CN102121023A - 突变型人纤溶酶原kringle5及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种突变型人纤溶酶原kringle5基因mK5以及mK5基因的一种扩增引物，同时公开了在mK5基因前附加谷胱甘肽-S-转移酶修饰的突变型人纤溶酶原kringle5基因，本发明还公开了这两种基因编码的蛋白mK5重组蛋白、GST-mK5融合蛋白以及两种蛋白的制备方法，本发明的mK5基因及GST-mK5基因可以应用于制备治疗血管增生性疾病的药物。本发明显著减少了基因工程方法获得重组K5蛋白分子中外源氨基酸的数目，得到的mK5提高了K5的生物活性，并且GST-mK5融合蛋白在保持mK5活性的同时，提高了蛋白的稳定性以及水溶性，简化了表达产物的纯化步骤，也提高了产物的纯度。

Description

突变型人纤溶酶原kringle5及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种突变型人纤溶酶原kringle5及其制备方法及应用。

背景技术

血管增生(angiogenesis），即从已存在的毛细血管网上，生成大量新生血管的过程。血管增生参与多种疾病的发生与发展(Folkman J. Nat Rev Drug Discov. 6:273-286,2007)。血管增生是包括肿瘤(Folkman J.N Eng l J Med ,285:1182-1186,1971)、糖尿病眼病（Campochiaro, et al. Expert Opin Biol Ther. 4:1395-1402, 2004）、糖尿病肾病（Yamamoto Y, et al. Diabetes. 53: 1831-1840. 2004）、风湿性关节炎（Taylor P. C . et al. Curr Opin Rheumatol. 17:293-298,2005）在内的70余种疾病的主要病理特征。全球范围内有5亿人饱受因血管增生或血管形成障碍导致的疾病困扰。在肿瘤治疗领域，1971年Folkman首次提出肿瘤血管形成理论,指出肿瘤的生长和转移均依赖于新生血管生成(Folkman J. N Eng l J Med , 285: 1182-1186, 1971)。阻断肿瘤新生血管形成的饥饿疗法为减少肿瘤大小、克服肿瘤转移和降低肿瘤复发率提供了新的治疗策略，有望成为今后肿瘤治疗的突破口。

血管新生受血管增生平衡的调节，血管增生平衡由血管生成刺激因子和抑制因子构成，目前临床应用血管生成刺激因子的拮抗剂成为治疗肿瘤等血管增生类疾病的主要手段。但因内源性血管生成刺激因子作用广泛，阻断血管生成刺激因子的功能将导致较为严重的并发症。以抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体-贝伐单抗（Bevacizumab, 商品名Avastin）为例，Avastin已被美国FDA批准与化疗药合用治疗转移性结肠癌、非小细胞性肺癌和乳腺癌（Cabebe E, Wakelee H. Curr Treat Options Oncol. 8(1):15-27,2007）。但临床应用与研究证明Avastin不仅阻断了VEGF促进血管新生的功能还影响了VEGF其他的重要生理功能，导致出现肺栓塞、心肌梗死和脑血管意外等严重毒副反应。另外，新生血管形成受多种血管生成刺激因子的调控，当一种刺激因子被长时间抑制后，肿瘤组织会代偿性产生其他刺激因子维持病理性的血管增生，所以仅仅针对一种刺激因子的长期治疗效果并不理想（Relf M, et al. Cancer Res. 57:963–969 ,1997.）。

内源性血管生成抑制因子是血管增生平衡的主要组成部分，在体内以多肽或蛋白质分子的形式存在。内源性血管生成抑制因子因其具有特异性抑制活化血管内皮细胞、降低血管增生刺激因子的表达和功能等作用，以及副作用小、不易产生抗药性等临床应用优势成为目前抗血管新生领域研发焦点。但因体外获取内源性血管生成抑制因子的方法有限，所获得的抑制因子常含有较长的外源序列、不具有天然构象，此外获得的重组抑制因子稳定性降低、生产过程复杂、成本过高、产率低等原因也限制了内源性血管生成抑制因子的应用。以内皮抑素（Endostatin）为例，Endostatin是胶原蛋白XVIII的裂解片段，具有较强的抗血管增生作用，美国等国家经抑制肿瘤的Ⅰ期、Ⅱ期临床研究后，放弃了对Endostatin的Ⅲ期临床研究，终止了Endostatin的开发而未能上市。重要原因之一是大肠杆菌重组表达的Endostatin极易形成不可溶、无活性的包涵体，很难复性。美国一家公司改用毕氏酵母代替大肠杆菌作为表达体系生产可溶Endostatin，但生产成本过高。我国山东麦得津公司在1998年开始进行血管内皮抑素的研究，采用大肠杆菌表达体系生产出来一种新型的重组人血管内皮抑素（研发代号：“YH-16”，商品名：Endostar恩度）。在N端添加了9个氨基酸，改善了稳定性，半衰期延长、生物活性增加、提高了产品的纯度、可以大规模生产，于 2005年9月12日获得SFDA批准颁发了“国家一类新药证书”（国药准字：S20050088），成为全球范围内第一个被批准上市的血管新生抑制因子。尽管尚存在众多的争议，但恩度的活性得到了包括发现Endostatin和Angiostatin而闻名的美国哈佛大学教授Judah Folkman实验室的肯定(Whitworth A. Nat Biotechnol. 24(2):117-8,2006)。

人纤溶酶原（plasminogen）含有5个环状结构域（kringles），每个环由80个氨基酸残基组成，含3个二硫键，形成双环状构象(Castellino, FT&McCance, S.G CibaFound Symp., 212:46-60, 1997)。人纤溶酶原水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段:血管抑素(kringles 1-4), kringles 1-5, kringles 1-3和kringle 5（K5）。K5抑制内皮细胞增生的活性比血管抑素强(Cao ,et al ,1997; Cao, et al ,1996; O'Reilly, et al, 1994)，此外，K5还具有抑制内皮细胞迁移以及诱导内皮细胞凋亡的作用(Ji, W.R. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 247: 414-419,1998; Lu, H. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258:668-673, 1999)。在动物模型中，K5有效预防和阻断视网膜血管增生大鼠模型中新生血管的形成（Zhang D. et al. Diabetologia, 2001. 44(6): 757-765,2001；Gao G. et al. J Biol Chem, 277(11):9492-9497, 2002. Lu H. et al. Biochem Biophys Res Commun. 258:668-731,1999）；降低视网膜血管增生模型和糖尿病大鼠模型的血管渗漏Zhang D,et al. Diabetologia, 44(6): 757-765,2001；,2004）；抑制兔碱烧伤角膜新生血管形成（. 46(11): 4062-4071, 2005）等。在肿瘤模型中，K5抑制多种肿瘤生长，诸如，肺癌（,1994）、胰腺癌Shi, C.Q., et al. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 84(21): 1827-1832,2004）、脑胶质瘤（,2005）、结直肠癌Fan J.K., et al.Biochem Biophys Res Commun, 374(2): 198-203,2008）和肝癌（Yang X, et al. Cancer Biol Ther, 5(4): 399-405,2006）等。因此，K5有望成为治疗肿瘤等血管增生性疾病的候选药物。

已有研究证明K5的抑制血管增生活性同kringle结构域密切相关，而kringle结构域由分子中二硫键的位置和数量所决定。我们根据K5蛋白的结构特征和二硫键分布特点，用基因缺失的方法构建了K5的缺失突变体。其中，K5 mut1删除了K5 kringle结构域外环两端的氨基酸残基，但保留完整的由三个二硫键构成的kringle结构域；K5 mut2是在K5 mut1的基础上将K5第一个二硫键打开。体内外实验结果提示，与K5相比，K5mut1具有更强的抑制血管新生的活性，而打开了kringle环后的突变体—K5mut2丧失了抗血管新生活性。提示完整的kringle结构域是K5发挥生物学活性的结构基础，但对于为什么K5mut1的抗血管新生活性强于K5，我们推测可能原因是K5蛋白N端10个氨基酸残基中含有5个带负电荷的酸性氨基酸（Asp2，Glu4，Glu8，Glu9，Asp10），通过与Kringle环结构内带正电荷的氨基酸残基相互作用，从而遮挡和掩盖了K5蛋白中与内皮细胞特异性结合的功能域，因此影响了K5的活性，提示有必要提供一种K5结构改造的方法，获得具有更强抗血管增生活性的K5，为其临床应用提供基础。

在分析核苷酸编码序列的基础上，Cao Y等人进一步利用大肠杆菌表达系统表达了可溶性的鼠源性重组K5（recombinant mouse kringle 5，rmK5）分子，但因种属特异性，不能用于临床应用。现有技术也报导了使用酵母（巴斯德毕赤酵母）系统克隆和表达可溶形式的K5的方法。尽管能够获得可溶性的、有功能的K5，但使用巴斯德毕赤酵母表达系统不仅投资巨大，而且甲醇毒性，启动子调控困难，筛选标记太少，糖基化方式与天然蛋白不同等问题仍然无法解决。此外，还有一些应用其他真核细胞系获得K5的方法，如利用重组杆状病毒，在草地贪夜蛾卵巢细胞中表达人纤溶酶原K5，但因表达产量低、工艺复杂而没有得到广泛的应用。目前因为应用已知的方法不能在体外获得产率高、外源氨基酸少、活性强的K5，K5的临床前研究及临床试用受到了限制，因此有必要提供一种改良的，以更高的产率和更简单的纯化工艺生产人纤溶酶原K5的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供一种人纤溶酶原kringle 5的突变型基因mK5，和带有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标记的mK5基因，以下简称为GST-mK5。

本发明的另一目的是提供上述两种基因编码的蛋白mK5重组蛋白和GST-mK5融合蛋白。

本发明的又一目的是提供上述两种蛋白的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述两种蛋白的应用。

一种突变型人纤溶酶原kringle5基因，是以人纤溶酶原kringle5的cDNA为基础，将N端5个酸性氨基酸密码子替换为中性氨基酸密码子。

一种谷胱甘肽-S-转移酶修饰的突变型人纤溶酶原kringle5基因，是以人纤溶酶原kringle5的cDNA为基础，将N端5个酸性氨基酸密码子替换为中性氨基酸密码子，并且N端附加谷胱甘肽-S-转移酶基因。

以上所述两种基因，优选以人纤溶酶原kringle5的cDNA为基础，将N端5个酸性氨基酸密码子替换为丝氨酸密码子。

上述酸性氨基酸为Asp2，Glu4，Glu8，Glu9，Asp10。上述中性氨基酸为甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺,丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸中的一种或几种。从蛋白质结构理论出发，本发明中由于在已知K5基因序列的N端五个酸性氨基酸的位置引入了中性氨基酸的替代突变，去除了酸性氨基酸对K5活性区域中两个关键的带正电荷精氨酸残基Arg69和赖氨酸残基Lys70的电荷遮蔽作用，能够充分暴露活性基团，增强K5的生物活性。

一种扩增突变型人纤溶酶原kringle5基因的引物，其特征在于上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种mK5重组蛋白，是由突变型人纤溶酶原kringle5基因编码得到的蛋白。

一种GST-mK5融合蛋白，是由谷胱甘肽-S-转移酶修饰的突变型人纤溶酶原kringle5基因编码得到的蛋白。

上述mK5重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）以人纤溶酶原kringle5的cDNA为基础，将N端5个酸性氨基酸密码子替换为中性氨基酸密码子，得到mK5的核苷酸编码序列；

（2）将步骤（1）得到的mK5基因的核苷酸序列连接到表达载体，即可以编码GST融合蛋白的质粒，得到重组表达载体；

（3）将步骤（2）得到的重组表达载体转化到宿主细胞中，培养被转化的宿主细胞；

（4）从宿主细胞培养基和宿主细胞内回收表达产物，纯化，得到GST-mK5融合蛋白；

（5）将GST-mK5融合蛋白经过凝血酶切割，获得单纯mK5重组蛋白。

作为本领域的常规生产蛋白步骤，上述mK5重组蛋白也可以通过以下方法制备：

（1）以人纤溶酶原kringle5的cDNA为基础，将N端5个酸性氨基酸密码子替换为中性氨基酸密码子，得到mK5的核苷酸编码序列；

（2）将步骤（1）得到的mK5基因的核苷酸序列连接到表达载体，得到重组表达载体；

（3）将重组表达载体转化到相应的宿主细胞中，培养被转化的宿主细胞；

（4）从宿主细胞培养基和宿主细胞内回收表达产物，纯化，得到单纯mK5重组蛋白。

其中步骤（3）中所述的宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等常规表达系统，步骤（2）中所述的表达载体是指与这些表达系统相应的表达载体。

上述GST-mK5融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）以人纤溶酶原kringle5的cDNA为基础，将N端5个酸性氨基酸密码子替换为中性氨基酸密码子，得到mK5的核苷酸编码序列；

（2）将步骤（1）得到的mK5基因的核苷酸序列连接到表达载体，即可以编码GST融合蛋白的质粒，得到重组表达载体；

（3）将步骤（2）得到的重组表达载体转化到宿主细胞中，培养被转化的宿主细胞；

（4）从宿主细胞培养基和宿主细胞内回收表达产物，纯化，得到GST-mK5融合蛋白。

上述GST-mK5融合蛋白的制备方法中步骤（3）中所述的宿主细胞为大肠杆菌，所述GST融合蛋白是指谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白。

突变型人纤溶酶原kringle5基因或谷胱甘肽-S-转移酶修饰的突变型人纤溶酶原kringle5基因在制备治疗血管增生性疾病药物中的应用。

mK5重组蛋白或GST-mK5融合蛋白在制备治疗血管增生性疾病药物中的应用。

上述两种蛋白在制备治疗血管增生性疾病药物中的应用。其中血管增生性疾病包括但不限于心血管病、肿瘤、糖尿病、眼病以及糖尿病肾病、风湿性关节炎。

上述步骤（1）中的核苷酸序列可以通过多种方法获得，例如，可以使用本领域已知自动合成系统合成上述完整核苷酸序列，或者分段合成不同的寡核苷酸，然后将其连接得到所需序列；还可使用根据本发明目的以及K5的核苷酸序列设计的寡核苷酸引物，从基因库中获得目的核苷酸序列。在第二种方法中，为方便起见，可以基于编码K5的氨基酸序列合成适当的寡核苷酸引物，包括正向引物和反向引物，将5个突变的氨基酸编码序列包含于正向引物中，并在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸的存在下，以聚合酶链反应(PCR)技术合成含有突变的核苷酸序列。根据本发明，所设计的引物中除加入编码突变部分氨基酸的核苷酸序列外，还可以根据所应用的不同表达载体加入合适的限制性内切酶的酶切位点。

上述编码K5的核苷酸片段制备完成后，在克隆载体中扩增并进一步鉴定，将其连接到适当的表达载体如pGEX-4T-1上，并转化入合适的大肠杆菌如BL21（DE3）中，培养细胞并诱导表达所需的GST-mK5融合蛋白。

由于遗传密码的简并性，可以在不改变其编码的氨基酸序列的前提下，对本发明的mK5的核苷酸编码序列进行许多不同的改动或改变。

上述步骤（5）中，可以使用GST亲和层析柱完成蛋白质的分离纯化。洗脱物在低温下制成冻干粉可以长期保存。使用凝血酶切割去除GST-mK5的GST蛋白部分，使用GST亲和层析柱或超滤的方式分离裂解片段，得到mK5纯化蛋白。

用上述方法获得纯化的GST-mK5和mK5蛋白后，使用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分别对纯化的GST-mK5和mK5蛋白进行SDS-PAGE分析以及western blot鉴定。结果显示GST-mK5具有37KDa的表观分子量，凝血酶切割后的mK5表观分子量约为10KDa；使用GST单克隆抗体或者抗K5血清进行western blot分析显示出明显的免疫杂交带，而且分子量同SDS-PAGE分析一致，说明所获得的蛋白是正确的。

可以使用编码K5的核苷酸序列，在适当的原核或真核表达系统中生产由之编码的N末端有五个酸性氨基酸突变的mK5，或者将这样的核苷酸序列连接到质粒或病毒载体上，或包裹在脂质微粒中，以其作为免疫原，并用适当的方法导入人或哺乳动物体内（如注入肌肉内），在体内表达循环的血管生成抑制因子mK5并发挥其抗血管新生作用（即所谓基因治疗），或者也可以使用逆转录酶或RT-PCR技术合成适当的反义核酸，用于肿瘤等血管新生相关疾病的治疗。这里所说的血管新生相关疾病包括但不只限于心血管病、肿瘤、糖尿病、眼病以及糖尿病肾病、风湿性关节炎。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明通过改造人纤溶酶原K5的核苷酸编码序列，显著减少了基因工程方法获得重组K5蛋白分子中外源氨基酸的数目，即得到了较为纯正的mK5蛋白。

（2）本发明中由于在已知K5基因序列的N端五个酸性氨基酸的位置引入了中性氨基酸的替代突变，去除了酸性氨基酸对K5活性区域中两个关键的带正电荷精氨酸残基Arg69和赖氨酸残基Lys70的电荷遮蔽作用，充分暴露活性位点，提高了K5的生物活性。

为检测所得蛋白是否具有K5的生物学活性，或者具有较K5更强的抗血管增生作用，我们在体外实验中分别检测了GST-mK5和mK5对血管内皮细胞、正常肝细胞和肝癌细胞增殖与凋亡的影响、在体内实验中检测了GST-mK5对裸鼠肝癌异位移植瘤生长和大鼠角膜新生血管形成的作用。我们的初步实验结果表明，在体外实验中，本发明所制备的mK5具有较K5更强的抑制血管内皮细胞增殖与诱导血管内皮细胞凋亡的功能，而且同GST-mK5的功能相当；GST-mK5和mK5同K5一致对正常肝细胞和肝癌细胞没有生长抑制作用以及诱导凋亡作用。在体内实验中，相同剂量下GST-mK5比K5具有更强地抑制裸鼠肝癌异位移植瘤生长和抑制大鼠角膜新生血管形成的功能，此外，GST-mK5比K5更显著改善损伤角膜的炎症反应，说明所获得的GST-mK5的活性强于K5。

（3）本发明发现保留了GST-tag的GST-mK5融合蛋白具有同mK5相当的生物学活性，而且GST-tag不具有免疫原性。在后续的生物学活性实验中，我们选用GST-mK5作为检测蛋白，这样即保持了mK5的活性，又可以提高蛋白的稳定性以及水溶性，并简化了表达产物的纯化步骤，同时提高了产物的纯度。

（4）按照本发明的制备方法保留了GST融合蛋白的形式，在N端加入GST序列，使得所获得的产物便于应用亲和层析的方法进行纯化，简化了重组蛋白质的纯化步骤，同时能够获得高产率和高纯度的GST-mK5和mK5，这种方法具有操作简单、生产成本低等优点。按本发明方法制备的mK5蛋白仅含有2个外源氨基酸（Gly，Ser），这2个外源氨基酸对蛋白质分子的空间构象没有影响，因此不会产生免疫原性。

附图说明

图1：编码GST-mK5的核苷酸序列及其对应的氨基酸序列，A为GST-mK5基因的核苷酸序列，其中XXX代表编码中性氨基酸的密码子；B为GST-mK5融合蛋白的氨基酸序列。其中X代表A中XXX对应的中性氨基酸。

图2：本发明实施例1中N末端有五个酸性氨基酸突变为丝氨酸密码子的mK5的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列，A为mK5的核苷酸序列，B为mK5的氨基酸序列。

图3：实施例1中mK5与K5的cDNA核苷酸序列和氨基酸序列比对结果，A为mK5与K5核苷酸序列比对结果，B为mK5与K5氨基酸序列比对结果。

图4：mK5重组质粒结构示意图。

图5：纯化后GST- mK5蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中1为诱导前，2为诱导后，3为洗脱液1，4为洗脱液2。

图6：应用抗K5兔血清进行Western Blot的蛋白鉴定图，其中1为诱导前，2为诱导后，3为洗脱液1，4为洗脱液2。

图7：应用抗GST抗体进行Western Blot的蛋白鉴定图，其中1为诱导前，2为诱导后，3为洗脱液1，4为洗脱液2。

图8：凝血酶酶切后mK5的SDS-PAGE电泳图，其中1为GST-mK5融合蛋白（凝血酶切割前），2为凝血酶切割8小时，3为凝血酶切割10小时，4为凝血酶切割12小时。

图9：凝血酶酶切后mK5的Western-blot鉴定图，应用抗K5兔血清进行Western Blot的蛋白鉴定图，其中1为GST-mK5融合蛋白（凝血酶切割前），2为凝血酶切割8小时，3为凝血酶切割10小时，4为凝血酶切割12小时。

图10：应用抗GST抗体进行Western Blot的蛋白鉴定图，其中1为GST-mK5融合蛋白（凝血酶切割前），2为凝血酶切割8小时，3为凝血酶切割10小时，4为凝血酶切割12小时。

图11：GST-mK5蛋白和mK5蛋白对血管内皮细胞增殖的作用。

图12：GST-mK5蛋白对血管内皮细胞凋亡的影响。

图13：GST-mK5蛋白对正常肝细胞和肝癌细胞Bel7402增殖的影响。

图14：GST-mK5蛋白对正常肝细胞2凋亡的影响。

图15：GST-mK5蛋白对肝癌细胞Bel7402凋亡的影响。

图16：GST-mK5蛋白对裸鼠肝癌实体瘤生长的影响，瘤组织直观图。

图17：GST-mK5蛋白对裸鼠肝癌实体瘤生长影响的肿瘤生长曲线图。

图18：GST-mK5蛋白对裸鼠肝癌实体瘤生长影响的抑瘤率统计图。

图19：GST-mK5蛋白对碱烧伤后大鼠角膜新生血管和角膜炎症:影响的眼部直观图。

图20：GST-mK5蛋白对碱烧伤后大鼠角膜新生血管和角膜炎症影响的受损角膜新生血管面积统计图。

图21：GST-mK5蛋白对碱烧伤后大鼠角膜新生血管和角膜炎症影响的角膜混浊度统计图。

图22：GST-mK5蛋白对碱烧伤后大鼠角膜新生血管和角膜炎症影响的角膜炎症反应统计图。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明本发明的方法及其优点，但这些实施例并不构成对本发明权利要求范围的限制。

实施例1：用于表达带有GST标记的mK5重组质粒的构建

mK5的核苷酸序列如图2所示。基于K5序列设计合成引物，引物中含有N末端五个中性氨基酸丝氨酸的核苷酸编码序列及限制性内切酶的酶切位点。上游引物：5’-ACT GAATTC CCA TCT GTA TCG ACT CCT TCC TCA TCA TCC TGT ATG TTT GG-3’，其中包括BamHI位点和中性氨基酸（Ser）替代突变的氨基酸编码序列； 下游引物：5’-TGCTGC CTCGAG TCA CGC ACA CTG AGG GAC ATC ACA GTA，其中包括终止密码子以及其后的XhoI位点。以人肝细胞cDNA为模板，采用PCR法得到mK5基因。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃、45秒，55℃、60秒，72℃、60秒，共30个循环，72℃延伸10分钟。

扩增完成后，使用Pearl公司PCR产物纯化试剂盒说明书进行纯化回收PCR产物。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，目的基因扩增产物长度为294bp。利用基因工程技术，将目的基因克隆至pGEX-4T-1的BamHI和XhoI位点。将重组质粒pGEX-4T-1/mK5转化到感受态大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，取复苏菌液100μl铺于含50μg/ml氨苄的选择性平板上，室温平放60min后，37℃倒置培养12～16h至单菌落形成。挑取待测单菌落于含有50μg/ml氨苄抗生素的LB培养液中， 37℃振摇过夜，提取重组质粒。重组质粒经PCR扩增、双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定转化结果。将重组质粒进行DNA测序明确转化是否成功。测序结果表明目的基因片段与pGEX-4T-1连接无误，阅读框架正确，pGEX-4T-1/mK5重组质粒构建成功。将插入片段（即mK5）的测序结果与K5的序列进行序列比对，最终证实插入序列为目的基因序列，见图3。图4为pGEX-4T-1/mK5重组质粒的示意图。

实施例2:  GST-mK5融合蛋白与单纯mK5蛋白的表达与纯化

取转化成功的BL21（DE3）菌株进行扩增，当菌液OD₆₀₀达约0.6～0.8时加入IPTG至终浓度为0.6 mmol/L，25 ℃、220rpm振摇细菌6h后离心收集细菌。细菌沉淀经蒸馏水漂洗后，离心，沉淀用磷酸盐缓冲液PBS重悬后超声破碎，4℃、10000rpm离心30min，取上清用0.45μm滤膜4℃过滤，进行亲和层析。根据产品的操作手册，将处理好的上清过滤液流过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱，300 ml washing buffer冲洗亲和柱后，加入20ml Elution buffer孵育Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱10min，分次收集洗脱液，每次收集10ml，分别标记为洗脱液1、洗脱液2（含有GST-mK5蛋白）。可根据洗脱情况，改变洗脱体积和收集次数。以含有甘油的透析液透析洗脱液24h后进行蛋白定量。采用BioRad DC试剂盒进行蛋白定量，方法如下：取3～5个已知浓度的BSA稀释液制作标准工作曲线（推荐浓度为0.5～2.0mg/ml）。取100μl GST-mK5蛋白及上述BSA稀释液加于试管中，每管加入500μl试剂A，混匀；加入4ml试剂B混匀；15min后于波长750nm处比色（1h内颜色是稳定的）。根据BSA浓度与吸光度绘制标准曲线，并计算GST-mK5融合蛋白的浓度。

取一定量纯化后的GST-mK5蛋白进行凝血酶切割，切割后以10KD的超滤管超滤并浓缩以去除GST标签，获得单纯mK5蛋白。

实施例3：GST-K5融合蛋白以及单纯mK5蛋白的鉴定

将GST-mK5蛋白和mK5蛋白进行SDS-PAGE电泳分析与Western–blot鉴定。

1. SDS-PAGE分析:按照文献中已描述的方法(Sambrook et al,Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbour,1989)，分别取上述洗脱后的GST-mK5蛋白和单纯mK5蛋白20μl，加入4μl 6×上样缓冲液（7.2ml甘油＋2.076g SDS+1ml β-巯基乙醇+7ml 1M Tris PH6.8+0.012%(w/v)溴酚兰适量，双蒸水定容为20ml）后，进行沸水浴10min。将处理好的样品与商品化的蛋白质分子量标准10μl依次加入12%聚丙烯胺凝胶凝胶中进行电泳。电泳结束后，将凝胶置于考马斯亮蓝G250溶液（配方：0.25g G250，90ml甲醇：水＝1：1，10ml冰乙酸）中染色4h，脱色后观察电泳结果。GST-mK5蛋白表观分子量大约为37KDa，凝血酶切割后的mK5蛋白质表观分子量大约10KDa，见图5、图8。

2.Western blot印迹分析: SDS-PAGE电泳条件与1相同。①电转印前先把与凝胶大小一致的PVDF膜用甲醇完全浸泡2～3min后，以ddH₂O彻底漂洗三次。将Whatman 3MM滤纸、海绵垫和PVDF膜一起浸于pH 8.3电转印缓冲液（配方：Tris-base3.03g/L，甘氨酸14.41g/L，甲醇200ml/l）中浸泡15min。②展开电转印夹，转膜时放置顺序从阴极（黑板）到阳极（白板）依次为海绵，滤纸，凝胶，PVDF膜，滤纸，海绵，排尽气泡，制成电转印“三明治”结构。③低温下（置于冷藏柜或冰上），100V电转移1h。④转印结束后，将PVDF膜置于含7％脱脂奶粉的TBST溶液中，室温封闭1h，同时以0.25％考马斯亮兰染色已转过膜的凝胶，观察转膜效果。弃去封闭液，将PVDF膜浸入含1:3000的抗GST-tag兔源性单克隆抗体或者1：6000的兔源性抗K5血清中，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入含1:2000的辣根过氧化物酶标记抗兔多克隆抗体，室温振荡60min。TBST洗膜3次，于暗室中加入ECL进行化学发光获得杂交条带。分析结果表明，按本发明方法产生的GST-mK5蛋白与mK5蛋白均被抗GST抗血清和兔源性抗K5血清识别，见图6、图7、图9、图10。

实施例4：GST-mK5融合蛋白以及mK5纯合蛋白的生物学活性检测

1. GST-mK5蛋白以及mK5对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖与凋亡的影响。

将HUVEC细胞接种于24孔板中，每组设3个复孔。待细胞生长至60-70%融合后，用含不同浓度（0、20、40、80、160、320、640、1280nmol/L）的GST-mK5蛋白、mK5蛋白以及K5蛋白分别处理细胞72h。处理结束后，向培养液中加入MTT溶液继续孵育细胞2-4h。弃去培养上清，每孔加入1mlDMSO溶解活细胞产生的紫色结晶，测量570nm处的吸光度，定量分析各组存活内皮细胞数。以GST蛋白处理作为阴性对照。实验至少重复3次，用t检验法分析各种蛋白对人脐静脉内皮细胞的抑制作用。结果显示，同对照组相比，K5、GST-mK5以及mK5以剂量依赖性方式显著抑制HUVEC细胞的增殖，差异具有统计学意义， GST-mK5同mK5抑制内皮细胞增殖的作用效果相似，且均强于K5，见图11。鉴于上述体外实验结果，在后续的生物学活性实验中，我们选用GST-mK5作为检测蛋白，这样即保持了mK5的活性，又可以提高蛋白的稳定性以及水溶性。

将对数生长期的HUVEC细胞接种于6孔培养板中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养约24h左右，待细胞达到60-70%融合后分别加入GST-mK5蛋白（320nmol/L）和K5蛋白（320nmol/L），PBS（阴性对照组）以及25μmol/L的秋水仙素（阳性对照组）处理细胞48h。处理结束后以0.05％胰酶消化细胞，离心500g、2min收集细胞。依照AnnexinV-FITC凋亡试剂盒说明书，将细胞进行AnnexinV和PI双染，流式细胞仪定量分析凋亡细胞比例。结果显示，GST-mK5处理组和K5处理组的内皮细胞凋亡率分别为17.9％±2.6％和12.76％±1.78%，显著地高于PBS对照组的4.8％±1.6%，见图12，结果表明GST-mK5蛋白具有较K5更强地诱导内皮细胞凋亡的作用。

2. GST-mK5对正常肝细胞以及肝癌细胞增殖和凋亡的影响

将正常肝细胞和肝癌细胞（Bel-7402）接种于24孔板中，每组设3个复孔。待细胞生长至60-70%融合后，用不同浓度的GST-mK5蛋白处理细胞72h。实验结束后，向培养液中加入MTT溶液，向培养液中加入MTT溶液继续孵育细胞2-4h。弃去培养上清，每孔加入1mlDMSO溶解活细胞产生的紫色结晶，测量570nm处的吸光度，定量分析各组存活细胞数。以GST蛋白处理作为阴性对照。实验至少重复3次，用t检验法分析各种蛋白对正常肝细胞和肝癌细胞增殖的抑制作用。结果显示，同对照组相比，GST-mK5对正常肝细胞和肝癌细胞的增殖没有影响，见图13。

将对数生长期的正常肝细胞和肝癌细胞接种于6孔培养板中，待细胞达到60-70%融合后分别加入不同浓度的GST-mK5蛋白，GST蛋白作为阴性对照，处理细胞48h。处理结束后向培养液中加入hoechst33258染色，分析细胞凋亡的情况。结果显示，与对照组细胞相比，各GST-mK5蛋白剂量组未见明显的凋亡现象，说明GST-mK5蛋白不能诱导的正常肝细胞和肝癌细胞Bel-7402的凋亡，见图14、图15。

3.GST-mK5融合蛋白抑制裸鼠肝癌模型中肿瘤的生长

取对数生长期的人肝癌细胞Bel-7402，以无菌的PBS溶液为溶剂，调节细胞悬液密度为3′10⁶/0.1ml。以0.1ml/只接种于4周龄BALB/C裸鼠颈背部皮下，待裸鼠肿瘤体积达到50mm³，随机分成PBS对照组、GST-mK5蛋白处理组及K5蛋白处理组，分别腹腔注射PBS溶液、GST-mK5蛋白溶液和K5蛋白溶液，隔日注射，共注射5次。接种Bel7402肝癌细胞后第24天，肉眼可见PBS对照组、GST-mK5蛋白处理组及K5蛋白处理组裸鼠颈背部皮下肿瘤生长体积大小出现差异。自腹腔注射GST-mK5蛋白第一次起连续观察32天后处死裸鼠，剥瘤称重，计算和比较各组平均瘤重，结果显示：总剂量均为12.5mg/kg的GST-mK5蛋白及K5蛋白能显著的抑制裸鼠肝癌（Bel7402）实体瘤的生长，抑瘤率分别为56.91%±2.2%、28.94%±3.1%。GST-mK5与K5组之间的瘤重差异有统计学意义，说明GST-mK5蛋白较K5蛋白组具有更强地抑制肿瘤生长的作用，见图16、图17、图18。

4. GST-mK5融合蛋白抑制大鼠角膜新生血管的形成与炎症

选取体重150g~180g的雌性SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，裂隙灯检查排除眼表疾病，造模前3天每天1次双眼滴妥布霉素滴眼液。按照4ml/kg体重腹腔注射10%水合氯醛溶液全身麻醉，盐酸丙美卡因眼表麻醉。将直径为3.5mm的滤纸片浸入1N的NaOH溶液中备用。用棉签擦干大鼠眼表，夹取滤纸片，轻放在大鼠左眼角膜中央，烧灼40s，立即用50ml生理盐水冲洗烧伤区域，可见角膜中央形成一个圆形灰白色烧灼斑，单眼烧伤。将大鼠随机分为4组。每天分别在8:00am、12:00pm、4:00pm和8:00pm滴眼给药，每次每眼20μl。阴性对照为PBS组，阳性对照为0.1%地塞米松组，K5蛋白组药物浓度为1250nmol/L，GST-mK5蛋白组药物浓度为1250nmol/L。碱烧伤后第1、3、5、7、9、11天于裂隙灯下测量新生血管长度，计算新生血管面积（Ormerod LD,et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.30(10):2148-53,1989）；同时观察角膜炎症反应（包括结膜充血、角膜水肿和眼内渗出或出血三项之和）与角膜混浊度。结果显示GST-mK5蛋白和K5蛋白均能显著抑制SD大鼠角膜血管新生，改善碱烧伤所引起的炎症反应； GST-mK5蛋白抑制角膜新生血管形成与角膜炎症反应的作用明显强于K5蛋白，见图19、图20、图21、图22。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中山大学

 

<120>  突变型人纤溶酶原kringle 5及其制备方法及应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.2

 

<210>  1

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

actgaattcc catctgtatc gactccttcc tcatcatcct gtatgtttgg                50

 

 

<210>  2

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgctgcctcg agtcacgcac actgagggac atcacagta                            39

 

 

Claims (10)

1.一种突变型人纤溶酶原kringle5基因，其特征在于是以人纤溶酶原kringle 5的cDNA为基础，将N端5个酸性氨基酸密码子替换为中性氨基酸密码子。

2.一种扩增突变型人纤溶酶原kringle 5基因的引物，其特征在于上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种谷胱甘肽-S-转移酶修饰的突变型人纤溶酶原kringle5基因，其特征在于是以人纤溶酶原kringle 5的cDNA为基础，将N端5个酸性氨基酸密码子替换为中性氨基酸密码子，并且N端附加谷胱甘肽-S-转移酶基因。

4.根据权利要求1或3所述的基因，其特征在于是以人纤溶酶原kringle 5的cDNA为基础，将N端5个酸性氨基酸密码子替换为丝氨酸密码子。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述酸性氨基酸为Asp2，Glu4，Glu8，Glu9，Asp10。

6.一种mK5重组蛋白，其特征在于是由权利要求1所述的基因编码得到的蛋白。

7.一种GST-mK5融合蛋白，其特征在于是由权利要求3所述的基因编码得到的蛋白。

8.权利要求6所述mK5重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据已知人纤溶酶原kringle 5的cDNA序列，设计扩增引物，合成权利要求1所述mK5基因的核苷酸编码序列；

（2）将步骤（1）得到的mK5基因的核苷酸序列连接到具有编码GST融合蛋白功能的质粒中，得到重组表达载体；

（3）将步骤（2）得到的重组表达载体转化到宿主细胞中，培养被转化的宿主细胞；

（4）从宿主细胞培养基和宿主细胞内回收表达产物，纯化，得到GST-mK5融合蛋白；

（5）将GST-mK5融合蛋白经过凝血酶切割，获得单纯mK5重组蛋白。

9.权利要求7所述GST-mK5融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据已知人纤溶酶原kringle 5的cDNA序列，设计扩增引物，合成权利要求1所述mK5基因的核苷酸编码序列；

（2）将步骤（1）得到的mK5基因的核苷酸序列连接到具有编码GST融合蛋白的质粒中，得到重组表达载体；

（3）将步骤（2）得到的重组表达载体转化到宿主细胞中，培养被转化的宿主细胞；

（4）从宿主细胞培养基和宿主细胞内回收表达产物，纯化，得到GST-mK5融合蛋白。

10.权利要求1或3所述任一基因在制备治疗血管增生性疾病药物中的应用。

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