CN103602605B - 一种高效表达米曲霉脯氨酰内肽酶的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效表达米曲霉脯氨酰内肽酶的基因工程菌及其应用，是将基因S2导入毕氏酵母（Pichia？pastoris）进行高效表达；所述基因S2编码一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶，核苷酸序列如以下1）或2）所示：1）其核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1，SEQ？ID？NO.2所示核苷酸序列；2）在1）限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。所得重组酶具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性以及耐酸性环境等优点，对提高啤酒，葡萄酒，果汁饮品等非生物稳定性具有明显效果，具有重大应用潜力。

Description

一种高效表达米曲霉脯氨酰内肽酶的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种高效表达脯氨酸特异性内切蛋白酶的酵母工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

蛋白酶是具有催化蛋白水解生成胨、腙、多肽、氨基酸的一大类酶。蛋白酶按作用方式可分为内外肽酶；按活性中心分为丝氨酸蛋白酶，巯基蛋白酶，金属蛋白酶和羧基蛋白酶；按照蛋白酶来源分为植物，动物，微生物蛋白酶。其中丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用。丝氨酸蛋白酶家族成员非常庞大，分为81类，例如胰脏分泌的消化胰酶蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、血液凝固中的凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶以及氨肽酶等都属于丝氨酸蛋白酶家族。丝氨酸蛋白酶活性部位都含有Ser、His、Asp，并具有相同的催化机制，但是他们与底物结合部位的差异决定了各自对底物的专一性，正由于这种结构上微小变化，从而引起其在功能上的差异。并且，由于丝氨酸蛋白酶在结构上全为β蛋白，核心结构由两个非常相似的结构域（N结构域和C结构域），这两个结构域在结构上的差异导致它们在功能和进化上的作用差异。脯氨酸特异性内切蛋白酶，也称脯氨酰内肽酶（proline specific endoprotease,prolylendopeptidase，简称PEP）[EC.3.4.21.26]或脯氨酰寡肽酶，属于丝氨酸蛋白酶中一种新的家族，该家族能专一性地水解多肽中脯氨酸残基的羧基端肽键，含有典型的丝氨酸蛋白酶家族的G-X-S-X-G/A高度保守序列，但是活性位点Ser周围的氨基酸残基和其他典型的丝氨酸蛋白不同，而且与已知的丝氨酸蛋白酶家族（包括胰蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶Y）相比，在一级结构上同源性很低。

脯氨酸（Pro）是唯一具有亚氨结构的氨基酸，其环状结构影响了与其它氨基酸形成肽键时的空间构象。脯氨酸特异性内切蛋白酶对Pro在多肽中的位置和成键的构型都有很强的专一性，且能够特异性水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽键。因此，可以应用于食品工业、医药、多肽工业等领域；同时可以作为一种分子生物学的工具酶，应用于蛋白质序列测定，肽谱分析、特异位点的酶切、肽链的修饰以及加工等。

特别地，在食品工业方面，由于蛋白质水解产物可以为特定人群提供营养补充，因此有广泛的市场效应。来自乳清产品特别受欢迎的原因在于其极好的口感及良好的可溶性。但是，目前这些酪蛋白水解产物还未获得广泛的流行，缺乏市场渗透力的主要原因在于酪蛋白水解过程中所产生的苦味，这种出现苦味的情况代表了一个技术问题，目前在食品工业上还没有解决。但是可以确定的是苦味通常是很多蛋白质的水解产物，研究表明，苦味和几个特别的苦味肽相关，而不是大量的普遍的苦味肽。Matoba发现水解氨基酸C末端或N末端位置的肽类可以出现较少的苦味，而水解氨基酸涉及肽键两端的肽类的苦味则更多。酪蛋白富含疏水性氨基酸尤其是脯氨酸，Caprralla发现水解产物显著脱苦味伴随着疏水肽类出现的选择性降解。众所周知，包含脯氨酸残基的肽键很难被已知可购买的工业用酶切开。脯氨酸残基在肽的羧基末端的高发生率与低的苦味相关，并且证明了羧基末端脯氨酸残基预期的高发生率只能用高浓度的脯氨酸特异性内切蛋白酶来实现。

因此，在食品工业中，脯氨酸特异性内切蛋白酶不仅在解除直接与抑制苦味相关的苦味肽获得优质的蛋白质水解产物应用显示出了无以伦比的优越性，还在不直接与抑制苦味相关，比如将减少食物蛋白质的变应原性；减缓所得生面团制作面包的腐败；生成富含脯氨酸的肽作为各种食物或营养产品的理想添加剂，以增强蛋白质利用。尤其引人注目的是，该酶还可以用于啤酒酿造，解决啤酒实际生产过程中的冷混浊问题。主要是因为大麦蛋白质中富含脯氨酸序列很丰富，且在他们非发芽的形式时谷类蛋白质是极其难以降解成生产适当的可发酵的麦芽汁所必需的游离氨基酸。

目前已经发现的脯氨酸特异性内切蛋白酶主要有：一是来自于动物的脯氨酸特异性内切蛋白酶类。二是来自于植物的脯氨酸特异性内切蛋白酶类。它们主要存在于菠菜，蘑菇菌类等，主要是双孢子蘑菇。三是来自于微生物的脯氨酸特异性内切蛋白酶。目前已在细菌如脑膜败血性黄杆菌属，黄单胞菌属，嗜水气单胞菌，产气单胞菌属，假单胞菌属，假平胞菌荚膜，盐生盐杆菌和曲霉中发现该酶的存在，并且克隆得到编码脑膜败血性黄杆菌属（Genbank:M81461.1），嗜水气单胞菌（Genbank:D14005.1），产气单胞菌（Genbank:AF065429），假平胞菌荚膜（Genbank:AB010298），黄色粘球菌（Genbank:ABF89794）以及烟曲霉（Genbank:XM744168）和黑曲霉（Genbank:AX458699）的核苷酸序列，然而，除假平胞菌属，盐生盐杆菌和黑曲霉外，其他六种微生物都属于病原性微生物。

近年来，脯氨酸特异性内切蛋白酶的研究成为热点，因其在食品行业上具有诱人的应用前景毋庸置疑，已经引起了越来越多国内外食品研究工作者们的青睐。国外已有商业酶应用在啤酒行业中，以抑制瓶装啤酒中混浊的形成，虽然商品酶价格十分昂贵，但在国内仍旧处于垄断地位。究其原因在于食品安全级微生物产脯氨酸特异性内切蛋白酶自然酶活较低，分离纯化困难，基因工程菌研究很少，从而限制了对其生理功能和性质的研究，相应地，国内对该酶的研究也非常滞后，并未建立相关的研究体系。

米曲霉是美国食品药品管理机构认定的生物安全菌，从米曲霉中提取脯氨酸特异性内切蛋白酶应用于药品食品行业安全可靠。然而，迄今为止，即使在95年有日本专利显示从产酱油米曲霉菌株中发现具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性，但是国内外有关米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶编码序列和制备方法的未见任何报道。因此，研究新型米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶基因并实现规模化生产具有重要研究意义和应用价值。本研究根据黑曲霉（Genbank:AX458699）和烟曲霉（Genbank:EDP53789）来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白质序列设计引物，从筛选获得的米曲霉中成功调取获得米曲霉的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因序列，发现其与黑曲霉（Genbank:AX458699）和烟曲霉（Genbank:EDP53789）来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白序列的同源性分别仅为19.5%和21%，并验证了其脯氨酸特异性内切蛋白酶功能与应用价值。进一步通过在NCBI上进行BLASTp相似性检索，发现已报道全基因组测序的米曲霉Aspergillus oryzae RIB40中机器自动注释的基因Genbank:XM_001825944.2与本研究调取基因序列一致，但是该条目基因Genbank:XM_001825944.2被预测为丝氨酸蛋白酶，未做其它任何相关研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效表达米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶的酵母工程菌，是将蛋白酶基因S2导入Pichia pastoris得到的酵母工程菌；

所述基因S2的序列一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因以及基于毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切脯氨酸特异性内切蛋白酶基因序列，其特征在于其核苷酸序列如以下1）或2）所示：

1）其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；

2）在1）限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。

所述毕氏酵母为GS115，KM71或SMD1168，其中优选GS115。

所述基因编码的蛋白质及含有所述基因的转基因细胞系、基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本发明保护的范围。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种高产脯氨酸特异性内切蛋白酶的重组毕赤酵母工程菌及其构建、表达方法。

所述高产脯氨酸特异性内切蛋白酶的重组毕赤酵母的构建方法为选取重组毕赤酵母表达载体pPIC9，构建重组表达载体pPIC9-S2，以毕赤酵母GS115为宿主进行表达，具体步骤如下：

（1）提取米曲霉A.oryzae(中国微生物菌种库保藏编号：CICC40214)总RNA，进行反转录获取cDNA，以所获得cDNA为模板，利用简并引物g1和g2进行PCR扩增保守区，经过NCBI，EMBL数据库比对，找出同源性最高的序列；然后以所得序列为模板，利用引物g3和g4通过PCR扩增得到1743bp的米曲霉全长脯氨酸特异性内切蛋白酶；

（2）设计引物g5和g6，利用PCR向A.oryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶的DNA编码框5’和3’两侧分别引入SnaBI和Not I限制性酶切位点（不带信号肽）；（下划线显示）；

（3）选取毕赤酵母表达载体pPIC9，构建重组表达载体pPIC9-S2，将重组表达质粒pPIC9-S2转化毕赤酵母GS115，通过G418抗生素平板筛选阳性转化子并测序验证；

所述PCR引物

g1：5-RASMTWSRYATYASGGRA-3

g2：5-SVBYCBCYMBRGRKMANRNTB-3

g3：5′-ATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAGCTG-3′，

g4：5′-TTACTGGATGATATCCATCGGCCGCATC-3，

g5:5'-CGGTACGTATTGGGGT TGTTTAGAGG-3'

g6:5’-CCGCGGCCGCCTACATCACCGCCCCCTTTG-3’

所述重组菌生产脯氨酸特异性内切蛋白酶的步骤为：将电转化线性化重组表达质粒pPIC9-S2的阳性重组毕赤酵母GS115/pPIC9-S2在20-30℃、100-250rpm条件下培养至OD₆₀₀=2.0-6.0，随后转入10-28℃培养并加入终浓度为0.1-2.0%的甲醇，诱导表达30-120h，转速100-250rpm。

本发明首次从A.oryzae中分离、鉴定了脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，由于A.oryzae野生菌株的脯氨酸特异性内切蛋白酶表达水平低，远远达不到工业化应用要求，因此选用毕赤酵母重组表达系统生产脯氨酸特异性内切蛋白酶能大幅提高其产量，使更易达到工业化应用要求。本发明利用毕赤酵母GS115成功构建了一株高可溶性表达A.oryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白的酵母工程菌，并对表达的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白进行了纯化。所得重组酶对酸性、高温和酶抑制剂均有很好的耐受性。

本发明对纯化获得的重组脯氨酸特异性内切蛋白酶进行了最适作用pH、pH稳定性、最适作用温度及温度稳定性分析。结果表明该脯氨酸特异性内切蛋白酶以Z-Gly-Pro-pNA为底物时，最适作用pH为5.0，最适作用温度为40℃；结果还显示该脯氨酸特异性内切蛋白酶pH稳定性及温度稳定性都非常好。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供上述重组脯氨酸特异性内切蛋白酶在提高啤酒，葡萄酒，果汁饮品等非生物稳定性中的应用，尤其是对提高啤酒非生物稳定性的应用。

本发明分析了纯化的脯氨酸特异性内切蛋白酶对啤酒非生物稳定性的影响，数据表明试验样（添加脯氨酸特异性内切蛋白酶）的非生物稳定性指标（冷混浊）优于对照样，6+1冷热混浊实验结果能够达到相应的货架期要求，并且成品啤酒贮存期间（六周）对照组的起始浊度和贮存过程中的浊度增加明显高于试验组。以上数据表明该重组脯氨酸特异性内切蛋白酶具有很好提高啤酒非生物稳定性的效果，具有较大应用潜力。

附图说明

图1为PCR扩增的A.oryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶基因S2、蛋白质序列的功能区预测及BLASTp相似性检索部分结果；（A）M:DL2000Marker；1:脯氨酸特异性内切蛋白酶基因S2；（B）A.oryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白序列保守功能区预测。

图2是本发明实施例2的信号肽预测结果图；

图3是本发明实施例2的利用“同源建模”法预测及其软件分析的米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶功能结构图示；

图4是本发明实施例3的pPIC9-S2酶切鉴定图；

图5是本发明实施例3的pPIC9-S2SDS-PAGE及native-SDS-PAGE电泳结果图。

图6是脯氨酸特异性内切蛋白酶应用于提高啤酒非生物稳定性的结果图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1A.oryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶基因的获得

根据产气单胞菌（Genbank:AF065429），假平胞菌荚膜（Genbank:AB010298），黄色粘球菌（Genbank:ABF89794）以及烟曲霉（Genbank:XM744168）和黑曲霉（Genbank:AX458699）来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白质序列设计简并引物如下：

g1：5-RASMTWSRYATYASGGRA-3；

g2：5-SVBYCBCYMBRGRKMANRNTB-3；

以米曲霉cDNA为模板，g1和g2为引物进行PCR后，得到1000bp的产物片段，将产物进行测序后，在NCBI比对后，发现其均与A.oryzae蛋白酶基因（Sequence ID：XM_001825944.2）的保守序列同源性较高。

进而，我们根据GenBank数据库中已公开的A.oryzae蛋白酶基因（Sequence ID：XM_001825944.2）序列，重新设计引物，进行PCR，其步骤如下：

根据NCBI公共数据库的序列信息设计5’端和3’端引物，以米曲霉1号菌株的cDNA为模板，采用RT-PCR的方法获得米曲霉脯氨酸内切蛋白的全长编码序列S2。

1.引物设计（下划线为酶切位点，酶切位点为保护碱基，有效序列为酶切位点后序列）

g3:5’-CGGTACGTAATGCGTTTCGACCTCTTTCTAAT-3’（SEQ ID.3）

g4:5’-CCGCGGCCGCCTACTACATCACCGCCCCCTTTGTTAT-3’（SEQ ID.4）

2.RT-PCR

反转录反应条件如下:37℃15min（反转录反应），85℃5sec（反转录酶的失活反应）

PCR反应体系：

试剂	使用量
		Primer Front(10mm)	1μl
Primer Reverse(10mm)	1μl
		10×PCR buffer	1μl
dNTP(各2.5μmol)	0.8μl
		rTaq	0.5
cDNA	3-5μl

补水至10μL。反应体系可按需求相应放大。

反应条件：95℃,3min预变性；95℃,30s，退火，63℃,1min，变性，72℃,1min，延伸，第二步到第四步进行30个循环；72℃,5min；12℃。电泳检测PCR扩增产物，获得大小为1743bp的DNA片段（见图1），利用omega公司提供的凝胶纯化试剂盒纯化目的DNA片段，即可获得带有A尾的目的DNA。

3.连接

成分	使用量
		带A尾的PCR产物	4.5μl
pMD-19T	0.5μl

混匀后，加入5μl solution I，16℃连接18h。

4.转化

取10μl连接产物加入感受态细胞JM109中，置于冰上30min，42℃热激90s后立即放在冰上，放置2min后，加入1ml不含抗生素的LB培养基，37℃摇床培养1h，将转化的菌液涂于LB（Amp）蓝白板上，37℃培养过夜。在版平板上分别挑取多个菌落做PCR鉴定。

5.质粒提取

用omega公司的质粒抽提试剂盒提取PCR鉴定为阳性的克隆质粒，经核酸测序获得米曲霉脯氨酸内切蛋白编码基因的核酸序列。

根据毕赤酵母表达的特点，对得到的基因序列做选择性改造，优化后的基因序列如SEQID NO.2所示，优化后的序列由生物公司合成。

实施例2利用“同源模建”法获得A.oryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶晶体预测结构及其与其他曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶的氨基酸相似性

米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶基因S2全长为1743bp，其中预测的新蛋白的开放阅读框位于64-1743位核苷酸，编码558个氨基酸残基，分子量大小为65kDa。

根据SignalP预测，该蛋白N端为信号肽的可能性为86.4%，信号肽切割位点位于21和22号氨基酸间（见图2）。

将A.oryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶的氨基酸序列提交SWISS-MODEL蛋白质在线模建服务器（http://swissmodel.expasy.org/）进行同源建模，随后利用Discovery studio软件对米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白同源建模结构分析（见图3）：该蛋白同源建模的模板为3n2z，和模板之间的序列同源相似性为18.2%，催化三联体位置是Ser179,Asp430,His455，保守区177-182位氨基酸，图3中A为米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白3D结构图，B为米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白的活性位点和保守区。

从筛选获得的米曲霉中调取获得米曲霉的脯氨酸特异性内切蛋白酶氨基酸序列与黑曲霉（Genbank:AX458699）和烟曲霉（Genbank:EDP53789）来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶进行蛋白序列同源比对，发现蛋白序列的同源性分别仅为19.5%和21%。

实施例3米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶真核表达载体的构建，重组表达及其蛋白表达

1.真核表达载体的构建

1）引物设计：从信号肽之后的成熟肽序列开始起设计引物

g5:5'-CGGTACGTATTGGGGT TGTTTAGAGG-3'；

g6:5’-CCGCGGCCGCCTACATCACCGCCCCCTTTG-3’；

2）PCR反应，以克隆载体pMD-19T-S2为模板，55-62℃退火，35cycles。

3）SnaBI和NotI双酶切S2的PCR产物和质粒pPIC9

成分	使用量
		纯化PCR产物/质粒	30μl
10*quitcut buffer	5μl
		QuitCut SnaBI	1μl
QuitCut NotI	1μl
		ddH2O	13μl
总体积	50μl

37℃酶切2hr

4）如常规方法连接，转化，并进行双酶切鉴定（见图4）

图中1,2号克隆为阳性pPIC9-S2质粒双酶切图（SnaBI，NotI），M为15000bp的Marker；对这个克隆抽提质粒，从AOX3和AOX5两端进行全长测序，进一步验证了插入的目的基因的正确性。

2重组pPIC9-S2在毕赤酵母GS115中的表达。

1）电转化甲醇毕赤酵母及阳性转化子的筛选

据毕赤酵母表达系统操作手册，将测序正确的重组质粒pPIC9-S2用限制性内切酶SacI线性化后，电激转化毕赤酵母GS115，涂布于MD平板上筛选目标基因整合到受体菌染色体上的转化子。因为基因拷贝数的增加通常可以提高基因产物的表达量，故再以载体上的G418抗性基因筛选高基因拷贝的转化子，即将MD平板上获得的转化子点种于含200、400、600、800μg/mL G418的YPD平板上，30℃培养3d后，挑取G418抗性最高的重组转化子，提取总DNA，以其为模板，以5’AOX和3’AOX，SEQ ID.5和SEQ ID.6为引物进行PCR鉴定，以空载体转化菌作对照，进一步验证了目的基因已经整合进酵母基因组。

2）重组pPIC9-S2在毕赤酵母中的诱导表达

重组毕赤酵母在25-50mL BMGY培养基(250mL三角瓶)中培养至OD为2.0～6.0，离心收集菌体，加入25-50mL BMMY培养基后于20-30℃，100-250rpm／min条件下继续培养，每12-24h补加占培养液体积0.1-1.0%的甲醇，定时取样，测定菌体密度和酶活性，同时进行培养液的SDS-PAGE和酶活测定。

3）重组酶的纯化及其SDS-PAGE，native-SDS-PAGE凝胶电泳分析（见图5）

蛋白质纯化参考GE Healthcare指南，SDS-PAGE分析按照《分子克隆实验指南》(第三版)，使用的凝胶浓度为12.5%，上样量5-25μL。蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色。

native-SDS-PAGE实验步骤

（1）在5-10μl酶液中加入5-10μl样品缓冲液[0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HC1），pH6.8；2%SDS（重量：体积），10％甘油（体积：体积），0.01％溴酚蓝（重量：体积）]在37℃水浴中放置5-10min，再进行上样电泳分离。注：在提取样品时，样品提取液中不加巯基乙醇是为了在电泳过程中使蛋白酶适度变性，以便在电泳结束后能恢复这些蛋白酶的活性。β-巯基乙醇：用于打开二硫键的，使蛋白质的四级或三级结构被破坏。是一种具有特殊臭味的无色透明液体，易燃、易溶于水和醇、醚等多种有机溶剂。

（2）制胶与电泳：在制备分离胶的过程中加入0.2%的明胶，混合均匀后再进行灌胶，凝固后即为Gelatin-SDS-PAGE（底物胶）。“浓缩胶”的聚丙烯酰胺密度为5%，“分离胶”中聚丙烯酰胺密度为12%，厚度为1mm³。加样跑电泳。注：明胶因为是在制备凝胶时加入，所以已经交联在凝胶中，在电泳中不会在电场的作用下泳动。

（3）去SDS：电泳完成后，将分离胶在复性缓冲液[2%TritonX-100，50mmol/LTris-HC1，pH7.5]中浸洗2-3次，每次5-10min。

（4）复性：将分离胶置于缓冲液[50mmol/L Tris-HC1，pH7.5]中在37℃下放置进行酶反应3h。

（5）染色与脱色：用考马斯亮蓝染色30min，然后数小时换一次脱色液（5％乙酸+10％甲醇），直至背景清晰。注：经染色和脱色处理的凝胶背景颜色为蓝黑色，蛋白酶反应部位颜色变浅。凝胶中呈现蛋白酶反应的区域大小和该部位的透光率与蛋白酶活性成正比。

图5中，M为蛋白Marker；泳道1为纯化重组酶蛋白S2的SDS-PAGE电泳图；泳道2为纯化重组酶蛋白S2的明胶作为底物的native-SDS-PAGE电泳图。

4）酶活检测

脯氨酸特异性内切蛋白酶酶活测定方法参照Luppo Edens（Luppo Edens,Peter Dekker,RobVan Der Hoeven,et al.Agricultural and Food Chemistry,2005,53(20):7950-7957）。

取适量菌体上清液（或者纯化稀释酶液），加入v1柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液（pH5.0）和v22mmol/L的Z-Gly-Pro-pNA溶液，摇匀，37℃分别反应10min。测定反应前后溶液在410nm处的吸光度。在上述条件下，每分钟分解Z-Gly-Pro-pNA释放1umol pN的酶量，定义为一个酶活单位（U/ml）。通过△A₄₁₀计算脯氨酰内肽酶酶活。U/ml=(△A/min)*(V*/rvb);△A/min-吸光度变化；V-反应体系体积（ml）；；r-摩尔消光系数（cm²/mol）;v-样品量（ml）；b-比色杯光程（cm），上述用量可按比例增加或减少。

经测定，重组脯氨酸特异性内切蛋白酶粗酶活为400mU/mL，密码子优化后的重组酶酶活达到1400mU/mL，高于报道的脯氨酸特异性蛋白酶的活力（476mU/ml，路福平等；647mU/ml，李宁环等）

专利参考：路福平等，一种黑曲霉脯氨酸蛋白酶内肽酶及其制备方法，专利号CN101294153)

文献参考：李宁环等，烟曲霉脯氨酰内肽酶在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达与重组酶性质，微生物通报，2013，40（3）：391-399。

实施例4纯化的A.oryzae重组脯氨酸特异性内切蛋白酶最适作用pH和pH稳定性分析

脯氨酸特异性内切蛋白酶酶活测定方法参照Luppo Edens（Luppo Edens,Peter Dekker,RobVan Der Hoeven,et al.Agricultural and Food Chemistry,2005,53(20):7950-7957）。

对纯化获得的重组脯氨酸特异性内切蛋白酶进行了最适作用pH和pH稳定性分析。结果表明该脯氨酸特异性内切蛋白酶以Z-Gly-Pro-pNA为底物时，最适作用pH为5.0，pH稳定性为pH3.0-8.0。

实验结果充分表明重组pPIC9-S2具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性以及耐酸性的优点。

实施例5纯化的A.oryzae重组脯氨酸特异性内切蛋白酶最适作用温度和温度稳定性分析

脯氨酸特异性内切蛋白酶酶活测定方法参照Luppo Edens（Luppo Edens,Peter Dekker,RobVan Der Hoeven,et al.Agricultural and Food Chemistry,2005,53(20):7950-7957）。

对纯化获得的重组脯氨酸特异性内切蛋白酶进行了最适作用温度及温度稳定性分析。结果表明该脯氨酸特异性内切蛋白酶以Z-Gly-Pro-pNA为底物时，最适作用温度为40℃，温度在65℃以下，酶的稳定性都非常好。

实验结果充分表明重组pPIC9-S2具有合适于食品和酿酒酿造工业应用所需温度的优点。

实施例6A.oryzae重组脯氨酸特异性内切蛋白酶对啤酒非生物稳定性的影响。

容易引起混浊沉淀的蛋白主要是含有丰富脯氨酸片段的特殊多肽，由于其具有吡咯环状结构，致使环结构前的羰基氧成为更强的氢原子受体，可以使它容易和单宁形成氢键结合形成更加稳定的聚合物。而利用脯氨酸特异性内切蛋白酶可以分解引起大分子混浊的蛋白片段，从而提高啤酒的非生物稳定性。

冷混浊的检测原理：啤酒在过冷状态下会出现混浊，实验在低温条件下（-8℃），通过向样品中添加酒精以降低多酚，蛋白质复合物的溶解度，从而加速混浊的形成。低温试验能够快速检测啤酒预期的长时间贮存而出现的混浊。

6+1冷热混浊强化实验：将样品放入恒温箱内，去除后立即测定浊度尽量接近0℃放置一天；取出后立即测定浊度，尽量接近0℃。要求每次做俩平行，最后取平均值。结果见图6，其中,

图6A

图6B

空白对照：添加重组S2（1-5mg/L）处理后的样品试验样在4度保存，不同时间点取样测浊度。

试验样：添加重组S2处理后的样品试验样继续添加重组S2（0.1-10mg/L）在4度保存，不同时间点取样测浊度。

数据表明试验样（添加脯氨酸特异性内切蛋白酶）的非生物稳定性指标（冷混浊）优于对照样，6+1冷热混浊实验结果能够达到相应的货架期要求，并且啤酒贮存期间（六周）对照组的其实浊度和贮存过程中的浊度增加明显高于试验组。以上数据表明该重组脯氨酸特异性内切蛋白酶具有很好提高啤酒非生物稳定性的效果，具有较大应用潜力。

实例7其他丝氨酸蛋白酶不具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的实例

一种丝氨酸蛋白酶编码基因和重组酶及应用（参见公开号：103160527A；发明人：候进慧），该重组丝氨酸蛋白酶基因是一种新型Pantoea ananatis丝氨酸蛋白酶基因，具有内切葡聚糖酶活性。

一种捕食线虫真菌重组胞外丝氨酸蛋白酶的制备方法（参见公开号：103103172A；发明人：孟庆玲等），该重组丝氨酸蛋白酶具有胞外丝氨酸蛋白酶活性，属于碱性蛋白酶。

一种蛇毒丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用（参见授权号：CN102021160B；发明人：许文涛等），该重组蛋白丝氨酸蛋白酶具有蛇毒丝氨酸蛋白酶活性，并且属于精氨酸酯酶。

这些实例表明，丝氨酸蛋白酶是一个庞大的蛋白酶家族，其功能具有特异性和复杂性，所催化的底物特异性也非常强。新型丝氨酸蛋白酶的研究与开发是获得特异性丝氨酸蛋白酶的基础，随着分子生物学，基因工程和酶工程等的迅猛发展，我们首次鉴定证实了丝氨酸蛋白酶家族中的一种米曲霉来源的新型脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，并对其进行了细致研究。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种高效表达脯氨酸特异性内切蛋白酶的酵母工程菌，其特征在于是将基因S2导入毕氏酵母(Pichiapastoris)进行高效表达；所述基因S2编码一种脯氨酸特异性内切蛋白酶，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于所述毕氏酵母为GS115，KM71或SMD1168。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述毕氏酵母优选GS115。

4.一种构建权利要求1所述酵母工程菌的方法，其步骤如下：

(1)设计引物，利用PCR获得基因S2序列，并对其密码子进行改造；

(2)通过双酶切、连接将蛋白酶基因S2插入到表达质粒pPIC9，pPIC3K，pPIC9K，PAO815和或pPICZα系列及其类似载体；

(3)将步骤2)获得的载体转化毕赤酵母GS115，KM71或SMD1168，获得酵母工程菌，通过G418抗生素平板筛选阳性转化子并进行测序验证。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于优选载体及宿主组合为pPIC9和毕赤酵母GS115。

6.以权利要求1所述酵母工程菌生产脯氨酸特异性内切蛋白酶的方法，其步骤如下：

(1)将权利要求1获得的酵母工程菌在20-30℃、100-250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝2.0-6.0；

(2)随后转入20-30℃培养并加入终浓度为0.1-1.0％的甲醇，诱导表达30-120h，转速100-250rpm。

7.一种权利要求1所述酵母工程菌在提高啤酒、葡萄酒、果汁饮品的非生物稳定性中的应用。