CN107338234A

CN107338234A - 一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用

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Publication number: CN107338234A
Application number: CN201710383874.3A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 闫巧娟; 孙倩; 耿芳; 龚思怡
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2017-11-10
Anticipated expiration: 2037-05-26
Also published as: CN107338234B

Abstract

本发明公开了一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用，具体涉及重组天冬氨酸蛋白酶、编码基因及其生产方法和应用。该重组天冬氨酸蛋白酶是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述重组天冬氨酸蛋白酶的编码基因是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。将米黑根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因RmproA连接至巴斯德毕赤酵母GS115表达载体pPIC9K，并转化至毕赤酵母中诱导表达得到重组天冬氨酸蛋白酶。经5L发酵罐高密度发酵后，重组菌株在156h时最高产蛋白酶活力为3400U/mL，蛋白含量为6.42mg/mL。本发明提供的重组天冬氨酸蛋白酶能有效嫩化猪肉，降低剪切力，使肉质适口，能够有效水解动物及植物蛋白，制备低分子量多肽。

Description

一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用。

背景技术

蛋白酶(Protease，EC 3.4)是一类催化蛋白质水解生成多肽和氨基酸的酶，在生物体中发挥着不同的生理功能。蛋白酶来源丰富，广泛存在于动植物及微生物中。通过天然筛选和基因工程等手段获得的蛋白酶具有不同的特性，已应用于食品、制革、饲料和洗涤等多个领域。

天冬氨酸蛋白酶是具有重要工业应用价值的一类蛋白酶，在奶酪制造、调味料生产、酪蛋白水解物制备、肉类嫩化及多肽制备等中都有应用。大多数天冬氨酸蛋白酶在酸性pH条件下表现出较高活性，又被称为酸性蛋白酶。已报道的产酸性蛋白酶的菌株主要有曲霉属的黑曲霉、米曲霉和泡盛曲霉等。根毛霉属和毛霉属也是产酸性蛋白酶的优良菌株，已被广泛应用于商业凝乳酶制剂的制备。目前，国内研究较多的是米黑毛霉所产的凝乳酶，经紫外诱变后的米黑毛霉所产的凝乳酶活力达到2703 SU/mL(李学朋,关明玲,冯瑞章等.产凝乳酶米黑毛霉的诱变育种研究.食品工业科技,2015,36:137-141)。李学朋等人优化了米黑毛霉产凝乳酶的固体发酵条件，产酶活力最高达3649 SU/mL(李学朋,师希雄,冯瑞章等.米黑毛霉产凝乳酶固体发酵培养基优化.食品工业科技,2014,7:130-134)。此外，米黑毛霉一个天冬氨酸蛋白酶基因已在卷枝毛霉中成功表达(Dickinson L.,Harboe M.,Heeswijck R.V.,Stroman P.,Jepsen L.P.Expression of active Mucor mieheiaspartic protease in Mucor circinelloides.Carlsberg Research Communicaions,1987,52,243-252)。有专利报道利用米黑毛霉生产凝乳酶方法(专利号为201310472404.6，申请日期2013.10.11)，采用米黑毛霉ATCC16457发酵产凝乳酶，添加硫酸盐和还原糖发酵时酶活力最高为410IMCU/mL。

米黑根毛霉是工业生产蛋白酶和脂肪酶的重要菌株，其产生的天冬氨酸蛋白酶应用十分广泛。自1997年米黑根毛霉一个凝乳酶被纯化以来，其凝乳酶相关特性得到了一系列研究，但其蛋白酶活性较低 (Preetha S.,Boopathy R.Purification andcharacterization of a milk clotting protease from Rhizomucor miehei.WorldJournal of Microbiology and Biotechnology,1997,13,573-578)。近年来，米黑根毛霉蛋白酶的研究主要集中在高压均质和热处理对其凝乳酶和蛋白酶活性等的影响方面(Ricardo B.,Tribst A.A.L.,&Cristianini M. Comparative effects of highisostatic pressure and thermal processing on the inactivation of Rhizomucormiehei protease.LWT-Food Science and Technology,2016,65:1050～1053)，也有将米黑根毛霉蛋白酶与骆驼凝乳酶复合应用于奶酪方面的报道(Soltani M.,Boran O.S.,&Hayaloglu A.A.Effect of various blends of camel chymosin and microbial rennet(Rhizomucor miehei)on microstructure and rheologyical propertyes of IranianUF white cheese.LWT-Food Science and Technology,2016,68:724-728)。国内专利报道仅有米黑根毛霉天然菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用(专利号为201110312302.9，申请日期2011.10.14)，在以黄豆粉为氮源时其固体发酵粗酶液的凝乳酶活力最高达到85714U/g干基。虽然米黑根毛霉基因组报道过其含有多个蛋白酶基因，但对其蛋白酶基因的克隆表达和蛋白酶的其他应用报道较少。本发明的米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶与已报道的蛋白酶同源性最高仅为45％，具有新颖性，同时具有良好的酶学特性，能够有效嫩化猪肉和制备低分子量多肽，在食品行业具有很大应用潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其在猪肉嫩化和多肽制备中的应用，天冬氨酸蛋白酶来源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)。

本发明所述的重组天冬氨酸蛋白酶是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明保护上述重组天冬氨酸蛋白酶的编码基因，所述重组天冬氨酸蛋白酶的编码基因是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

本发明提供一种重组质粒，是将米黑根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因RmproA连接至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115表达载体 pPIC9K构建而成。

本发明提供一种重组菌株，所述重组菌株是以Pichia pastoris GS115为宿主构建的，是将上述重组质粒转入巴斯德毕赤酵母中获得的，所述重组菌株表达碱基序列如SEQID NO：2所示的DNA，得到重组天冬氨酸蛋白酶。

本发明提供一种制备重组天冬氨酸蛋白酶的方法，是将上述米黑根毛霉的蛋白酶基因RmproA连接至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115表达载体pPIC9K，并转化至毕赤酵母中诱导表达得到重组天冬氨酸蛋白酶。

本发明提供应用所述重组菌株发酵生产重组天冬氨酸蛋白酶的方法，是由上述重组菌株进行高密度发酵培养，经甲醇诱导表达得到重组天冬氨酸蛋白酶。

上述应用所述重组菌株制备重组天冬氨酸蛋白酶经过如下步骤：

1)种子液培养：将重组菌株接种于YPD培养基中，在30℃、 220rpm条件下培养24h，得到种子液；

2)分批发酵培养：将步骤1)的种子液以10％接种量接种于5L 发酵罐中的分批发酵培养基中进行培养，分批发酵培养基的装液量为 20-30％，搅拌转速为500-600rpm，通气量为1.0-2.0vvm，用25％氨水调节pH，控制pH 4.0-6.0，培养温度为28-30℃；

3)甘油流加培养：当分批发酵培养基中的甘油耗尽溶氧反弹时以15-20mL/h/L的流速补加质量浓度为50％的甘油，待甘油再次耗尽溶氧反弹时，饥饿0.5-1.5h，开始流加诱导培养基；

4)甲醇诱导培养：将搅拌转速升高至800-900rpm，诱导培养基采用分段流加方式：0-8h时流速为3.6mL/h/L，>8h时流速为10.9 mL/h/L，诱导重组天冬氨酸蛋白酶表达，得到发酵液；

5)离心和纯化：将所述发酵液依次进行离心和纯化。

重组天冬氨酸蛋白酶的离心、纯化包括以下步骤：

(1)将发酵培养后得到的发酵液在10000×g条件下冷冻离心 10min，取上清液，所述上清液为含有重组天冬氨酸蛋白酶的溶液；

(2)将步骤(1)中含有重组天冬氨酸蛋白酶的溶液依次进行 QSFF强阴离子交换层析和S-100凝胶过滤层析，得到纯化后的重组天冬氨酸蛋白酶。

上述发酵培养使用的分批发酵培养基包括：CaSO₄ 0.93g，K₂SO₄ 18.2g，MgSO₄·7H₂O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，85％磷酸26.7mL， PTM₁ 4.35mL/L；所述甲醇诱导是含有12mL/L PTM₁的100％甲醇的诱导培养基。

本发明提供一种重组天冬氨酸蛋白酶嫩化猪肉的方法，步骤如下：

(1)将原料猪肉剔除可见的结缔组织及脂肪，切成方块；

(2)按原料猪肉重量计算，均匀注射0.1-1.0mg/100g肉重的重组天冬氨酸蛋白酶，于4℃放置48h。

本发明提供一种重组天冬氨酸蛋白酶制备多肽的方法，步骤如下：

(1)动物肉类原料(如兔肉等)按重量计算，加入100-500U/g 肉重的重组天冬氨酸蛋白酶，动物蛋白原料(如阿胶等)和植物蛋白原料(如大豆蛋白等)按质量体积比计算，加入50-200U/mL反应液的重组天冬氨酸蛋白酶，55℃恒温酶解2-8h，将得到的酶解液升温至85-120℃，灭酶10-60min，然后进行过滤处理，得到滤液；

(2)将滤液进行浓缩处理，干燥后即得到多肽。

步骤(1)中将动物肉类原料去除内脏和油脂，搅碎，高温高压蒸煮1-4h，冷却至40-70℃后再进行酶解。

所述重组天冬氨酸蛋白酶的生产、纯化及其嫩化猪肉和水解动物及植物蛋白制备多肽的应用均属于本发明的保护范围。

实验证明：本发明所述重组菌株能够采用上述发酵罐培养方法分泌表达胞外蛋白酶，发酵至6天时胞外酶活为3400U/mL。本发明提供的重组天冬氨酸蛋白酶能有效嫩化猪肉，降低剪切力，使肉质适口。本发明提供的重组天冬氨酸蛋白酶能够有效水解动物及植物蛋白，制备低分子量多肽。

附图说明

本发明有如下附图：

图1重组菌株在分批补料发酵过程中的发酵历程图。

图2分批补料发酵过程中发酵上清液SDS-PAGE电泳图，泳道 1-9分别为诱导0h、24h、48h、72h、96h、118h、144h、168h、 192h发酵上清液样品。

图3重组天冬氨酸蛋白酶纯化过程中的蛋白电泳图，M：低分子量标准蛋白；1：粗酶液；2：QSFF强阴离子交换层析纯化后的蛋白； 3：S-100凝胶过滤层析纯化后的蛋白；4：EndoH处理后的蛋白；5：蛋白酶酶谱。

图4重组天冬氨酸蛋白酶的最适pH测定曲线图。使用的缓冲液分别为：KCl-HCl(◆),Citrate(△),MES(●),MOPS(×),Tris-HCl(○),CHES(■)。

图5重组天冬氨酸蛋白酶的pH稳定性测定曲线图。使用的缓冲液分别为：KCl-HCl(◆),Citrate(△),MES(●),MOPS(×),Tris-HCl(○),CHES (■)。

图6重组天冬氨酸蛋白酶的最适温度测定曲线图。

图7重组天冬氨酸蛋白酶温度稳定性测定曲线图。

图8高效凝胶过滤色谱(HPSEC)测定兔肉水解产物多肽分子量分布图。

图9高效凝胶过滤色谱(HPSEC)测定阿胶水解产物多肽分子量分布图。

图10高效凝胶过滤色谱(HPSEC)测定大豆蛋白水解产物多肽分子量分布图。

具体实施方式

下面结合附图1-10和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

主要原料和试剂：

酵母粉、胰蛋白胨，购自英国Oxoid公司；其它试剂如无特殊说明均为分析纯。

种子培养基YPD：胰蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。

实施例1：重组菌株的构建和鉴定

提取米黑根毛霉RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计引物，通过PCR方法获得RmproA基因，将其克隆至表达载体 pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-RmproA，转化Pichiapastoris GS115，经筛选鉴定获得重组菌株。巴斯德毕赤酵母的转化采用电转化法，涂布MD平板，培养3-4天后挑取单克隆进行下一步筛选。

引物如下：

上游：CCGGAATTCCTCCCTGTCACTAATGTTTCCCAG

下游：GCGGCCGCTTACATGTTAAGAGCTGCCGCGGAC

实验结果：经与蛋白序列比对，蛋白酶与已报道的来源于米黑根毛霉的毛霉凝乳酶(Mucorpepsin，P00799.1)(Yang J.,Teplyakov A., &Quail J.W.Crystal structureof the aspartic proteinase from Rhizomucor miehei at resolution.Journal of Molecular Biology, 1997,268:449-459)同源性最高，仅为45％，其次为来源于微小毛霉 (Mucor pusillus)的凝乳酶(rennin,AAB24375.1)(43％)(Aikawa J., Nishiyama M.,&Beppu T.Protein engineering of the milk-clottingaspartic proteinases.Scandinavian Journal of Clinical and LaboratoryInvestigation Supplementum,2011,210:51-58)。因此该蛋白酶具有新颖性。蛋白酶基因全长1326bp，编码441个氨基酸，含有N端信号肽和两个糖基化位点。

实施例2：5L发酵罐发酵培养重组天冬氨酸蛋白酶

从固体培养基平板上挑取单菌落接种于YPD培养基(500mL三角瓶中装液量50mL)中30℃、220rpm培养24h作为种子液，然后以10％接种量接种于包含1.5L分批发酵培养基(CaSO₄ 0.93g， K₂SO₄ 18.2g，MgSO₄·7H₂O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，85％磷酸26.7mL，PTM₁ 4.35mL/L)的5L发酵罐中，初始搅拌转速为600 rpm，通气量为1.0vvm，25％氨水调节pH 5.0，培养温度30℃，当甘油耗尽溶氧反弹时以流加方式补加50％甘油(w/v，含12mL/LPTM₁)，待甘油再次耗尽溶氧反弹时，饥饿培养1h，流加诱导培养基(100％甲醇含12mL/LPTM₁)，搅拌转速提高至800rpm，诱导蛋白酶表达。诱导培养基采用分段流加方式：0-8h流速3.6mL/h/L，>8 h流速10.9mL/h/L。每隔12h取样一次，测定酶活力、蛋白含量等参数。

蛋白酶活力测定采用GB/T 23527-2009。具体方法如下：1mL酶液与1mL酪蛋白溶液在40℃条件下保温10min后，加入2mL三氯乙酸终止反应，12000rpm离心3min，取1mL上清液加入5mL Na₂CO₃和1mL Folin试剂，40℃保温20min，于660nm处测定吸光值。以先加入三氯乙酸终止反应的酶液作为对照。

酶活力的单位定义为：在上述条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量(U)。

采用Lowry法测定蛋白含量。描述Lowry法测定蛋白含量的参考文献：Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.and Randall,R.J. Protein measurement with the folinphenol reagent.Biol.Chem.,1951, 193:265-275.

SDS-PAGE凝胶电泳参照Laemmli实验方法进行(Laemmli U.K. Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of bacteriophageT4.Nature,1970,227:680-685)。具体方法如下：配制 12.5％分离胶和4.5％浓缩胶，样品与处理液混合后煮沸5min，冷却后上样，10mA恒流电泳，待指示剂至胶底时结束电泳。用考马斯亮蓝R-250染色显示蛋白带，甲醇、乙酸洗脱背景色。

实验结果：经5L发酵罐高密度发酵后，重组菌株在156h时最高产蛋白酶活力为3400U/mL，蛋白含量为6.42mg/mL(重组菌株高密度发酵历程见图1)。SDS-PAGE分析重组菌株在分批补料发酵过程中上清液蛋白情况(图2)，其主要蛋白条带约为52kDa，比预测蛋白分子量(45.8kDa)明显较高，可能发生了糖基化作用。

实施例3：重组天冬氨酸蛋白酶的纯化与酶学性质

一、重组天冬氨酸蛋白酶的纯化

1、发酵罐培养重组天冬氨酸蛋白酶

同实施例2的步骤。发酵液10000×g冷冻离心10min，取上清液(粗酶液)。

2、离子交换层析

(1)将步骤1得到上清液进行QSFF强阴离子交换层析，流速为0.1mL/min，用0-500mM NaCl水溶液线性梯度洗脱10个柱体积，收集具有蛋白酶酶活组分。酶活力测定条件同实施例2。

(2)将步骤(1)过柱收集的溶液进行超滤处理(滤膜选择可截留分子量在10kDa以上的蛋白质)，收集蛋白大分子，然后将蛋白大分子溶于20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中。

3、凝胶过滤层析

将步骤2中(2)收集的溶液进行S-100凝胶过滤层析，流速为 0.33mL/min，首先用含有100mM NaCl的20mM pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液平衡凝胶柱，然后上样，再用相同的缓冲液进行分离，收集具有蛋白酶酶活组分。酶活力测定条件同实施例2。

实验结果：重组天冬氨酸蛋白酶纯化过程中的SDS-PAGE电泳及酶谱图见图3。经QSFF强阴离子交换层析和S-100凝胶过滤层析纯化得到电泳纯蛋白酶，采用SDS-PAGE和S-100测定蛋白分子量分别为52.4kDa和50.6kDa，经Endo H处理后，蛋白分子量为46.4kDa。该蛋白发生了糖基化作用。

二、重组天冬氨酸蛋白酶的酶学性质

以下所述缓冲液如下：KCl-HCl缓冲液、柠檬酸缓冲液、MES 缓冲液、MOPS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、CHES缓冲液。

1、重组天冬氨酸蛋白酶最适pH和pH稳定性的测定

将重组天冬氨酸蛋白酶的稀释液(分别采用不同缓冲液进行稀释)进行蛋白酶酶活测定，得到重组天冬氨酸蛋白酶的最适pH。酶活测定条件同实施例2。

将重组天冬氨酸蛋白酶液用不同pH值的各种不同缓冲液稀释，50℃水浴锅中处理30min，迅速置于冰水中冷却30min，然后进行蛋白酶酶活测定，得到重组天冬氨酸蛋白酶的pH稳定性。酶活测定条件同实施例2。

实验结果：以酶活力最高点作为100％，计算采用其他缓冲液时蛋白酶的相对酶活，重组天冬氨酸蛋白酶的最适pH为5.5(MES缓冲液)(图4)。将采用50mM pH 5.5的MES缓冲液且没有进行水浴和冷却处理时的酶活作为100％，计算各种不同缓冲液处理后蛋白酶的相对酶活，重组天冬氨酸蛋白酶在pH 5.0-8.0之间的缓冲液中处理30min后，残余酶活力能保持在80％以上(图5)。

2、重组天冬氨酸蛋白酶最适反应温度和温度稳定性的测定

将重组天冬氨酸蛋白酶液的稀释液(用50mM pH 5.5的MES缓冲液进行稀释)进行蛋白酶酶活测定，反应温度为30-75℃，得到重组天冬氨酸蛋白酶的最适温度。酶活测定条件同实施例2。

将重组天冬氨酸蛋白酶的稀释液(用50mM pH 5.5的MES缓冲液进行稀释)在不同温度下(30-65℃)孵育30min，迅速置于冰水中冷却30min，然后进行蛋白酶酶活测定，得到重组天冬氨酸蛋白酶的温度稳定性。酶活测定条件同实施例2。

3、蛋白酶抑制剂对重组天冬氨酸蛋白酶活力的影响及其底物特异性

蛋白酶抑制剂对蛋白酶活力的影响：分别以一定浓度的抑胃肽 (Pepstatin A)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和碘乙酰胺(Iodoacetamide)处理酶液，40℃恒温水浴锅中保温处理 30min，处理后迅速将样品放置于冰水浴中冷却30min，然后在最适条件下测定残余酶活。以未经处理的酶液作为对照，测定蛋白酶活力，计算残余酶活力占空白对照酶活力的百分含量。

底物特异性：分别以1％的酪蛋白、脱脂乳、偶氮酪蛋白、牛血清蛋白、血红蛋白、大豆分离蛋白、明胶、卵清蛋白、人血清白蛋白、肌红蛋白、鱼精蛋白和胶原蛋白等为底物，按照标准方法测定酶活力。以酪蛋白为底物时的蛋白酶活为100％，分别计算蛋白酶对各种底物的比酶活和相对酶活。

实验结果：以酶活力最高点作为100％，计算其他温度下重组天冬氨酸蛋白酶的相对酶活，重组天冬氨酸蛋白酶的最适温度为55℃ (图6)。将没有进行孵育和冷却处理的重组天冬氨酸蛋白酶的酶活作为100％，计算其他温度处理后重组天冬氨酸蛋白酶的相对酶活，该酶具有较好的温度稳定性，在45℃下处理30min后酶活力基本没有变化，50℃下处理30min后酶活力仍能保持80％以上(图7)。重组蛋白酶活力受到天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A的强烈抑制(表 1)，其他类型蛋白酶抑制剂对酶活力无太大影响。重组天冬氨酸蛋白酶具有较广泛的底物特异性，对酪蛋白表现出最强的水解能力(表2)。

表1蛋白酶抑制剂对重组天冬氨酸蛋白酶活力的影响

表2重组天冬氨酸蛋白酶的底物特异性

实施例4：重组天冬氨酸蛋白酶对猪肉的嫩化

1、嫩化条件：将猪肉剔除可见的结缔组织及脂肪，切成方块，用一定浓度的酶液进行注射嫩化处理，于4℃放置48h。以未进行嫩化处理的猪肉作为对照。

2、剪切力测定：将处理好的肉沿垂直于肌纤维方向切割成2.5cm 厚的肉块，放于蒸煮袋中，尽量排出袋内空气，将袋口扎紧，在80℃水浴锅中加热，当肉的中心温度达到75℃时，取出冷却至常温后取样。顺着肌纤维方向切取截面积为1cm²的肉柱，然后在质构仪上测其剪切力值。剪切力测定参数：探头，TA3/100；测试模式与选择， TPA；测试前速度，2.0mm/s；测试速度，2.0mm/s；测试后速度， 2.0mm/s；压缩距离，20mm；测试时间，10.0s。

实验结果如表3所示。实验证明：添加0.25mg/100g和0.5 mg/100g肉重的重组天冬氨酸蛋白酶能够明显降低剪切力，并随着浓度的增加，剪切力越低，表现出对猪肉的嫩化效果。

表3重组天冬氨酸蛋白酶对猪肉的嫩化

实施例5：重组天冬氨酸蛋白酶水解蛋白制备多肽

1、蛋白酶水解制备多肽：兔肉经切碎处理后，高温高压蒸煮2h，加入重组天冬氨酸蛋白酶酶解6h，酶解条件：55℃，pH 7.0。酶解后煮沸灭酶，离心除渣，取上清液冷冻干燥即得肽粉。动物蛋白(阿胶)和植物蛋白(大豆蛋白)用50mM pH 5.5的MES缓冲液按照 5％比例配制，分别加入100U/mL反应液的重组天冬氨酸蛋白酶在 55℃条件下酶解4h。酶解后煮沸灭酶，离心除渣，取上清液冷冻干燥即得肽粉。

2、水解产物多肽得率测定方法：采用OPA法(Wang D.,Wang L., Zhu F.,et al.Invitro and in vivo studies on the antioxidant activities of theaqueousextracts of Douchi(a traditional Chineses salt-femented soybean food).FoodChemistry,2008,107:1421-1428)。25μL样品与1 mL OPA试剂混合物(25mL 100mM的四硼酸钠溶液、10mL 5％的 SDS溶液、1mL 40mg/mL的邻苯二甲醛溶液、100μLβ-巯基乙醇和13.9mL的水)，并在室温下保持8min，在340nm处测定吸光值。以Gly-Leu二肽作为标准品绘制标准曲线，计算多肽含量。通过OPA 法测定的多肽含量除以水解液中的蛋白含量即为多肽得率。

3、多肽分子量高效凝胶过滤色谱(HPSEC)检测条件：TSKgel 硅胶凝胶柱TSK-GELG2000SWXL，7.8×300mm，柱体积14.33mL。流动相：含0.1％三氟乙酸的45％乙腈水溶液。流速：0.5mL/min。检测器：紫外检测器，214nm。柱温：40℃。进样量：25μL。

实验证明：采用100U/g肉重的重组天冬氨酸蛋白酶水解兔肉，采用100U/mL反应液的重组天冬氨酸蛋白酶水解阿胶和大豆蛋白制备多肽，水解产物多肽得率可大于10％(表4)；经HPSEC测定水解产物分子量分布情况，相对分子质量小于1000Da的多肽含量可大于90％(HPSEC测定兔肉、阿胶和大豆蛋白多肽分子量分布图分别见图8、9、10)。

表4重组天冬氨酸蛋白酶水解蛋白产物分析

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

<110> 中国农业大学

<120> 一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 441

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）

<400> 1

Met Lys Val Ser Leu Phe Ser Ile Ala Ser Leu Leu Ile Ala Ser Ala

1 5 10 15

Ala Leu Ser Ser Thr Leu Pro Val Thr Asn Val Ser Gln Ser Ser Lys

20 25 30

Val Leu Ser Leu Pro Leu Ile Ala Gln Lys Arg Ser Ile Ala Ser His

35 40 45

Pro Arg Phe Gly Arg Arg Ser Leu Asn Gln Asp Leu Ile Asn Ser Ala

50 55 60

Pro Glu Ser Ala Asp Gly Pro Ile Ile Tyr Thr Pro Gly Leu Tyr Asp

65 70 75 80

Tyr Ile Ala Phe Ser Val Pro Val Ser Ile Gly Thr Pro Pro Arg Asp

85 90 95

Phe Val Leu Ile Phe Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val Pro Gly

100 105 110

Asn Asp Cys Ser Ala Leu Asp Gly Cys Pro Gly Thr Ala Ile Tyr Asp

115 120 125

Lys Asn Ala Ser Ser Thr Trp Ser Pro Ser Glu Tyr Lys Phe Asn Ile

130 135 140

Thr Tyr Ile Lys Gly Gly Ala Val Gly His Tyr Gly Thr Glu Thr Ile

145 150 155 160

Lys Leu Ala Gly Ala Gln Leu Glu Lys Gln Val Phe Ala Tyr Val Asp

165 170 175

Gln Val Ser Gly Pro Thr Ala Asn Gln Ser Ala Asp Thr Leu Val Phe

180 185 190

Glu Asp Gly Leu Ile Gly Ala Ser Tyr Pro His Ser Thr Gln Met Tyr

195 200 205

Phe Asp Tyr Gly Val Thr Tyr Leu Pro Phe His Glu Ala Leu Tyr Ala

210 215 220

Gln Lys Val Ile Ser Asp Pro Leu Phe Thr Val Phe Met Ser Ala Asn

225 230 235 240

Ser Gly Gln Gly Glu Val Val Tyr Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Leu

245 250 255

Gly Ser Asp Phe Val Tyr Thr Asn Val Ile Gln Gly Tyr Asp Pro His

260 265 270

Asn Lys Glu Gln Thr Thr Tyr Ile Gly Trp Phe Ala Pro Val Thr Gln

275 280 285

Ile Val Leu Asn Arg Phe Thr Asp Ser Pro Thr Gln Ile Thr Phe Glu

290 295 300

Asn Tyr Lys Gly Met Leu Val Asp Thr Gly Thr Thr Asn Ile Ile Leu

305 310 315 320

Pro Arg Val Glu Val Ala Lys Ile Val Glu Ala Val Val Pro Asp Ala

325 330 335

Gln Leu Thr Ser Tyr Gly Trp Tyr Ser Val Ala Cys Ser Lys Tyr Ser

340 345 350

Thr Ser Thr Asn Thr Val Gly Phe Asp Ile Ile Lys Ser Gly Ala Thr

355 360 365

Ser Asp Gln Thr Ile His Ile Ser Val Gly Val Lys Asp Leu Ile Leu

370 375 380

Pro Val Asp Tyr Asp Gln Asp Gln Cys Met Phe Gly Val Val Pro Asp

385 390 395 400

Gln Ser Glu Ser Gln Arg Asn Tyr Leu Ile Gly Asn Ile Phe Leu Arg

405 410 415

His Phe Val Thr Leu Phe His Phe Gly Asp Asn Arg Ile Gly Phe Ala

420 425 430

Pro Leu Ser Ala Ala Ala Leu Asn Met

435 440

<210> 2

<211> 1326

<212> DNA

<213> 米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）

<400> 2

atgaaggttt ctttgttctc tattgcttct ctgctgattg cttcagcagc cctgtcatct 60

accctccctg tcactaatgt ttcccagtcc agcaaggtct tgtcgcttcc tttgattgct 120

cagaaacgat caattgcttc acacccgcgt tttggtcgcc gttctctcaa ccaagacctg 180

atcaactctg caccggaatc tgcagacgga ccaatcattt ataccccagg cctctatgat 240

tacattgcat tttctgtacc tgtttctatc ggcactcctc cgagggattt cgttctcatt 300

tttgatactg gaagcgctga tctctgggtt cctggtaacg actgcagcgc tctagacggt 360

tgccccggca cagctatcta cgacaagaac gcttcaagca cctggtctcc gtcagaatac 420

aaatttaaca tcacatacat caagggcggt gccgttggcc attatggcac agaaaccatc 480

aagctcgctg gtgctcagct tgaaaagcaa gtatttgcgt atgttgatca agtatctgga 540

cctacagcca accaaagtgc ggatactctt gtatttgaag atggtctcat tggcgcatcc 600

tacccacatt cgacgcaaat gtattttgac tatggcgtaa cctacttgcc cttccacgaa 660

gcactttacg cgcaaaaagt aatttcggat cctctcttta ctgtctttat gagtgcgaac 720

tctggtcagg gggaagttgt ctacggcggt gtcaacacaa cgttgcttgg cagtgatttt 780

gtttacacga atgtgatcca aggctatgat ccacacaaca aggagcaaac cacgtacatt 840

ggctggtttg cacccgttac tcaaatcgtc ctcaaccgtt tcaccgatag tccgacccag 900

atcacattcg aaaactataa agggatgctg gtcgatactg gtaccaccaa catcatcttg 960

cctcgcgttg aagttgccaa aattgttgaa gcggttgtgc ccgatgctca gttaacttca 1020

tacggctggt actctgttgc ctgctcgaaa tactcaacat ccacaaatac cgtcggtttt 1080

gatattatca agtccggtgc tactagcgat caaactattc acatcagcgt gggtgtcaag 1140

gacttgattc ttccagtcga ttatgatcaa gatcagtgca tgtttggtgt tgtgcctgat 1200

caatccgagt cgcaaaggaa ctatcttatt ggtaacatct tcttgcgcca ttttgtgaca 1260

ctattccact ttggcgacaa taggatcggt ttcgcgcctt tgtccgcggc agctcttaac 1320

atgtaa 1326

Claims

1.一种重组天冬氨酸蛋白酶，其特征在于：所述重组天冬氨酸蛋白酶是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.如权利要求2所述蛋白质的编码基因，其特征在于：所述编码基因是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒由权利要求2所述的编码基因连接至巴斯德毕赤酵母GS115表达载体pPIC9K构建而成。

5.一种重组菌株，其特征在于：所述重组菌株是将权利要求4所述的重组质粒转入巴斯德毕赤酵母中获得的。

6.一种制备重组天冬氨酸蛋白酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)种子液培养：将重组菌株接种于YPD培养基中，在30℃、220rpm条件下培养24h，得到种子液；

2)分批发酵培养：将步骤1)的种子液以10％接种量接种于5L发酵罐中的分批发酵培养基中进行培养，分批发酵培养基的装液量为20-30％，搅拌转速为500-600rpm，通气量为1.0-2.0vvm，用25％氨水调节pH，控制pH 4.0-6.0，培养温度为28-30℃；

4)甲醇诱导培养：将搅拌转速升高至800-900rpm，诱导培养基采用分段流加方式：0-8h时流速为3.6mL/h/L，>8h时流速为10.9mL/h/L，诱导重组天冬氨酸蛋白酶表达，得到发酵液；

5)离心和纯化：将所述发酵液依次进行离心和纯化。

7.如权利要求6所述制备重组天冬氨酸蛋白酶的方法，其特征在于：所述分批发酵培养基包括：CaSO₄ 0.93g，K₂SO₄ 18.2g，MgSO₄·7H₂O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，85％磷酸26.7mL，PTM₁ 4.35mL/L；步骤3)中补加的甘油中含12mL/L PTM₁，所述诱导培养基是含有12mL/L PTM₁的100％甲醇诱导培养基。

8.如权利要求6所述的制备重组天冬氨酸蛋白酶的方法，其特征在于：所述离心和纯化包括以下步骤：

(1)将发酵液在10000×g条件下冷冻离心10min，取上清液，所述上清液为含有重组天冬氨酸蛋白酶的溶液；

(2)将步骤(1)中含有重组天冬氨酸蛋白酶的溶液依次进行QSFF强阴离子交换层析和S-100凝胶过滤层析，得到纯化后的重组天冬氨酸蛋白酶。

9.权利要求1所述重组天冬氨酸蛋白酶在嫩化猪肉和水解动物及植物蛋白制备多肽的应用。