CN113322195A - 一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用，通过PCR获得来自真菌Aspergillus fumigatusAf293的天冬氨酸蛋白酶基因Af293，并将Af293构建到pPIC9γ质粒上，得到重组质粒Pic9γ‑Af293，并转化到毕赤酵母GS115，获得重组基因工程菌。利用该基因工程菌表达的重组天冬氨酸蛋白酶在pH 4.0‑5.0和温度45‑55℃时稳定，比活为8408.9±305.6 U/mg。在水解蚕蛹蛋白应用中，重组天冬氨酸蛋白酶显示出优异水解潜能，在水解6小时后，水解度提高了50±6.1％，溶解度提高了80％，重组天冬氨酸蛋白酶的稳定特性和水解性能增强了其在工业应用中的潜在能力，特别是在食品和饲料工业中。

Description

一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用。
背景技术
天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)是一类重要的蛋白水解酶，其特征在于其活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成(Coates L et al.2001.Biochemistry,40(44):13149-13157.)。大多数天冬氨酸蛋白在酸性pH条件下具有活性，又被称为酸性蛋白酶。基于它们特殊的催化性能，在制药，食品饮料以及饲料工业具有重要的应用价值。
天冬氨酸蛋白酶的主要来源是微生物，已报道的产天冬氨酸蛋白酶的菌株主要有曲霉属的黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、青霉、根霉等以及它们的变异株、突变株等。商品化的酸性蛋白酶生产菌主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉等为数不多的菌株。专利CN111593036A公布了一种黑曲霉来源的酸性蛋白酶制剂，其酶活可达120U/mg，专利CN107338234B公布了一种米黑根毛霉来源的酸性蛋白酶，其最高产蛋白酶活力为529U/mg。
综上所述，目前产天冬氨酸蛋白酶的菌株多为通过自然诱变结合大规模筛选得到的，其表达量较少，效率较低，且真菌的表面粘附特性导致了大规模生产和培养中的极大困难，这限制了天冬氨酸蛋白酶的生产，因此需要新表达系统。而重组技术，例如异源表达的克隆，具有克服这一障碍的潜力(Yegin S et al.2012.Food Chem,133(4):1312-1319.)。专利CN109679940A公布了一种天冬氨酸蛋白酶异源表达的方法，其酶活达2086.7U/mg，远高于同类报道的酸性蛋白酶酶活。近年来，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经最大化了酸性蛋白酶的基因的异源表达系统敏感性并实现了广泛利用，被认为是优异的表达系统(Yue X et al.2019,35(3):415-424.)。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用，所述天冬氨酸蛋白酶来自一真菌Aspergillus fumigatus Af293，将天冬氨酸蛋白酶编码基因Af293克隆并构建重组表达载体后，在毕赤酵母GS115中进行表达，获得毕赤酵母工程菌株。
技术方案：一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌，所述工程菌包含SEQ ID NO.1所示天冬氨酸蛋白酶编码基因。
一种重组载体，在表达载体PIC9γ中插入SEQ ID NO.1所示的基因所得。
一种重组菌株，在宿主细胞毕赤酵母GS115中表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酶。
上述工程菌在生产重组天冬氨酸蛋白酶的应用，步骤如下：1)采用PCR的方法扩增高比活天冬氨酸蛋白酶序列片段；2)以pPIC9γ为表达载体，以毕赤酵母GS115为宿主细胞，表达SEQ ID NO.1所示天冬氨酸蛋白酶编码基因的菌株为生产菌株；3)将菌株接种于BMGY培养基中，30℃，220r/min培养至OD600为10，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，并在30℃，220r/min条件下继续培养48h即得天冬氨酸蛋白酶；4)回收并纯化所表达的高比活天冬氨酸蛋白酶。
上述方法制得的天冬氨酸蛋白酶。
上述天冬氨酸蛋白酶在蚕蛹蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白、酪蛋白钠盐蛋白水解中的应用。
上述应用的条件为：酶活pH作用范围pH 2～10，酶活温度范围为30～80℃，其酶活作用不依赖于金属离子。
有益效果：本发明提供一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的基因工程菌，所述基因工程菌表达的重组天冬氨酸蛋白酶在pH 4.0-5.0和温度45-55℃时稳定，比活为8408.9±305.6U/mg。在水解蚕蛹蛋白应用中，重组天冬氨酸蛋白酶显示出优异水解潜能，在水解6小时后，水解度提高了50±6.1％，溶解度提高了80％。
附图说明：
图1为重组天冬氨酸蛋白酶的最适pH要求情况；
图2为重组天冬氨酸蛋白酶的pH稳定性情况；
图3为重组天冬氨酸蛋白酶的最适温度要求情况；
图4为重组天冬氨酸蛋白酶在不同温度下的热稳定性情况；
图5为重组天冬氨酸蛋白酶在不同温度下的半衰期情况；
图6为重组天冬氨酸蛋白酶的底物特异性情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
1、菌株及载体：丝状真菌Aspergillus fumigatus Af293购自国家菌种保藏中心，表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r从Invitrogen公司购买；
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，酪蛋白购自Sigma公司，家蚕蛹是在中国农业科学院蚕业研究所采集的，其它都为国产分析纯试剂(均从国药集团购买)；
3、培养基：
(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0；
(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
(3)MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin；
(4)MM固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇；
(5)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1.34％YNB，0.00004％Biotin；
(6)BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)
实施例1天冬氨酸蛋白酶编码基因的克隆
以来源于Aspergillus fumigatus Af293的Af293为母本，采用PCR的方法扩增天冬氨酸蛋白酶编码基因SEQ ID NO.1，克隆方法参考文献(You，et al.,2018)。
实施例2天冬氨酸蛋白酶的制备
将表达载体pPIC9γ进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码天冬氨酸蛋白酶的基因双酶切(EcoR I+Not I)，再将酶切后编码成熟高比活木聚糖酶突变体的基因片段与表达载体pPIC9γ连接，获得含有高比活木聚糖酶突变体基因的重组质粒并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000×g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活检测。
实施例3重组天冬氨酸蛋白酶的活性分析
酪蛋白法：具体方法如下：使用酪蛋白作为底物测定AF293的蛋白酶活性。在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系由500μL 1％酪蛋白和500μL酶溶液组成，孵育10分钟。加入1mL的10％三氯乙酸(TCA)以终止反应，以12,000×g离心5分钟，然后将上清液(500μL)添加到由2.5mL的0.4M Na2CO3组成的试管中，最后加入Folin和Ciocalteu试剂(500μL)。将混合物在40℃下进一步温育20分钟，并在680nm下测量吸光度。
实施例4重组天冬氨酸蛋白酶的最适pH测定方法如下:
将实施例2纯化的重组高比活天冬氨酸蛋白酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物酪蛋白在不同pH的50mM甘氨酸-HCl缓冲液中37℃下进行蛋白酶活力测定。结果如图1表明，重组天冬氨酸蛋白酶的最适pH为4。
实施例5重组天冬氨酸蛋白酶的最适温度测定方法如下：
重组天冬氨酸蛋白酶的最适温度的测定为在50mM甘氨酸-HCl(pH 3.4)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果如图3表明,重组高比活天冬氨酸蛋白酶的最适温度为50℃。
实施例6重组天冬氨酸蛋白酶的热稳定性测定如下：
检测方法参考文献(You et al,2019)，重组高比活天冬氨酸蛋白酶此外在45–55℃之间达到了极高的稳定性，在孵育1h时保留了几乎所有活性(80％)(图4)。在60℃时半衰期为35min(图5)，T50值为65℃(表1)。
实施例7重组天冬氨酸蛋白酶的动力学参数测定方法如下:
检测方法参照文献(You et al,2019)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为30min。用不同浓度(0.75-10mg/mL)的酪蛋白为底物，在最适条件(温度、pH)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraFit7软件计算Km值及Vmax。以酪蛋白为底物时，重组高比活天冬氨酸蛋白酶在最适条件下的Km值为2.0mg/mL、催化效率(kcat/Km)为285.9mL/s/mg(表2)。
实施例8重组天冬氨酸蛋白酶的底物特异性测定如下：
使用酪蛋白，牛血清白蛋白，酪蛋白钠盐和蚕蛹粉在50mM赖氨酸HCl(pH 3.4)中于37℃孵育1h，测定不同底物对酶活性的影响。对牛血清白蛋白(BSA)的比活为1477±99.1U/mg，其次是蚕蛹蛋白1354.3±85.1U/mg；酪蛋白1177±103U/mg和酪蛋白钠盐1051.6±60.7U/mg(图6)。
实施例9重组天冬氨酸蛋白酶的水解应用测定如下：
使用蚕蛹蛋白与重组天冬氨酸蛋白酶在50mM甘氨酸-HCl(pH 3.4)缓冲液体系中于37℃孵育2h，测定酶活性。对蚕蛹蛋白(SPP)的水解度为14.3±1.2％。
实施例10重组天冬氨酸蛋白酶的水解应用测定如下：
使用蚕蛹蛋白与重组天冬氨酸蛋白酶在50mM甘氨酸-HCl(pH 4)缓冲液体系中于50℃孵育6h，测定酶活性。对蚕蛹蛋白(SPP)的水解度为50.6±4.4％。
实施例11重组天冬氨酸蛋白酶的水解应用测定如下：
使用蚕蛹蛋白与重组天冬氨酸蛋白酶在50mM甘氨酸-HCl(pH 5)缓冲液体系中于50℃孵育8h，测定酶活性。对蚕蛹蛋白(SPP)的水解度为46.9±4.1％。
本发明在毕赤酵母GS115宿主细胞中表达了烟曲霉AF293的天冬氨酸蛋白酶基因，并表征了其在不同参数下的活性，在酸性环境下具有8408.9±305.6U/mg的高酶活力。并成功评估了重组天冬氨酸蛋白酶在蚕蛹中的水解潜力。蚕蛹蛋白降解实验显示，其对蚕蛹蛋白的水解效果显著(表1)，符合多种工业需要，尤其是在食品，饲料等工业领域中具有很好的应用潜力。
表1重组天冬氨酸蛋白酶Af293与其他商业酶或微生物来源酶水解蛋白的水解度比较
Figure BDA0003101034040000061
表2重组天冬氨酸蛋白酶Af293的动力学分析
Figure BDA0003101034040000062
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgattctcgc cggtcacaga ccccatagat acggccaggc cggcctcaaa gaccaaaaac 60
cgcgtgcata ttcatctatg cctgaggggc gaagccgagt ctggggcctt gggagtcgaa 120
gacgacgtac tggctcttga ggaagatatc tccgaagata gaaaagccca aaccagagtt 180
gctctggatg ccgccgtagc aggtagagct gccgtcagtg acgggggcgt agttgatgta 240
ttcaccggga acgacggcat tgtagcctcc gatgacggta gtgaaagaag gaagtttggt 300
ggagcagggg aagacataac caccgtattg gttgctgttc ttggctccgg aaacctggcg 360
gtagtagtcg gcaacaacgc tgtcatcaag caggaggagg gtggtgccgg tgtctaaaag 420
tggatcagct tggtccttct gaagagacac tgtgaaaaca taccagcaat gccgctgata 480
ctgttggagt tgggagcacc attgccaaca ccgtagccat cagcagtgaa catccagaaa 540
ccctgggagc tgtcgacgtc ggtataagtg agttcccctt ggaacttgga gttgtcgatg 600
tatccaaagt cgtaggtgcc tggagcatgg tacttcaagg tcacagcaaa gagaggagag 660
tccaactggg acttgacagt gtcaaagaaa gtagtctgag ggcggggact gactgtaaca 720
atccgagtca gtgggctgag gtggaagctg gtaatcttga ctgaaactca ccagtgttga 780
tggagctgaa tgccaaaccc aacagaccat cgttgtcctt atcctgcacg aattgagagc 840
tgatatggct ggcagcctcc acagcctggc tctgagcagt gacaccaccc acagtgacgg 900
tatccttgta gacgtcaccg ctggcactgc taccatcacc atattggatc ttccaggtgt 960
agccattcag cttttgggca ttagcggacg gcttgtagat agcatggccg ctggactggg 1020
aagccgaaag ctcggaggag aagacccagc tacaacaatt agtgaattca attcaagaaa 1080
gagggacaag atgcgcttac agatctgcag agccagtgtc gaagtccaag ttcagggtcg 1140
ttccaccgac tttgacgggg gtcaggtatt ccgagtcata ttgctcgggg gtagtaacag 1200
cgctgccgga gcttgcagcc gccttgacac tgtcggggac agtgcccccg tacttagtca 1260
aagcattggc atagacagct ggaagattga cggtcttctt gttggtcact ggtctggcca 1320
cttggttgat agtgaagccc ttgcgcggct ggaccacagg gacagcagac acaatggtcg 1380
agagaccgac gacgacagcg gtgactttgc taaagacgac catcttgatg aaacaacgga 1440
ctactggacc gtggaaaagt atcaacgaca aaaaaggaga cgatctcaaa ctcttgctga 1500
acgagaatga ggatgatatt cggtcaacag ctggtgaaca tgcctccttt atatagtt 1558
<210> 2
<211> 375
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Pro Val Val Gln Pro Arg Lys Gly Phe Thr Ile Asn Gln Val Ala
1 5 10 15
Arg Pro Val Thr Asn Lys Lys Thr Val Asn Leu Pro Ala Val Tyr Ala
20 25 30
Asn Ala Leu Thr Lys Tyr Gly Gly Thr Val Pro Asp Ser Val Lys Ala
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Gly Ser Ala Val Thr Thr Pro Glu Gln Tyr Asp Ser
50 55 60
Glu Tyr Leu Thr Pro Val Lys Val Gly Gly Thr Thr Leu Asn Leu Asp
65 70 75 80
Phe Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val Phe Ser Ser Glu Leu Ser
85 90 95
Ala Ser Gln Ser Ser Gly His Ala Ile Tyr Lys Pro Ser Ala Asn Ala
100 105 110
Gln Lys Leu Asn Gly Tyr Thr Trp Lys Ile Gln Tyr Gly Asp Gly Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Gly Asp Val Tyr Lys Asp Thr Val Thr Val Gly Gly Val
130 135 140
Thr Ala Gln Ser Gln Ala Val Glu Ala Ala Ser His Ile Ser Ser Gln
145 150 155 160
Phe Val Gln Asp Lys Asp Asn Asp Gly Leu Leu Gly Leu Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Ile Asn Thr Val Ser Pro Arg Pro Gln Thr Thr Phe Phe Asp Thr
180 185 190
Val Lys Ser Gln Leu Asp Ser Pro Leu Phe Ala Val Thr Leu Lys Tyr
195 200 205
His Ala Pro Gly Thr Tyr Asp Phe Gly Tyr Ile Asp Asn Ser Lys Phe
210 215 220
Gln Gly Glu Leu Thr Tyr Thr Asp Val Asp Ser Ser Gln Gly Phe Trp
225 230 235 240
Met Phe Thr Ala Asp Gly Tyr Gly Val Gly Asn Gly Ala Pro Asn Ser
245 250 255
Asn Ser Ile Ser Gly Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Leu Leu
260 265 270
Asp Asp Ser Val Val Ala Asp Tyr Tyr Arg Gln Val Ser Gly Ala Lys
275 280 285
Asn Ser Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Val Phe Pro Cys Ser Thr Lys Leu
290 295 300
Pro Ser Phe Thr Thr Val Ile Gly Gly Tyr Asn Ala Val Val Pro Gly
305 310 315 320
Glu Tyr Ile Asn Tyr Ala Pro Val Thr Asp Gly Ser Ser Thr Cys Tyr
325 330 335
Gly Gly Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Gly Phe Ser Ile Phe Gly Asp
340 345 350
Ile Phe Leu Lys Ser Gln Tyr Val Val Phe Asp Ser Gln Gly Pro Arg
355 360 365
Leu Gly Phe Ala Pro Gln Ala
370 375

Claims (7)

1.一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌，其特征在于，所述工程菌包含SEQ ID NO.1所示天冬氨酸蛋白酶编码基因。
2.一种重组载体，其特征在于，在表达载体PIC9γ中插入SEQ ID NO.1所示的基因所得。
3.一种重组菌株，其特征在于，在宿主细胞毕赤酵母GS115中表达氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的酶。
4.权利要求1所述工程菌在生产重组天冬氨酸蛋白酶的应用，其特征在于，步骤如下：
1）采用PCR的方法扩增高比活天冬氨酸蛋白酶序列片段；
2）以pPIC9γ为表达载体，以毕赤酵母GS115为宿主细胞，表达SEQ ID NO.1所示天冬氨酸蛋白酶编码基因的菌株为生产菌株；
3）将菌株接种于BMGY培养基中，30 ℃，220 r/min培养至OD600为10，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，并在30℃，220r/min条件下继续培养48 h即得天冬氨酸蛋白酶；
4）回收并纯化所表达的高比活天冬氨酸蛋白酶。
5.权利要求4制得的天冬氨酸蛋白酶。
6.权利要求5所述天冬氨酸蛋白酶在蚕蛹蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白、酪蛋白钠盐蛋白水解中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的条件为：酶活pH作用范围pH 2～10，酶活温度范围为30～80 ℃，其酶活作用不依赖于金属离子。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107338234A (zh) * 2017-05-26 2017-11-10 中国农业大学 一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用
CN109468240A (zh) * 2018-11-15 2019-03-15 江南大学 一种表达天冬酰胺氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方法

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