CN115558655A

CN115558655A - 一种具有凝乳活性的米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶及其制备方法与应用

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Publication number: CN115558655A
Application number: CN202110751899.0A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 王寿南; 闫巧娟; 薛意斌; 杨绍青; 李雪
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2023-01-03

Abstract

本发明公开了一种具有凝乳活性的米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶及其制备方法与应用。构建该天冬氨酸蛋白酶的表达质粒并转化至黑曲霉中异源表达。重组黑曲霉菌株发酵液的蛋白酶活力达2000U/mL，蛋白含量为6.1mg/mL，最适pH为2.5，最适温度为40℃，在45℃以下保持较高酶活力，其底物特异性广泛。该酶具有显著的凝乳作用，凝乳酶活力为3894.1SU/mg，特异性水解κ‑casein的Lys22‑Ile23、Leu33‑Ser34、Leu51‑Ile52、Lys64‑Pro65和Phe105‑Met106肽键。本发明的天冬氨酸蛋白酶在奶酪制作等领域中具有良好的应用价值。

Description

一种具有凝乳活性的米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域中一种具有凝乳活性的米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白酶(Protease)是指可以水解蛋白质中肽键并生成氨基酸或小肽的一大类酶。蛋白酶来源丰富，广泛存在于动植物和微生物中。蛋白酶作为三大工业酶制剂之一，在食品、洗涤、制革、医药等领域有着广泛的应用。天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23.X)是一类在酸性环境中具有最适催化活性的蛋白酶，属于酸性蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶在奶酪制作、调味品生产、活性肽制备、肉类嫩化等方面广泛应用(Abdul Razzaq,Sadia Shamsi,Arfan Ali,etal.Microbial proteases applications.Frontiers in Bioengineering andBiotechnology,2019,7:110)。

部分天冬氨酸蛋白酶具有凝乳活性。其中小牛皱胃来源的凝乳酶是目前在奶酪制作中使用最为广泛的天冬氨酸蛋白酶。在蛋白酶参与的凝乳反应中，蛋白酶水解κ-casein(κ-酪蛋白)中的Phe105-Met106的肽键，产生酪蛋白巨肽(caseinomacropeptide)和副κ-casein。其中副κ-casein蛋白聚集形成三维网状凝胶，然后在钙离子的作用下使酪蛋白胶束发生聚集失稳并形成凝块(Douglas G.Dalgleish,Milena Corredig.The structure ofthe casein micelle of milk and its changes during processing.Annual Review ofFood Science and Technology,2012,3:449–67)。因此，对κ-casein特异性酶切和高比值的凝乳活性/水解活性(CA/PA)是衡量蛋白酶凝乳特性的重要参数(LouwrensW.Theron.Microbial aspartic proteases:current and potential applications inindustry.Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98:8853-8868)。随着奶酪消费量的增长以及对不同风味奶酪的需求，具有凝乳活性的天冬氨酸蛋白酶越来越受到关注。微生物来源的天冬氨酸蛋白酶种类和性质最为丰富。目前，已发现多种微生物来源的天冬氨酸蛋白酶具有凝乳活性，其中真菌来源的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)和高大毛霉(Mucor mucedo)天然天冬氨酸蛋白酶已应用于商品奶酪的生产中(Ronivaldo Rodrigues da Silva.Exploring microbial peptidases forcheese production:a viewpoint on the current conjecture.Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2018,66:1305-1306)。微生物来源的凝乳酶有个别种类已实现工业应用，但多为天然酶。微生物来源重组凝乳酶的开发相对落后。

利用基因工程高效表达，是发掘新型蛋白酶并进行大规模工业化生产的重要途径。黑曲霉是一种安全性好可进行食品级产品发酵的丝状真菌表达系统。黑曲霉具有优秀的蛋白翻译后加工能力及分泌能力，对蛋白质分子的修饰作用更接近高等真核细胞，生产活性蛋白有很强的优势(Dominik Mojzita,Anssi Rantasalo,Jussi

Geneexpression engineering in fungi.Current Opinion in Biotechnology,2019,59:141-149)。目前有专利报道一种高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株。构建黑曲霉来源酸性蛋白酶的重组黑曲霉工程菌株，经过紫外诱变进一步提高产酶能力，突变菌株在20L发酵罐中产酶水平为17428U/mL(专利号为201810793553.5，申请时间2018.07.18)。而黑曲霉异源表达的重组牛皱胃酶作为广泛使用的商品凝乳酶，目前仍占据着重要的市场地位(S.V.Belenkaya,D.V.Balabova,A.N.Belov,et al.Basic biochemical properties of recombinantchymosins(review).Applied Biochemistry and Microbiology,2020,56:363-372)。

米黑根毛霉是生产蛋白酶和脂肪酶重要的工业菌株，其生产的天冬氨酸蛋白酶应用于凝乳和肉类嫩化中。有专利报道利用米黑毛霉(同米黑根毛霉)生产凝乳酶的方法。使用米黑毛霉ATCC16457生产凝乳酶，其发酵液凝乳酶活力为410IMCU/mL(专利号为201310472404.6，申请日期2013.10.11)。还有专利报道一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用。将一种米黑根毛霉来源的天冬氨酸蛋白酶在毕赤酵母GS115中异源表达，蛋白酶活力为3400U/mL。该酶可用于嫩化猪肉和制备低分子量多肽(专利号为201710383874.3，申请时间2017.05.26)。米黑根毛霉基因组中含有多个蛋白酶基因，其中仅有个别蛋白酶基因被克隆表达和应用研究。利用基因工程技术，挖掘米黑根毛酶新型天冬氨酸蛋白酶并高效表达，可以拓展天冬氨酸蛋白酶种类。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的具有凝乳活性的天冬氨酸蛋白酶。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种蛋白质，为天冬氨酸蛋白酶，来源于米黑根毛霉，名称为RmproB，是如下A1)-A4)中任一的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1第20至439位氨基酸残基的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列表中序列1第1至439位氨基酸残基的蛋白质；

A3)将A1)或A2)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白质；

A4)在A1)-A3)任一的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

其中，序列表中序列1由439个氨基酸残基组成，第1-19位氨基酸残基是信号肽序列。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为表1所示的标签序列中的任一种或多种。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。

与RmproB相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与蛋白质RmproB相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)编码RmproB的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下C1-C5任一所示的编码基因：

C1)编码链的编码序列是序列表中序列2的第58-1320位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

C2)编码链的核苷酸是序列表中序列2的第58-1320位的cDNA分子或DNA分子；

C3)编码链的编码序列是序列表中序列2的第1-1320位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

C4)编码链的核苷酸是序列表中序列2的第1-1320位的cDNA分子或DNA分子；

C5)与C1)-C4)任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质的DNA分子；

C6)在严格条件下与C1)-C4)任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。

其中，序列表中的序列2的第1-1320位由1320个核苷酸组成，编码序列表中的序列1所示的蛋白质。

所述75％以上的同一性可为至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码RmproB的核酸分子的表达盒(RmproB基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达RmproB的DNA，该DNA不但可包括启动RmproB转录的启动子，还可包括终止RmproB转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述生物材料中，所述重组载体可为Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)，Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)是将序列表中序列3的核苷酸片段替换Blunt质粒的NotI识别位点和XhoI识别位点之间的小片段，保持Blunt质粒的其它核苷酸序列不变，得到的RmproB基因重组表达载体。

上述生物材料中，B4)所述重组微生物可为D1)或D2)：

D1)所述重组微生物为将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物可为E1)-E3)中的任一种:

E1)真核微生物；

E2)曲霉属微生物；

E3)黑曲霉(A.niger)，如黑曲霉(A.niger)AT。

D2)所述重组微生物为将所述Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)导入黑曲霉得到的分泌表达氨基酸序列是序列表的序列1的第20至439位的重组蛋白质(名称为RmproB)的重组黑曲霉。

上述生物材料中，B4)至B6)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。

为了解决以上技术问题，本发明提供了制备具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白质的方法。

本发明所提供的制备具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白质的方法，包括：使含有所述蛋白质的编码基因的DNA分子在生物中进行表达，得到具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白质；所述生物为微生物。

上述方法中，所述微生物可为E1)-E3)中的任一种:

E1)真核微生物；

E2)曲霉属微生物；

E3)黑曲霉(A.niger)，如黑曲霉(A.niger)AT。

上述方法中，使含有所述蛋白质的编码基因的DNA分子在生物中进行表达包括将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。

上述方法中，所述受体微生物可为E1)-E3)中的任一种:

E1)真核微生物；

E2)曲霉属

E3)黑曲霉(A.niger)，如黑曲霉(A.niger)AT。

上述方法中，所述重组微生物可为将所述Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)导入黑曲霉得到的分泌表达氨基酸序列是序列表的序列1的第20至439位的重组蛋白质(名称为RmproB)的重组黑曲霉。

上述方法中，在表达后包括收集分泌到胞外的蛋白质(分泌表达的蛋白质)，得到具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白质。

本发明还提供一种凝乳剂。

上述凝乳剂的活性成分含有所述蛋白质和/或生物材料，上述凝乳剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述凝乳剂的其他活性成分本领域技术人员可根据抗菌效果确定。

上述蛋白质、或上述生物材料的下述P1-P3中的任一种应用也属于本发明的保护范围：

P1、所述蛋白质或所述生物材料在制备天冬氨酸蛋白酶中的应用；

P2、所述蛋白质或所述生物材料在制备凝乳剂中的应用；

P3、所述蛋白质或所述生物材料在制备奶酪中的应用。

本发明从米黑根毛霉CAU432中发掘一种新型天冬氨酸蛋白酶基因，将其在黑曲霉中异源表达。该天冬氨酸蛋白酶具有蛋白酶活力和凝乳酶活力。将该酶编码基因在黑曲霉中表达并进行液体发酵，蛋白酶活性达2000U/mL，蛋白含量达6.1mg/mL。该天冬氨酸蛋白酶的最适pH为2.5，在pH 1.5-6.5保持稳定；最适温度为40℃，在45℃以下保持较高酶活力；其底物特异性广泛，对酪蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、牛血清白蛋白和脱脂牛奶表现出较高的水解活性。该酶具有显著的凝乳作用，凝乳酶活力为3894.1SU/mg，可特异性水解κ-酪蛋白的Lys22-Ile23、Leu33-Ser34、Leu51-Ile52、Lys64-Pro65和Phe105-Met106肽键。这些性质使其在食品工业中表现出很大的应用潜力，在奶酪制作中具有应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中强表达双拷贝质粒Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)的质粒图谱。

图2为本发明实施例1中重组天冬氨酸蛋白酶RmproB黑曲霉转化子在5-L发酵罐的产酶历程，其中●为发酵上清液中蛋白酶的酶活；■为发酵上清液中蛋白质含量；▲为菌体湿重。

图3为本发明实施例2中重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的纯化电泳图。图中，泳道M：低分子量标准蛋白；泳道1为黑曲霉空载菌株对照；泳道2为RmproB转化子发酵液；泳道3为Q柱纯化后的酶液；泳道4为纯酶液。

图4为本发明实施例2中重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的最适pH测定曲线图。图中，■为KCl-HCl(pH 1.0-2.0)；●为lactate(pH 2.0-4.0)；▲为citrate(pH 3.5-6.5)；◆为phosphate(pH6.5-8.0)。

图5为本发明实施例2中重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的pH稳定性测定曲线图。图中，■为KCl-HCl(pH 1.0-2.0)；●为lactate(pH 2.0-4.0)；▲为citrate(pH 3.5-6.5)；◆为phosphate(pH6.5-8.0)。

图6为本发明实施例2中重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的最适温度测定曲线图。

图7为本发明实施例2中重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的温度稳定性测定曲线图。

图8为本发明实施例3中重组天冬氨酸蛋白酶RmproB凝乳活性的最适pH和不同pH下凝乳活力与蛋白酶活力比值。图中，

为相对凝乳活力；

为凝乳活力与蛋白酶活力比值。

图9为本发明实施例3中重组天冬氨酸蛋白酶RmproB凝乳活性的最适钙离子浓度。

图10为本发明实施例3中重组天冬氨酸蛋白酶RmproB对不同组分酪蛋白的水解示意图。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：米黑根毛霉

生物材料的拉丁文学名：Rhizomucor miehei

生物材料的菌株编号：CAU432

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101

保藏日期：2011年6月21日

保藏编号：CGMCC No.4967

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。下述实施例中的定量实验，如无特殊说明，均设3次重复。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，参照Anson等(Anson,M.L.The estimation of pepsin,trypsin,papain and cathepsin with hemoglobin.Journal of General Physiology,1938,22:79-89)测定蛋白酶活力：使用50mM乳酸-乳酸钠缓冲液(pH 2.5，溶剂为水)配制底物酪蛋白溶液(浓度为1％)，将100μL酶液与100μL酪蛋白溶液在40℃下保温10min后，加入200μL的0.4M三氯乙酸溶液终止反应，12000rpm离心5min，取100μL上清液加入500μL 0.4M Na₂CO₃溶液和100μL Folin试剂，40℃保温20min，于OD_660nm处测定吸光值。以先加入三氯乙酸终止反应的酶液作为对照。每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量，定义为1个酶活力单位(U)。

下述实施例中，参照Kei等(Kei Arima,Shinjiro Iwasaki,Gakuzo Tamura.Milkclotting enzyme from microorganisms.Agricultural and Biological Chemistry,1967,31:540-545)测定凝乳酶活力：使用50mM pH 4.0的柠檬酸钠缓冲液配制浓度为10％的脱脂奶粉乳液，加入氯化钙至终浓度为10mM，得到脱脂乳液。取5mL脱脂乳液于40℃保温5min，加入0.5mL酶液，立即混匀，开始计时，当乳液中出现絮状沉淀时即为终点。将40min凝固1mL浓度为10％脱脂乳液所需的酶量定义为一个索氏单位Soxhlet unit(SU)。按下式计算凝乳酶活力：

MC(SU/mL)＝2400/t×S/E

式中：MC为凝乳酶活力(SU/mL)；S为脱脂牛奶溶液体积(mL)；E为加酶体积(mL)；t为凝乳时间(s)。

下述实施例中所涉及的培养基和溶液的配方与具体配制方法如下：

1)DPY液体培养基的组成为：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，KH₂PO₄0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，其余为水。DPY液体培养基配制方法可为：葡萄糖2g，胰蛋白胨1g，酵母浸粉0.5g，KH₂PO₄0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，溶解于去离子水中定容至100mL，121℃灭菌20min。

2)CD高渗培养基的组成为：蔗糖34.2％，NaNO₃0.3％，KCl 0.2％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.01％，琼脂2％，pH 5.5，其余为水。CD高渗培养基配制方法可为：蔗糖34.2g，NaNO₃0.3 g，KCl 0.2g，KH₂PO₄0.1 g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂2g，溶解于去离子水中定容至100mL，调节pH值为5.5，121℃灭菌20min。

3)CD高渗软琼脂的组成为：蔗糖34.2％，NaNO₃ 0.3％，KCl 0.2％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.01％，琼脂0.05％，pH 5.5，其余为水。CD高渗软琼脂培养基配制方法可为：蔗糖34.2g，NaNO₃ 0.3g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂0.05g，溶解于去离子水中定容至100mL，调节pH值为5.5，121℃灭菌20min。

4)CD固体培养基的组成为：葡萄糖2％，NaNO₃ 0.3％，KCl 0.2％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.01％，琼脂2％，pH 5.5，其余为水。CD固体培养基配制方法可为：葡萄糖2g，NaNO₃ 0.3g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，FeSO₄·7H₂O0.01g，琼脂2g，溶解于去离子水中定容至100mL，调节pH值为5.5，120℃高压灭菌。

5)发酵培养基的组成为：玉米淀粉水解物10％，玉米浆3％，豆粕粉3％，其余为水。发酵培养基配制方法可为：玉米淀粉水解物100g，玉米浆30g，豆粕粉30g，溶解于去离子水中定容至1L，121℃灭菌20min。

6)酶解液的组成为：溶壁酶1.5％，溶菌酶0.5％，蜗牛酶1.5％，纤维素酶2％，NaCl4.8％，其余为50mM pH 6.0磷酸缓冲液。酶解液配制方法可为：溶壁酶1.5g，溶菌酶0.5g，蜗牛酶1.5g，纤维素酶2g，NaCl 4.8g，溶解于50mM pH 6.0磷酸缓冲液中定容至100mL，121℃灭菌20min。

下述实施例中所涉及的生物材料：

米黑根毛霉CAU432是专利《米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用》(授权公告号CN103045485B)中所提供的米黑根毛霉菌株，已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为米黑根毛霉Rhizomucormiehei，保藏编号为：CGMCC No.4967。

载体Blunt质粒(全称：

Simple Cloning Vector；目录号：CB111-01)为北京全式金生物技术有限公司产品。

黑曲霉宿主(A.niger)AT(货号AS3.4309)为艾礼生物科技(上海)有限公司产品。

酪蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、脱脂奶粉均为Sigma公司产品。

实施例1、天冬氨酸蛋白酶基因的克隆及在黑曲霉中表达

一、重组菌的构建

一种来自米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶RmproB，氨基酸序列如序列表中序列1的第20至439位所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表序列2第58-1320位所示。

设计引物RmproB-F和RmproB-F：

RmproB-F：5′-GCTCTCACCAGAATTCCTATCAAGAAGACA-3′；

RmproB-R：5′-CTAGCTTGCGACAATCTGATGTAGATGAAG-3′。

以米黑根毛霉CAU432的cDNA为模板，以RmproB-F和RmproB-F为引物进行PCR扩增。聚合酶链式反应(PCR)扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次；最后72℃延伸5min。

使用P2A肽将两个RmproB基因(序列表中序列1的第58-1320位所示的DNA分子)串联构建RmproB双拷贝盒。用吉布森组装方法将淀粉酶-糖化酶融合启动子(Pamy/gla，含糖化酶信号肽序列，通过PCR扩增自黑曲霉基因组，核苷酸序列是序列表中序列3的第1-1785位核苷酸；其中，序列表中序列3的第1732-1785位核苷酸是糖化酶信号肽的编码序列，第1-1731位核苷酸是淀粉酶-糖化酶融合启动子)、RmproB双拷贝盒(RmproB-P2A-RmproB，核苷酸序列(CDS)是序列表中序列3的第1786-4374位核苷酸)、糖化酶终止子(Tgla，核苷酸序列是序列表中序列3的第4375-5146位核苷酸)、潮霉素表达盒(HygB，核苷酸序列是序列表中序列3的第5147-8318位核苷酸，其中，序列表中序列3的第6227-7252位核苷酸是潮霉素抗性基因的编码序列，)依次连接到Blunt质粒中，替换NotI识别位点和XhoI识别位点之间的小片段，保持Blunt质粒的其它核苷酸序列不变，得到的RmproB基因重组表达载体，定名为Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)，其质粒图谱见图1。

Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)是将核苷酸序列是序列表中序列3的核苷酸片段替换Blunt质粒的NotI识别位点和XhoI识别位点之间的小片段，保持Blunt质粒的其它核苷酸序列不变，得到的RmproB基因重组表达载体。

将Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)转化至克隆宿主大肠杆菌DH5α，对阳性大肠杆菌转化子进行菌落PCR验证并测序。

从测序结果正确的大肠杆菌中提取重组质粒，使用NotI内切酶对质粒Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)进行单酶切线性化，得到线性化的质粒Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)。400μL酶切体系为：356μL重组质粒Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)，40μL Cutsmartbuffer，2μL NotI，37℃酶切过夜。将线性化的质粒Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)进行醇沉回收。

二、重组天冬氨酸蛋白酶基因在黑曲霉中的表达

黑曲霉原生质体的制备与纯化：利用DPY液体培养基在30℃空气摇床中培养黑曲霉宿主(A.niger)AT 3d。使用布氏漏斗抽滤后，收集菌体制备原生质体。使用酶解液将菌丝裂解成原生质体，并使用STC缓冲液洗涤两次后，备用。

PEG(聚乙二醇)介导的黑曲霉原生质体转化：在160μL黑曲霉原生质体中加入50μg线性化的Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)质粒，再加入60μL PEG，轻弹混匀后冰浴30min，每间隔10min轻弹一次，之后加入1mL的PEG于室温下静置20min。

倾注培养：使用3mL STC缓冲液和6mL CD高渗软琼脂加入至15mL离心管中进行混匀，将上述PEG孵育后的转化组分移至15mL离心管中，并加入终浓度为300μg/mL的HygB，上下颠倒混匀后倒入CD高渗培养基制的板，均匀分布后于30℃培养5d。

转化子鉴定：对高渗平板中生长出来的单菌落在CD固体培养基上经两次传代培养后提取转化子基因组，设计验证引物YZ-Pgla-F和YZ-PgpdA-R进行扩增并测序验证。

YZ-Pgla-F：5′-GTTGATGCATGTGCTTCTTCCTTCAG-3′；

YZ-Tgla-R：5′-TTGGACAAATGAACGTATCTTATCGAGATCCT-3′。

将基因型正确的转化子即为重组天冬氨酸蛋白酶RmproB黑曲霉，对其进行摇瓶发酵培养，恒温摇床于30℃和200rpm条件下培养120h后，取离心后的发酵上清液检测蛋白酶活力。

三、重组黑曲霉的液体发酵

种子培养：将步骤二获得的重组天冬氨酸蛋白酶RmproB黑曲霉接种到装有100mLDPY液体培养基的500mL三角瓶中，在30℃、200rpm振荡培养72h，获得含量大量菌球的种子液。

菌丝成长阶段：将种子液接种到5L发酵罐中(装有3L发酵培养基)。发酵过程中温度为30℃，用氨水和磷酸调节pH至6.0，搅拌转速为300rpm。随着菌丝体的生长，溶解氧(DO)不断下降。当发酵培养基中的淀粉水解物完全消耗时(约60-72h)，开始进行补料。

补料发酵阶段：温度为30℃，pH保持6.0。以50％玉米淀粉水解物溶液(50g/100mL)进行补料，补料流加速度为5mL/h/L。通过控制空气流量和搅拌速度，使DO保持在5％以上，直至发酵结束。在整个发酵过程中，对菌体湿重、发酵液蛋白含量和蛋白酶活性进行监测。

发酵过程见图2，●为发酵上清液(发酵结束后发酵液在10000×g条件下离心10min所得的上清液)中蛋白酶的酶活；■为发酵上清液中蛋白质含量；▲为菌体湿重。发酵上清液的酶活在第7天达到最高2000U/mL，蛋白含量达6.1mg/mL。菌体湿重在第五天达到最高，为516.5g/L。

实施例2、重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的纯化及酶学性质

一、重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的纯化

在实施例1发酵结束后将发酵液在10000×g条件下离心10min获得上清液。取20mL上清液，在20mM pH 6.0的磷酸缓冲液中透析，随后上样于用20mM pH 6.0磷酸缓冲液平衡的Q-Sepharose FF层析柱。用5个柱体积的20mM pH 6.0磷酸缓冲液洗涤未结合的蛋白后，用含0-500mM NaCl缓冲液(NaCl添加到20mM pH 6.0磷酸缓冲液中得到的梯度NaCl浓度的液体)线性洗脱60min(60min内NaCl浓度从0线性升至500mM)，检测洗脱液OD_280nm，并收集洗脱峰。缓冲液平衡Q-Sepharose的流速为1mL/min，上样时流速为0.5mL/min，5个柱体积洗脱未结合蛋白流速为1mL/min，含0-500mM NaCl缓冲液线性洗脱速度为1mL/min。对不同收集管中的洗脱峰进行SDS-PAGE分析，根据蛋白电泳分子量收集蛋白酶组分。

将Q柱纯化后的RmproB酶液加载到经20mM pH 6.0磷酸缓冲液平衡后的Sephacryl-100层析柱。使用20mM pH 6.0磷酸缓冲液以0.3mL/min的流速进行洗脱，检测洗脱液OD_280nm，收集洗脱峰进行SDS-PAGE分析。根据蛋白电泳分子量收集蛋白酶组分，将得到的纯酶-重组天冬氨酸蛋白酶RmproB合并后备用。

重组天冬氨酸蛋白酶RmproB经Q-Sepharose阴离子交换层析和Sephacryl-100凝胶过滤两步纯化，达到电泳纯。该酶回收率为18.8％，纯化倍数为3.9倍，纯酶比酶活为3176.1U/mg(具体见表2)。粗酶液及其得到的纯化产物(RmproB)的SDS-PAGE如图3所示，表明重组蛋白RmproB的大小为49.4kDa。

表2重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的纯化表

^a使用pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液配制酪蛋白底物(浓度为1％)，在40℃下测定蛋白酶活力。

^b使用Lowry法测定蛋白含量。

二、重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的酶学性质

1)最适pH测定

分别以下述不同pH值的缓冲体系测定该酶最适pH值：氯化钾-盐酸(KCl-HCl，50mM，pH 1.0-2.0)；乳酸-乳酸钠(lactate，50mM，pH 2.0-4.0)；柠檬酸-柠檬酸钠(citrate，50mM，pH 3.5-6.5)；磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(phosphate，50mM，pH 6.5-8.0)。然后在40℃采用标准方法测定蛋白酶活力，以酶活力最高为100％，分别计算各个pH下测定的相对酶活力。

结果如图4所示，重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的最适pH值为2.5。

2)pH稳定性测定

分别用上述不同pH的缓冲液稀释RmproB酶液，在40℃恒温水浴锅中保温30min，冰水浴中冷却30min，在40℃和pH 2.5下测定蛋白酶酶活力，以未经处理的酶液作为对照，分别计算经过不同酸碱条件处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。

结果如图5所示，重组天冬氨酸蛋白酶RmproB在酸性下稳定，当pH为1.5-6.5时，残余酶活力在80％以上。

3)最适反应温度测定

RmproB在50mM pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液中适当稀释，分别在20-60℃不同温度下测定蛋白酶的酶活力，以酶活力最高值作为100％，分别计算各个温度下测定的相对酶活力。

结果如图6所示，重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的最适温度为40℃。

4)温度稳定性测定

RmproB在50mM pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液中适当稀释，分别在25-60℃保温30min，置于冰水浴中冷却30min，在40℃和pH 2.5条件下测定蛋白酶的酶活力，以未经热处理的酶液作为对照，分别计算不同热处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。

结果如图7所示，重组天冬氨酸蛋白酶RmproB在45℃以下保持稳定，残余酶活力在80％以上。

5)底物特异性测定

分别以1％的酪蛋白(Casein)、脱脂乳(Skimmed milk)、牛血清蛋白(Bovineserum ablumin)、血红蛋白(Hemoglobin)、大豆分离蛋白(Soy protein isolate)、明胶(Gelatin)、卵清蛋白(Albumin egg)、肌红蛋白(Myoglobin)、鱼精蛋白(Protaminesulfate)和胶原蛋白(Collagen)等为底物，按照步骤一中方法测定酶活。以酪蛋白为底物时的蛋白酶活为100％，分别计算蛋白酶对各种底物的比酶活和相对酶活。

结果如表3所示，重组天冬氨酸蛋白酶RmproB对酪蛋白表现出最高的水解活性，对血红蛋白(94.8％)、肌红蛋白(80.4％)、牛血清蛋白(73.8％)、脱脂奶粉(60.4％)具有较高的水解活性；对卵清蛋白(43.9％)、乳清蛋白(19.9％)和乳球蛋白(5.1％)水解活性相对较弱；对大豆分离蛋白、明胶、鱼精蛋白、胶原蛋白无水解作用。

表3重组天冬氨酸蛋白酶RmproB的底物特异性^a

底物	比酶活(U/mg)	相对酶活(％)
			酪蛋白	3176.1±67.1	100
血红蛋白	3011.1±78.2	94.8±2.5
			肌红蛋白	2552.3±68.8	80.4±2.2
牛血清蛋白	2344.3±79.7	73.8±2.5
			脱脂奶粉	1917.1±84.7	60.4±2.7
卵清蛋白	1393.5±17.0	43.9±0.5
			乳清蛋白	631.3±81.0	19.9±2.5
乳球蛋白	161.9±148.2	5.1±4.7
			大豆分离蛋白	0±0	0±0
明胶	0±0	0±0
			鱼精蛋白	0±0	0±0
胶原蛋白	0±0	0±0

^a在40℃下50mM pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液中，测定RmproB对不同底物的蛋白酶活性。每个实验组设置三个平行。

实施例3、重组天冬氨酸蛋白酶RmproB凝乳特性

一、RmproB凝乳活性的最适pH

针对实施例2纯化的重组天冬氨酸蛋白酶RmproB，用不同pH的柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH 3.5-6.5)配制10％脱脂奶粉溶液(底物)。在40℃采用标准方法测定凝乳酶活力，以酶活力最高为100％，分别计算不同pH下相对凝乳酶活力。同时，测定在上述pH条件下，凝乳酶活力与蛋白酶活力比值(CA/PA)。

结果如图8所示，实施例2提纯的重组天冬氨酸蛋白酶RmproB凝乳活性的最适pH值为4.0。在pH 4.0下，CA/PA值最高，为6.1。

二、RmproB凝乳活性的最适氯化钙浓度。

用50mM pH 4.0的柠檬酸钠缓冲液配制浓度为10％的脱脂奶粉乳液，加入氯化钙至氯化钙终浓度为0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、80mM和100mM。然后在40℃采用标准方法测定凝乳酶活力，以酶活力最高为100％，分别计算不同氯化钙浓度下相对凝乳酶活力。

结果如图9所示，实施例2的重组天冬氨酸蛋白酶RmproB在5mM氯化钙浓度下，凝乳酶活力最高。在该反应条件下(pH 4.0柠檬酸钠缓冲液，5mM氯化钙浓度)测定的凝乳活性为3894.1SU/mg。

三、RmproB对酪蛋白的水解特性。

使用50mM pH 4.0的柠檬酸钠缓冲液配制浓度为1％的α_s-、β-和κ-casein溶液。将10SU重组天冬氨酸蛋白酶RmproB分别加入到1mL不同酪蛋白溶液中，40℃下孵育。在反应0min、5min、10min和30min时取样，通过SDS-PAGE分析各组分酪蛋白的水解程度。取反应10min的κ-casein样品，使用飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行肽段检测，鉴定RmproB对κ-casein的酶切位点。

RmproB对酪蛋白水解结果如图10所示，RmproB对三种酪蛋白有不同程度的水解作用。其中，对κ-casein水解作用最强，对α_s-casein的水解作用次之，对β-casein水解作用相对较弱。RmproB对κ-casein的酶切位点如表4所示，其中Lys22-Ile23，Leu33-Ser34，Leu51-Ile52，Lys64-Pro65和Phe105-Met106是主要的酶切位点。

表4重组天冬氨酸蛋白酶RmproB水解κ-casein的多肽产物序列鉴定

^a通过MALDI-TOF-MS鉴定的经RmproB水解后的κ-casein肽段序列。

本发明所涉及的天冬氨酸蛋白酶具有蛋白酶活力和凝乳酶活力。将该酶编码基因在黑曲霉中表达并液体发酵，蛋白酶活性达2000U/mL，蛋白含量达6.1mg/mL。该天冬氨酸蛋白酶的最适pH为2.5，在pH 1.5-6.5保持稳定；最适温度为40℃，在45℃以下保持较高酶活力；其底物特异性广泛，对酪蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、牛血清白蛋白和脱脂牛奶表现出较高的水解活性。该酶具有显著的凝乳作用，凝乳酶活力为3894.1SU/mg，可特异性水解κ-酪蛋白的Lys22-Ile23、Leu33-Ser34、Leu51-Ile52、Lys64-Pro65和Phe105-Met106肽键。这些性质使其在食品工业中表现出很大的应用潜力。

该工程菌可在酶制剂公司实现产业化，生产的酶制剂可应用于食品、饲料等工业中，具有较大的经济价值和社会效益。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种具有凝乳活性的米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶及其制备方法与应用

<130> GNCSY212005

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Leu Phe Ala Leu Ser Ala Ala Val Ala Ala Leu Leu Ser Val

1 5 10 15

Ser Asp Ala Ala Leu Thr Arg Ile Pro Ile Lys Lys Thr Ala Glu Thr

20 25 30

Pro Asn Gln Lys Leu Glu Arg Tyr Thr His Thr Gly Glu Tyr Leu Thr

35 40 45

Gln Lys Tyr Phe Gly Ala Gln Arg Ser Gln Gln Asn Ser Val Met Gln

50 55 60

Pro Phe Gln Val Gly Pro Asp Gly Arg Val Glu His Gly Val Pro Ile

65 70 75 80

Ser Asn Tyr Met Asn Ala Gln Tyr Tyr Gly Glu Ile Glu Leu Gly Ser

85 90 95

Pro Pro Gln Thr Phe Ser Val Val Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu

100 105 110

Trp Val Pro Ser Thr His Cys Thr Ser Ile Ala Cys Phe Leu His Arg

115 120 125

Arg Tyr Asp Ser Ser Arg Ser Ser Thr Phe Lys Glu Asn Gly Thr Glu

130 135 140

Phe Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Gly Ser Leu Glu Gly Phe Ile Ser Glu

145 150 155 160

Asp Thr Leu His Val Gly Gly Val Lys Val Thr Gly Gln Gly Phe Ala

165 170 175

Glu Ser Val Lys Glu Pro Gly Phe Thr Phe Ala Leu Ala Arg Phe Asp

180 185 190

Gly Ile Phe Gly Leu Gly Tyr Asp Arg Ile Ser Val Lys Gly Val Val

195 200 205

Pro Pro Phe Tyr His Met Val Glu Arg Asp Leu Ile Asp Glu Pro Ile

210 215 220

Phe Ser Phe Trp Leu Asn Gly Asp Leu Asp Asn Glu Glu Asn Gly Gly

225 230 235 240

Glu Leu Val Phe Gly Gly Val Asp Glu Asp His Phe Glu Gly Glu Ile

245 250 255

Ala Trp Ser Pro Val Lys Arg Lys Gly Tyr Trp Glu Ile Glu Leu Glu

260 265 270

Asp Ile Lys Phe Gly Gly Glu Ser Val Asp Leu Asp Pro Val Gly Ala

275 280 285

Ala Ile Asp Thr Gly Ser Ser Leu Leu Val Ala Pro Thr Thr Val Ala

290 295 300

Asp Leu Ile Asn Lys Glu Leu Gly Ala Glu Lys Asn Trp Ala Gly Gln

305 310 315 320

Tyr Val Leu Asp Cys Ser Lys Val Pro Asn Leu Pro Glu Phe Cys Phe

325 330 335

Val Phe Ser Gly Lys Asp Phe Cys Leu Ser Gly Glu Asp Tyr Val Leu

340 345 350

Gln Leu Gln Asp Gln Cys Ile Ser Gly Phe Met Gly Met Asp Ile Pro

355 360 365

Glu Pro Ala Gly Pro Leu Trp Ile Val Gly Asp Val Phe Leu Arg Lys

370 375 380

Phe Tyr Ser Val Tyr Asp Leu Gly Asn Asp Arg Val Gly Leu Ala Lys

385 390 395 400

Ala Asn Ser Pro Pro Pro Ile Pro Ala Tyr Val Tyr His Ala Arg Glu

405 410 415

Arg Arg Cys Val Tyr Phe Leu Ala His Ile Ser Ile His Ser Leu His

420 425 430

Leu His Gln Ile Val Ala Ser

435

<210> 2

<211> 1320

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaattgt ttgccttgtc cgcagctgtt gctgctctcc tctcagtgtc tgatgctgct 60

ctcaccagaa ttcctatcaa gaagacagca gaaactccca accagaaatt ggagcgctac 120

acacacactg gtgaatacct cacccaaaag tactttggtg cgcagcgcag tcagcagaac 180

agcgttatgc agccattcca agttggcccc gacggccgtg tcgagcatgg cgttccgatt 240

tcgaactata tgaacgcaca atattatggc gaaatagagc ttggttcgcc tcctcaaaca 300

ttctccgttg tctttgatac cggttcatcc aacctctggg tcccctcgac tcactgcacc 360

tctatcgcat gcttccttca ccgccgctac gactctagca ggtcaagcac attcaaagag 420

aatggtaccg agtttgctat ccagtacggt actggctccc ttgaaggttt catcagcgag 480

gatactttgc atgttggtgg agttaaggtt actggccagg gctttgccga atctgtcaag 540

gaacctggct tcacatttgc acttgcccgc ttcgacggca tttttggtct aggctacgac 600

cgtatctctg tcaagggcgt cgtaccgccc ttctaccaca tggtggagcg cgatcttatc 660

gatgaaccaa tcttctcgtt ctggctgaac ggcgatctcg ataatgagga aaacggaggt 720

gagcttgtct ttggcggtgt cgatgaagac cactttgagg gcgagattgc ttggtcgcca 780

gtcaagcgca agggatactg ggaaatcgag ttggaagata tcaaattcgg cggcgaatcc 840

gttgacttgg atcccgttgg tgctgccatt gatacgggtt cctcgcttct cgttgcacct 900

accactgttg ccgacctcat caacaaggag ctcggtgctg agaagaactg ggctggtcaa 960

tatgttcttg attgcagcaa ggtccctaac ttgccagaat tctgctttgt gtttagcggt 1020

aaagatttct gcttaagcgg cgaggactat gttctccagc tccaagatca gtgcatttcc 1080

ggattcatgg gcatggatat cccagagcct gctggtcccc tctggattgt gggtgatgtc 1140

ttcctccgca agttctacag cgtgtatgat ttgggtaacg accgtgtcgg tttggcaaaa 1200

gcaaactccc cacctcctat tcccgcttat gtgtaccatg ctcgagaacg tcgttgtgtt 1260

tattttcttg cacatatatc tatacacagt cttcatctac atcagattgt cgcaagctag 1320

<210> 3

<211> 8318

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taaatcggct tctaggcgcg ctccatctaa atgttctggc tgtggtgtac aggggcataa 60

aattacgcac tacccgaatc gatagaacta ctcattttta tatagaagtc agaattcatg 120

gtgttttgat cattttaaat ttttatatgg cgggtggtgg gcaactcgct tgcgcgggca 180

actcgcttac cgattacgtt agggctgata tttacgtaaa aatcgtcaag ggatgcaaga 240

ccaaagtact aaaaccccgg agtcaacagc atccaagccc aagtccttca cggagaaacc 300

ccagcgtcca catcacgagc gaaggaccac ctctaggcat cggacgcacc atccaattag 360

aagcagcaaa gcgaaacagc ccaagaaaaa ggtcggcccg tcggcctttt ctgcaacgct 420

gatcacgggc agcgatccaa ccaacaccct ccagagtgac taggggcgga aatttatcgg 480

gattaatttc cactcaacca caaatcacag tcgtccccgg tattgtcctg cagaatgcaa 540

tttaaactct tctgcgaatc gcttggattc cccgcccctg gccgtagagc ttaaagtatg 600

tcccttgtcg atgcgatgta tcacaacata taaatactag caagggatgc catgcttgga 660

ggatagcaac cgacaacatc acatcaagct ctcccttctc tgaacaataa accccacaga 720

aggcatttat gcctctcgta tgcagaggaa atctcccctg atcttccgaa ctggtcgtac 780

ctggcgacct atgactatgg caccccagtt ctggggacct tccacggaag tgacctgctg 840

caggtgttct atgggatcaa gccaaactat gcagctagtt ctagccacac gtactatctg 900

agctttgtgt atacgctgga tccgaactcc aaccgggggg agtacattga gtggccgcag 960

tggaaggaat cgcggcagtt gatgaatttc ggagcgaacg acgccagtct ccttacggat 1020

gatttccgca acgggacata tgagttcatc ctgcagaata ccgcggcgtt ccacatctga 1080

tgccattggc ggaggggtcc ggacggtcag gaacttagcc ttatgagatg aatgatggac 1140

gtgtctggcc tcggaaaagg atatatgggg atcatgatag tactagccat attaatgaag 1200

ggcatatacc acgcgttgga cctgcgttat agcttcccgt tagttatagt accatcgtta 1260

taccagccaa tcaagtcacc acgcacgacc ggggacggcg aatccccggg aattgaaaga 1320

aattgcatcc caggccagtg aggccagcga ttggccacct ctccaaggca cagggccatt 1380

ctgcagcgct ggtggattca tcgcaatttc ccccggcccg gcccgacacc gctataggct 1440

ggttctccca caccatcgga gattcgtcgc ctaatgtctc gtccgttcac aagctgaaga 1500

gcttgaagtg gcgagatgtc tctgcaggaa ttcaagctag atgctaagcg atattgcatg 1560

gcaatatgtg ttgatgcatg tgcttcttcc ttcagcttcc cctcgtgcag atgaggtttg 1620

gctataaatt gaagtggttg gtcggggttc cgtgaggggc tgaagtgctt cctccctttt 1680

agacgcaact gagagcctga gcttcatccc cagcatcatt acacctcagc aatgtcgttc 1740

cgatctctac tcgccctgag cggcctcgtc tgcacagggt tggcagctct caccagaatt 1800

cctatcaaga agacagcaga aactcccaac cagaaattgg agcgctacac acacactggt 1860

gaatacctca cccaaaagta ctttggtgcg cagcgcagtc agcagaacag cgttatgcag 1920

ccattccaag ttggccccga cggccgtgtc gagcatggcg ttccgatttc gaactatatg 1980

aacgcacaat attatggcga aatagagctt ggttcgcctc ctcaaacatt ctccgttgtc 2040

tttgataccg gttcatccaa cctctgggtc ccctcgactc actgcacctc tatcgcatgc 2100

ttccttcacc gccgctacga ctctagcagg tcaagcacat tcaaagagaa tggtaccgag 2160

tttgctatcc agtacggtac tggctccctt gaaggtttca tcagcgagga tactttgcat 2220

gttggtggag ttaaggttac tggccagggc tttgccgaat ctgtcaagga acctggcttc 2280

acatttgcac ttgcccgctt cgacggcatt tttggtctag gctacgaccg tatctctgtc 2340

aagggcgtcg taccgccctt ctaccacatg gtggagcgcg atcttatcga tgaaccaatc 2400

ttctcgttct ggctgaacgg cgatctcgat aatgaggaaa acggaggtga gcttgtcttt 2460

ggcggtgtcg atgaagacca ctttgagggc gagattgctt ggtcgccagt caagcgcaag 2520

ggatactggg aaatcgagtt ggaagatatc aaattcggcg gcgaatccgt tgacttggat 2580

cccgttggtg ctgccattga tacgggttcc tcgcttctcg ttgcacctac cactgttgcc 2640

gacctcatca acaaggagct cggtgctgag aagaactggg ctggtcaata tgttcttgat 2700

tgcagcaagg tccctaactt gccagaattc tgctttgtgt ttagcggtaa agatttctgc 2760

ttaagcggcg aggactatgt tctccagctc caagatcagt gcatttccgg attcatgggc 2820

atggatatcc cagagcctgc tggtcccctc tggattgtgg gtgatgtctt cctccgcaag 2880

ttctacagcg tgtatgattt gggtaacgac cgtgtcggtt tggcaaaagc aaactcccca 2940

cctcctattc ccgcttatgt gtaccatgct cgagaacgtc gttgtgttta ttttcttgca 3000

catatatcta tacacagtct tcatctacat cagattgtcg caagcggaag cggagctact 3060

aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc tgctctcacc 3120

agaattccta tcaagaagac agcagaaact cccaaccaga aattggagcg ctacacacac 3180

actggtgaat acctcaccca aaagtacttt ggtgcgcagc gcagtcagca gaacagcgtt 3240

atgcagccat tccaagttgg ccccgacggc cgtgtcgagc atggcgttcc gatttcgaac 3300

tatatgaacg cacaatatta tggcgaaata gagcttggtt cgcctcctca aacattctcc 3360

gttgtctttg ataccggttc atccaacctc tgggtcccct cgactcactg cacctctatc 3420

gcatgcttcc ttcaccgccg ctacgactct agcaggtcaa gcacattcaa agagaatggt 3480

accgagtttg ctatccagta cggtactggc tcccttgaag gtttcatcag cgaggatact 3540

ttgcatgttg gtggagttaa ggttactggc cagggctttg ccgaatctgt caaggaacct 3600

ggcttcacat ttgcacttgc ccgcttcgac ggcatttttg gtctaggcta cgaccgtatc 3660

tctgtcaagg gcgtcgtacc gcccttctac cacatggtgg agcgcgatct tatcgatgaa 3720

ccaatcttct cgttctggct gaacggcgat ctcgataatg aggaaaacgg aggtgagctt 3780

gtctttggcg gtgtcgatga agaccacttt gagggcgaga ttgcttggtc gccagtcaag 3840

cgcaagggat actgggaaat cgagttggaa gatatcaaat tcggcggcga atccgttgac 3900

ttggatcccg ttggtgctgc cattgatacg ggttcctcgc ttctcgttgc acctaccact 3960

gttgccgacc tcatcaacaa ggagctcggt gctgagaaga actgggctgg tcaatatgtt 4020

cttgattgca gcaaggtccc taacttgcca gaattctgct ttgtgtttag cggtaaagat 4080

ttctgcttaa gcggcgagga ctatgttctc cagctccaag atcagtgcat ttccggattc 4140

atgggcatgg atatcccaga gcctgctggt cccctctgga ttgtgggtga tgtcttcctc 4200

cgcaagttct acagcgtgta tgatttgggt aacgaccgtg tcggtttggc aaaagcaaac 4260

tccccacctc ctattcccgc ttatgtgtac catgctcgag aacgtcgttg tgtttatttt 4320

cttgcacata tatctataca cagtcttcat ctacatcaga ttgtcgcaag ctagaactta 4380

acgttactga aatcatcaaa cagcttgacg aatctggata taagatcgtt ggtgtcgatg 4440

tcagctccgg agttgagaca aatggtgttc aggatctcga taagatacgt tcatttgtcc 4500

aagcagcaaa gagtgccttc tagtgattta atagctccat gtcaacaaga ataaaacgcg 4560

tttcgggttt acctcttcca gatacagctc atctgcaatg cattaatgca ttggacctcg 4620

caaccctagt acgcccttca ggctccggcg aagcagaaga atagcttagc agagtctatt 4680

ttcattttcg ggagacgaga tcaagcagat caacggtcgt caagagacct acgagactga 4740

ggaatccgct cttggctcca cgcgactata tatttgtctc taattgtact ttgacatgct 4800

cctcttcttt actctgatag cttgactatg aaaattccgt caccagcccc tgggttcgca 4860

aagataattg cactgtttct tccttgaact ctcaagccta caggacacac attcatcgta 4920

ggtataaacc tcgaaaatca ttcctactaa gatgggtata caatagtaac catgcatggt 4980

tgcctagtga atgctccgta acacccaata cgccggccga aactttttta caactctcct 5040

atgagtcgtt tacccagaat gcacaggtac acttgtttag aggtaatcct tctttctaga 5100

agtcctcgtg tactgtgtaa gcgcccactc cacatctcca ctcgaccaga ataagatggt 5160

ggagagctta taccgagctc ccaaatctgt ccagatcatg gttgaccggt gcctggatct 5220

tcctatagaa tcatccttat tcgttgacct agctgattct ggagtgaccc agagggtcat 5280

gacttgagcc taaaatccgc cgcctccacc atttgtagaa aaatgtgacg aactcgtgag 5340

ctctgtacag tgaccggtga ctctttctgg catgcggaga gacggacgga cgcagagaga 5400

agggctgagt aataagcgcc actgcgccag acagctctgg cggctctgag gtgcagtgga 5460

tgattattaa tccgggaccg gccgcccctc cgccccgaag tggaaaggct ggtgtgcccc 5520

tcgttgacca agaatctatt gcatcatcgg agaatatgga gcttcatcga atcaccggca 5580

gtaagcgaag gagaatgtga agccaggggt gtatagccgt cggcgaaata gcatgccatt 5640

aacctaggta cagaagtcca attgcttccg atctggtaaa agattcacga gatagtacct 5700

tctccgaagt aggtagagcg agtacccggc gcgtaagctc cctaattggc ccatccggca 5760

tctgtagggc gtccaaatat cgtgcctctc ctgctttgcc cggtgtatga aaccggaaag 5820

gccgctcagg agctggccag cggcgcagac cgggaacaca agctggcagt cgacccatcc 5880

ggtgctctgc actcgacctg ctgaggtccc tcagtccctg gtaggcagct ttgccccgtc 5940

tgtccgcccg gtgtgtcggc ggggttgaca aggtcgttgc gtcagtccaa catttgttgc 6000

catattttcc tgctctcccc accagctgct cttttctttt ctctttcttt tcccatcttc 6060

agtatattca tcttcccatc caagaacctt tatttcccct aagtaagtac tttgctacat 6120

ccatactcca tccttcccat cccttattcc tttgaacctt tcagttcgag ctttcccact 6180

tcatcgcagc ttgactaaca gctaccccgc ttgagcagac atcaccatga aaaagcctga 6240

actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct 6300

gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg 6360

atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg 6420

gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg aattcagcga 6480

gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga 6540

aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt cgcggaggcc atggatgcga tcgctgcggc 6600

cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac 6660

tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt 6720

gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc 6780

cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct 6840

gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc 6900

ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca 6960

gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta 7020

tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca atttcgatga 7080

tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg 7140

gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact 7200

cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat agacaatcaa 7260

tccatttcgc tatagttaaa ggatggggat gagggcaatt ggttatatga tcatgtatgt 7320

agtgggtgtg cataatagta gtgaaatgga agccaagtca tgtgattgta atcgaccgac 7380

ggaattgagg atatccggaa atacagacac cgtgaaagcc atggtctttc cttcgtgtag 7440

aagaccagac agacagtccc tgatttaccc ttgcacaaag cactagaaaa ttagcattcc 7500

atccttctct gcttgctctg ctgatatcac tgtcattcaa tgcatagcca tgagctcatc 7560

ttagatccaa gcacgtaatt ccatagccga ggtccacagt ggagcagcaa cattccccat 7620

cattgctttc cccaggggcc tcccaacgac taaatcaaga gtatatctct accgtccaat 7680

agatcgtctt cgcttcaaaa tctttgacaa ttccaagagg gtccccatcc atcaaaccca 7740

gttcaataat agccgagatg catggtggag tcaattaggc agtattgctg gaatgtcggg 7800

gccagttggc ccggtggtca ttggccgcct gtgatgccat ctgccactaa atccgatcat 7860

tgatccaccg cccacgaggc gcgtctttgc tttttgcgcg gcgtccaggt tcaactctct 7920

ctgcagctcc agtccaacgc tgactgacta gtttacctac tggtctgatc ggctccatca 7980

gagctatggc gttatcccgt gccgttgctg cgcaatcgct atcttgatcg caaccttgaa 8040

ctcactcttg ttttaatagt gatcttggtg acggagtgtc ggtgagtgac aaccaacatc 8100

gtgcaaggga gattgatacg gaattgtcgc tcccatcatg atgttcttgc cggctttgtt 8160

ggccctattc gtgggatgcg atgccctcgc tgtgcagcag caggtactgc tggatgagga 8220

gccatcggtc tctgcacgca aacccaactt cctcttcatt ctcacggatg atcaggatct 8280

ccggatgaat tctccggcgt atatgccgta tacgcagg 8318

Claims

1.蛋白质，其特征在于：是如下A1)-A4)中任一的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的第20至439位的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第1至439位的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质来源于米黑根毛霉。

3.与权利要求1或2所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下C1-C5任一所示的编码基因：

C5)与C1)-C4)任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子；

C6)在严格条件下与C1)-C4)任一限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子。

5.根据权利要求3或4所述的相关生物材料，其特征在于：B3)所述重组载体为Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)，Blunt-Pamy/gla-HygB-RmproB(P2A)是将序列表中序列3的核苷酸片段替换Blunt质粒的NotI识别位点和XhoI识别位点之间的小片段，保持Blunt质粒的其它核苷酸序列不变，得到的RmproB基因重组表达载体。

6.根据权利要求3或4所述的相关生物材料，其特征在于：B4)所述重组微生物为将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达权利要求1或2所述蛋白质的重组微生物；所述受体微生物为E1)-E3)中的任一种:

E1)真核微生物；

E2)曲霉属微生物；

E3)黑曲霉。

7.一种制备权利要求1或2所述蛋白质的方法，其特征在于，使含有权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的DNA分子在生物中进行表达，得到权利要求1或2所述蛋白质；所述生物为微生物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使含有权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的DNA分子在生物中进行表达包括将权利要求1或2所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达权利要求1或2所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求1或2所述蛋白质。

9.一种凝乳剂，其特征在于：所述凝乳剂的活性成分含有权利要求1或2所述的蛋白质和/或权利要求3-6任一所述的生物材料。

10.权利要求1或2所述的蛋白质或权利要求3-6任一所述的生物材料的应用，其特征在于：所述应用为下述P1-P3中的任一种：

P1、权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3-6任一所述生物材料在制备天冬氨酸蛋白酶中的应用；

P2、权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3-6任一所述生物材料在制备凝乳剂中的应用；

P3、权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3-6任一所述生物材料在制备奶酪中的应用。