，见附图7所示。

实施例8VEGF192活性鉴定

5000个左右HUVEC细胞接种于铺有明胶的96孔板中，在含20％胎牛血清的M199培养基中培养6小时，然后100μl换成5％胎牛血清培养过夜，2μg VEGF165与突变体VEGF经纤溶酶24小时酶切后，置换于20毫升的含5％FBS的M199培养基中，MTT法检测对HUVEC的增殖刺激。加10μl MTT培养三小时后，吸弃培养基，加100μl DMSO混匀，490nm下测其吸光度(OD)，结果见附图8。

SEQUENCE LISTING

<110>中国药科大学

<120>一种内皮细胞生长因子类似物

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>27

<212>PRT

<213>人工的

<400>1

Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Asn Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly

1               5                   10                  15

Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg

            20                  25

<210>2

<211>192

<212>PRT

<213>融合蛋白

<400>2

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

1               5                   10                  15

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu

            20                  25                  30

Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys

        35                  40                  45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

    50                  55                  60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

65                  70                  75                  80

Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

                85                  90                  95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

            100                 105                 110

Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe

        115                 120                 125

Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser

    130                 135                 140

Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys

145                 150                 155                 160

Asp Lys Pro Arg Arg Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Asn Lys Ser

                165                 170                 175

Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg

            180                 185                 190

<210>3

<211>576

<212>DNA

<213>融合基因

<400>3

gcacccatgg cagaaggagg agggcagaat catcacgaag tggtgaagtt catggatgtc    60

tatcagcgca gctactgcca tccaatcgag accctggtgg acatcttcca ggagtaccct    120

gatgagatcg agtacatctt caagccatcc tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc    180

tgcaatgacg agggcctgga gtgtgtgccc actgaggagt ccaacatcac catgcagatt    240

atgcggatca aacctcacca aggccagcac ataggagaga tgagcttcct acagcacaac    300

aaatgtgaat gcagaccaaa gaaagataga ccaagacaag acaatccctg tgggccttgc    360

tcagagcgga gaaagcattt gtttgtacaa gatccgcaga cgtgtaaatg ttcctgcaaa    420

aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag cttgagttaa acgaacgtac ttgcagatgt    480

gacaagccga ggcggaagaa agatagcgca agccaagaaa acaaatcagt tcgtggtaag    540

ggtaagggtc aaaaacgcaa gcgcaagaaa tcccgt                              576

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<223>引物

<400>4

GCCAAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<223>引物

<400>5

ATTGTCTTGTCTTGGTCTATCTTTCTTTGGTC

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<223>引物

<400>6

CCAAGACAAGACAATCCCTGTGGGCCTTGCTCA

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<223>引物

<400>7

TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCA

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<223>引物

<400>8

GTTTTCTTGGCTTGCGCTATCTTTCTTCCGCCTCGGCTT

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<223>引物

<400>9

ACCCTTACCCTTACCACGAACTGATTTGTTTTCTTGGCT

<210>10

<211>58

<212>DNA

<213>人工的

<223>引物

<400>10

ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACGGGATTTCTTGCGCTTGCGTTTTTGACCCTTACCCTT

Claims (10)

1.一种人内皮细胞生长因子类似物，具特征在于其由突变VEGF165的完整序列在其碳末端融合有肽段VEGF183(131-158)。

2.权利要求1中肽段VEGF183(131-158)的氨基酸序列，其特征在于包含SEQ NO：1所示的氨基酸序列。

3.权利要求1中含有的突变VEGF165是指VEGF165蛋白中110的Gly突变成Pro。

4.根据权利要求1所述的人内皮细胞生长因子类似物，其特征在于，它包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

5.一种设计合成的多核苷酸，其特征在于：该核苷酸具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，该核苷酸序列编码权利要求4所示氨基酸序列的内皮细胞生长因子类似物。

6.根据权利要求4或5所示的人内皮细胞生长因子类似物的制备方法，其步骤包括：

(1)构建一种可复制的表达载体，该载体包含一段编码具有SEQ ID NO：2的人内皮细胞生长因子类似物的DNA序列。

(2)人内皮细胞生长因子类似物的表达，其中宿主选用优选的宿主菌，检测方法用SDS-PAGE；

(3)分离得到人内皮细胞生长因子类似物。

7.根据权利要求6所述的人内皮细胞生长因子类似物的制备方法，其特征在于用优选的宿主菌为酵母菌。

8.根据权利要求6所述的人内皮细胞生长因子的制备方法，其特征在于步骤(3)中采用层析方法为琼脂糖肝素柱亲和层析法，经SDS-PAGE检测达到电泳纯。

9.根据权利要求4所述的人内皮细胞生长因子类似物，具有较长的半衰期，与细胞外基质较强的亲和力，在体内有刺激血管生成的功能，经纤溶酶切割后体外可刺激人血管内皮细胞生长。

10.权利要求4中重组蛋白在预防或治疗缺血性疾病的药物中的用途。

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