CN106350497B

CN106350497B - 一种胰蛋白酶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN106350497B
Application number: CN201611051879.8A
Authority: CN
Inventors: 黄鹤; 杜坤
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2019-07-16
Anticipated expiration: 2036-11-24
Also published as: CN106350497A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种胰蛋白酶及其制备方法与应用。本发明所述胰蛋白酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述胰蛋白酶稳定性、活性高，且耐高温。本发明所述制备方法工艺简单，成本降低，获得胰蛋白酶纯度高，显著提高了猪源胰蛋白酶的应用价值。为进一步利用产蛋白酶的研究、开发、生产工作奠定了基础。

Description

一种胰蛋白酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种胰蛋白酶及其制备方法与应用。

背景技术

胰蛋白酶是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。胰蛋白酶能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用，作为一种生产生活上重要的工具酶，在医药科研领域应用非常广泛。

传统胰蛋白酶的获取，在工业上以从胰液中提取为主，工艺复杂，耗费成本，而且不同批次产品间的质量不均一，且残留致病原的风险较难避免，遇高温容易变性。因此，工业上急需开发一种高效且质量稳定的胰酶生产方法。

此外，在未知蛋白肽段质谱分析中，样品在胰酶酶切处理前，化学变性剂的解折叠处理通常导致样品的后续检测复杂化，不利于样品的快速分析。而高温下进行变性未知蛋白胰酶酶切处理则可避免化学变性剂的使用。

通过基因工程表达胰蛋白酶，可以规避质量不均一等问题，但是野生型酶还存在一系列的问题，例如活性不高，稳定性不高，所以还需要进一步解决此类问题。

因此有必要针对胰酶热稳定性进行理性设计探索，以期提高其热稳定性和活性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种胰蛋白酶及制备方法与应用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种胰蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码所述胰蛋白酶的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了可以编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

同时本发明提供了包括所述DNA分子的载体。

其中，作为优选，所述载体为pPIC9K质粒。

本发明还提供了包括所述载体的宿主菌。

作为优选，所述宿主菌为毕赤酵母菌。

本发明提供了所述胰蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：

A)构建胰蛋白酶重组表达载体；

B)构建胰蛋白酶工程菌。

在一个实施方案中，所述步骤A)具体包括：

A1)构建含有野生型Sus scrofa猪胰蛋白酶基因的重组载体；

A2)利用重叠延伸PCR技术设计引物，以含有野生型Sus scrofa猪胰蛋白酶基因的重组载体为模板，进行PCR扩增获得包括编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的DNA分子的表达载体。

进一步的，A1)构建含有野生型Sus scrofa猪胰蛋白酶基因的重组载体具体包括以下步骤：

(1)以含有Sus scrofa猪胰蛋白酶基因的质粒pPIC9K-rpTry的核苷酸序列，结合质粒pPIC9K的多克隆位点与Sus scrofa猪源胰蛋白酶基因的限制性内切酶位点设计引物；

(2)以含有Sus scrofa猪源胰蛋白酶基因的质粒pPIC9K载体为模板，进行PCR扩增；含有Sus scrofa猪源胰蛋白酶基因的PCR扩增产物纯化后，用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pPIC9K用T4连接酶进行连接；连接产物转化进入大肠杆菌TOP10；

(3)在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒；利用EcoRI和NotI进行双酶切验证；验证成功的克隆子进行测序验证。

进一步的，作为优选，所述步骤A2)中引物序列如SEQ ID NO.3-6所示。

本发明所述制备方法中所述步骤A2)扩增产物为胰蛋白酶重组表达载体pPIC9K-rpTry-R1Q，该胰蛋白酶重组表达载体内含有SEQ ID NO.2所示DNA分子。

进一步的，作为优选，所述的制备方法步骤B)具体包括：

B1)胰蛋白酶重组表达载体转化宿主菌；

B2)诱导含胰蛋白酶重组表达载体的宿主菌表达蛋白。

作为优选，本发明所述制备方法中所述宿主菌为毕赤酵母菌。

在一些实施方案中，本发明将胰蛋白酶重组表达载体pPIC9K-rpTry-R1Q经SalI酶切线性化转入GS115毕赤酵母，构建高效表达胰蛋白酶的组成型毕赤酵母菌株。

胰蛋白酶重组表达载体的毕赤酵母菌株经BMGY诱导表达培养基和BMMY诱导表达培养基进行诱导后表达胰蛋白酶。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种胰蛋白酶及其制备方法与应用。本发明所述胰蛋白酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述胰蛋白酶稳定性、活性高，且耐高温。本发明所述制备方法工艺简单，成本降低，获得胰蛋白酶纯度高，显著提高了猪源胰蛋白酶的应用价值。为进一步利用产蛋白酶的研究、开发、生产工作奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示重组载体pPIC9K-rpTry构建示意图；

图2示突变载体测序结果；

图3示酶切特异性初步验证结果，其中泳道1为:Marker；泳道2为:RNase A；泳道3为:WT+RNase A；泳道4为:R1Q+RNase A；

图4示野生型Sus scrofa猪胰蛋白酶及本发明所述胰蛋白酶失活曲线比较；

图5示野生型Sus scrofa猪胰蛋白酶及本发明所述胰蛋白酶失活半衰期测定；

图6示本发明所述胰蛋白酶最适反应温度测定。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。如大肠杆菌TOP10购自康为世纪有限公司；卡那霉素(购自鼎国昌盛有限公司)

另外各培养基的组成如下：

1)、诱导表达培养基BMGY：1L：酵母粉10g，蛋白胨20g，溶于700ml去离子水，121℃湿热灭菌20min，冷却后加入100ml 1M，pH6.0，磷酸钾缓冲液，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×GY，4℃保存，存2个月。

2)、诱导表达培养基BMMY：1L：酵母粉10g，蛋白胨20g，溶于700ml去离子水，121℃湿热灭菌30min，冷却后加入100ml 1M pH3.0，磷酸钾缓冲液，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×M，4℃保存，存2个月。

3)、种子培养基：YPD完全培养基：100ml体系：酵母粉lg，蛋白胨2g，溶于90ml去离子水，121℃湿热灭菌20min，冷却后加入10ml 10×D，4℃保存(固体培养基含2.0％琼脂，一同湿热灭菌)。

4)、选择培养基MD：100ml体系：向80ml水中加琼脂糖2g(终浓度20g/L)121℃湿热灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB10ml(终浓度1.34g/L)，500×生物素0.2ml(终浓度4×10^-4g/L)，10×D(20％葡萄糖)10ml(终浓度20g/L)，倒至玻璃培养皿，凝固后4℃保存。

毕赤酵母转化常采用的是电转方法，具体方法如下：

1)酵母感受态细胞的制备。接种50μl保存酵母GS115菌液于5mlYPD培养基，30℃，300rpm，摇21h，至OD₆₀₀至1.0；取100μl活化菌液，分别接种于2瓶盛有100mlYPD液体培养基的500ml三角瓶，30℃，过夜至OD₆₀₀＝1.0～1.3(16h左右)(测量OD时，需用无菌YPD稀释菌液值OD值在0.2～0.8之间，再乘相应稀释倍数，一般按菌液：无菌YPD＝1:5稀释)；4℃，1500g/5000rpm，离心5min，弃上清；100ml冰预冷无菌水重悬菌体；4℃，1500g/5000rpm，离心5min，弃上清；10ml冰预冷1M山梨醇重悬菌体；4℃，1500g/5000rpm，离心5min，弃上清；50ml冰预冷无菌水重悬菌体；4℃，1500g/5000rpm，离心5min，弃上清；10ml冰预冷1M山梨醇重悬菌体；4℃，1500g/5000rpm，5min，离心，弃上清(用移液枪吸除上清)；200μl冰预冷1M山梨醇重悬菌体，无菌预冷的1.5ml Ep管，按每管80μl分装，以备转化(加上菌体体积，预计100ml培养液得到400μl感受态，能转化5杯)。值得注意的是感受态细胞尽量现用现做，尽量不放置于-80℃保存。

2)线性化重组载体电转化酵母GS115感受态

实验前一天，用75％酒精浸泡电转杯3～4h，超声震荡处理3～4min，用去离子水冲洗干净，将点转杯及杯帽放置于超净台上，紫外照射过夜。同时提前将MD平板做好，封口膜封板，放于4℃，保存备用，使用时事先将平板取出，放置于超净台上，升温至室温；将80μl酵母感受态细胞与5～10μg线性化质粒混合，放入冰预冷的0.2cm电转杯中；将上述电转杯在冰上孵育15min，迅速进行电转。电转条件：电压1.5kV，电阻400Ω，电容25μF，电击持续5.0msec；迅速加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液，转移至1.5ml无菌Ep管中，30℃静置培养1h；取上述转化液涂MD固体培养基，每板约250μl，30℃避光培养，2～3天可见菌落。

实施例1 野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶原表达载体的构建

所构建野生型重组猪源胰酶原表达载体pPIC9K-rpTry载体由北京金唯智有限公司全基因合成，如图1所示。其中去除了原基因N端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点(DDDDK)。缩短后的Sus scrofa猪源胰酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点。

实施例2重叠延伸PCR技术获得胰蛋白酶重组表达载体

按照重叠延伸PCR原则进行引物设计，详见表1。PCR反应聚合酶为Thermo公司的Phusion High-fidelity DNA polymerase.PCR体系建立如表1。

表1 删除突变所用引物

表2 重叠延伸PCR反应体系

5×HF Buffer	10μl
		10mM dNTPs	4μl
上游引物(10μM)	2.5μl
		下游引物(10μM)	2.5μl
质粒模板	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	29.5μl
Phusion DNA聚合酶	0.5μl
		总计	50μl

反应程序设定如下：98℃预变性30s，98℃变性15s，退火20s，72℃延伸5min，从变性到延伸共15个循环，循环后再72℃延伸10min，最终4℃保存。其中退火温度参考引物合成Tm。

胰蛋白酶重组表达载体经DMT酶(购自NEB公司)消化，去除非重组pPIC9K-rpTry载体。消化后的载体转化大肠杆菌TOP10菌株(购自康为世纪(北京)生物科技有限公司)中，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑取LB上的单克隆菌株利用TianGen质粒小提试剂盒(购自天根(北京)生物有限公司)提取胰蛋白酶重组表达载体，并利用通用引物测序，测序结果如图2所示，表明转化成功。

实施例3 含胰蛋白酶重组表达载体的酵母菌株的获得

将上述测序正确载体pPIC9K-rpTry-R1Q经SalI酶线性化，然后转化入酵母GS115感受态细胞，并涂布于MD固体培养基中，30℃培养2～3天。待菌落长出后，将MD固体培养基上菌株用无菌水收集于无菌EP管中。并涂布于含有1.0mg/ml G418的YPD-G418抗性培养基上，30℃培养3～4天。待菌落长出后，挑取单菌落于5ml YPD种子培养基中，30℃过夜培养至OD600＝1.0，提取酵母菌基因组，进行表型鉴定。

实施例4 含胰蛋白酶重组表达载体的酵母菌株的表达

将上述酵母工程菌接种至250mL三角瓶，装液量50mL的BMGY培养基，培养温度为30℃，摇床转速250r/min，培养至OD600＝2-6(对数生长期，16-18h)；室温1500-3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基中培养液重悬菌体，接种至100mlBMMY培养基，OD值为1.0。发酵温度30℃，摇床转速250r/min，进行诱导表达，每隔24小时，添加1.0％(v/v)甲醇，发酵时间为72h。

实施例5 胰蛋白酶的活性检测

胰蛋白酶作为一种蛋白质水解酶，除了能水解碱性氨基酸和其它氨基酸所形成的肽键之外，还能够水解碱性氨基酸形成的酯键，催化活性具有高度专一性。因此，可以利用人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-argine ethyl ester，简称BAEE)为底物测定胰酶的活性。N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)能在碱性条件下，在胰蛋白酶水解作用下，去除一个乙基而生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)，催化反应，对胰蛋白酶的酶活进行测定。

具体方法为：将诱导发酵液，8000rpm、离心10min，将上清保留。利用阴离子交换的方法对上清中目标蛋白进行纯化。用平衡缓冲液(20mMTris-HCl，pH 3.0)平衡SPSepharoseTM High performance柱后，将过夜透析后的培养液上样，用平衡缓冲液和洗涤缓冲液(20mMTris-HCl，0.5M NaCl，pH 3.0)进行梯度洗脱，并收集蛋白峰。将收集后的蛋白液，进行缓冲液(配制BAEE底物溶液所用缓冲液)更换，利用BCA蛋白质浓度测定试剂盒(购自北京鼎国生物技术有限公司)对更换缓冲液后的样品进行蛋白质浓度测定，以BSA作标准曲线。蛋白质定量后配置50ug/ml蛋白液。根据测定结果，将蛋白质浓度统一至200μg/ml。然后，对胰蛋白酶原利用肠激酶进行激活，激活体系为100μl样品加2μl肠激酶(肠激酶购自上海生工有限责任公司)，25℃孵育，每10min测定一次样品活性。

酶活测定方法为：首先，BAEE底物溶液需要在25℃条件下提前水浴处理。3.0mlBAEE底物溶液与100μl 1mM HCl水溶液预混于石英比色皿中。将肠激酶处理过的胰蛋白酶溶液加到盛有上述预混液的比色皿(比色皿光程为1cm)，迅速放至紫外分光光度计检测槽中，开始测定反应液在253nm处的吸光值，计算胰蛋白酶酶活。计算公式如下

BAEE units(U/ml)＝(△OD253/min×df)/(0.001×0.1)

其中，df为稀释因子，本测定体系df为32。

实施例6 胰蛋白酶的酶切特异性检测

对野生型及本发明所述胰蛋白酶样品的酶切特异性进行检测，所用的底物蛋白为RNase A蛋白(RNase A购自北京全式金生物技术有限公司)，分子量大小为13.7kDa。酶切反应体系按胰蛋白酶：RNase A质量比为1:500进行，37℃，反应时间为3h。反应结束后对反应液进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。

其中第2泳道为RNase A(不添加任何猪源胰蛋白酶)，作为空白对照，第3泳道为Rnase A与野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶作用后的，作为另一组对照。而第4泳道为实验组，即RNase A与本发明所述胰蛋白酶作用后的反应物。从图3可以看出两种酶都能对RNaseA进行反应，即黑色区域变淡，表明与野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶相比，本发明所述胰蛋白酶的酶切特异性未发生改变。

实施例7 胰蛋白酶的热稳定性测定

蛋白质热稳定性与其活性有关，主要指其在经历不可逆失活之前保持其活性的时间。通过考察野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶及本发明所述胰蛋白酶的失活半衰期t_1/2及最适反应温度T_opt，对热稳定性的检测。

失活半衰期t_1/2的测定方法为利用肠激酶激活胰蛋白酶样品，然后在50℃条件下孵育，按照孵育时间0min、30min、60min、120min、180min的时间点取出一定样品，冰浴30s，测定一次酶活。以孵育前的酶活为100％，根据实际酶活计算不同孵育时间点酶残留活性百分比。以酶残留活性自然对数为纵坐标，孵育时间t为横坐标，进行线性拟合。其斜率即为失活速率常数kd，利用如下公式计算其半衰期。

半衰期计算公式：

野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶及本发明所述胰蛋白酶在肠激酶激活后，迅速转移至50℃条件下孵育，每5min测定样品的酶活性，得到失活曲线，如图4所示。

从图4中可以看出野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶失活速度较R1Q失活速度快，50℃放置180min后，野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶保持了42.86％的残留活性，而本发明所述胰蛋白酶保持了73.08％的残留活性。

利用上述失活曲线测定的活性相对值，以Ln(相对活性)为纵坐标，以时间为横坐标，利用Origin9.0进行线性拟合，如图5所示。按照半衰期计算公式计算野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶及本发明所述胰蛋白酶在50℃条件下的半衰期。结果野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶的半衰期t_1/2为155.35min，本发明所述胰蛋白酶的半衰期t_1/2为368.69min。突变型N84S相比于野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶则提高了213.34min。

最适反应温度的测定方法为将BAEE酶活测定底物溶液分别放置于25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃、75℃、80℃及85℃条件下孵育。胰蛋白酶原样品按照最佳肠激酶激活时间进行激活，然后分别利用上述预孵育的底物溶液进行酶活测定，酶活性最大的温度即为最适反应温度T_opt。

实验对野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶及本发明所述胰蛋白酶R1Q最适反应温度测定，结果如图6所示，以胰蛋白酶的相对活性为纵坐标，以反应体系温度为横坐标，结果显示，随着反应温度的增加，其酶活正相关的增加。当反应体系温度达到65℃后，野生型Susscrofa猪源胰蛋白酶及本发明所述胰蛋白酶均存在一定的酶反应活性。当温度提升到75℃后野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶表现出一定的抗热能力，且活性达到最高，而本发明所述胰蛋白酶R1Q活性则在85℃时活性达到最高。在两者达到最高活性时，本发明所述胰蛋白酶R1Q的活性较野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶提高了1.42倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大学

<120> 一种胰蛋白酶及其制备方法与应用

<130> MP1618521

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser

1 5 10 15

Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly

20 25 30

Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys

35 40 45

Ser Arg Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly

50 55 60

Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe

65 70 75 80

Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser

100 105 110

Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr

115 120 125

Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala

130 135 140

Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile

145 150 155 160

Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser

165 170 175

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln

180 185 190

Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly

195 200 205

Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile

210 215 220

Ala Ala Asn

225

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgatgatg ataaaattgt tggtggttat acttgtgctg ctaattctat tccatatcaa 60

gtttctttaa attctggttc tcatttttgt ggtggttctt tgattaattc tcaatgggtt 120

gtttctgctg ctcattgtta caaatcaaga caagttagat tgggtgaaca taatattgat 180

gttttggaag gtaatgaaca atttattaat gctgctaaaa ttattactca tccaaatttt 240

aatggtaata ctttggataa tgatattatg ttgattaaat tgtcttctcc agctacttta 300

aattcaagag ttgctactgt ttctttgcca agatcttgtg ctgctgctgg tactgaatgt 360

ttgatttctg gttggggtaa tactaaatct tctggttctt cttatccatc tttgttgcaa 420

tgtttgaaag ctccagtttt gtctgattct tcttgtaaat cttcttaccc aggtcaaatt 480

actggtaata tgatttgtgt tggttttttg gaaggtggta aagattcttg tcaaggtgat 540

tctggtggtc cagttgtttg taatggtcaa ttgcaaggta ttgtttcttg gggttatggt 600

tgtgctcaaa aaaataaacc aggtgtttac actaaagttt gtaattatgt taattggatt 660

caacaaacta ttgctgctaa ttag 684

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggttccaat tgacaagc 18

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatttaatca acataatatc agtattacca ttaaaatttg gat 43

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatattatgt tgattaaatt gtctt 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cattctgaca tcctcttgat t 21

Claims

1.一种胰蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述胰蛋白酶的DNA分子。

3.编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.包括权利要求3所述DNA分子的载体。

5.根据权利要求4所述载体，其特征在于，所述载体为pPIC9K质粒。

6.包括权利要求4所述载体的宿主菌。

7.根据权利要求6所述宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为毕赤酵母菌。

8.权利要求1所述胰蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：

A)构建胰蛋白酶重组表达载体；

B)构建胰蛋白酶工程菌表达胰蛋白酶。

9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述步骤A)具体包括：

A1)构建含有野生型Sus scrofa猪胰蛋白酶基因的重组载体；

A2)利用重叠延伸PCR技术设计引物，以含有野生型Sus scrofa猪胰蛋白酶基因的重组载体为模板，进行PCR扩增获得包括权利要求3所述DNA分子的表达载体。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.3-6所示。

11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤B)具体包括B1)胰蛋白酶重组表达载体转化宿主菌；

B2)诱导含胰蛋白酶重组表达载体的宿主菌表达蛋白。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述宿主菌为毕赤酵母菌。