CN113832129A - 一种壳聚糖酶突变体CsnBa1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学以及酶工程领域，具体涉及一种壳聚糖酶突变体CsnBa1及其应用。本发明公开了一种热稳定性提高的突变体CsnBa1及其酶学特性。以前期获得的壳聚糖酶CsnBaa为模板，通过二硫键以及糖基化突变获得热稳定性提升的突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明获得的壳聚糖酶突变体CsnBa1，在45℃到55℃范围内具有良好的稳定性，热处理30分钟后剩余酶活均大于80%，在60℃热处理30分钟后，剩余酶活为41.2%，为壳聚糖酶CsnBaa剩余酶活约17.8%的2.3倍，可用于制备重组载体、重组菌株。本发明获得的壳聚糖酶突变体CsnBa1具有良好的热稳定性，可用于壳寡糖制备领域，并进一步为其广泛应用奠定基础。

Description

一种壳聚糖酶突变体CsnBa1及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学以及酶工程领域，具体涉及一种壳聚糖酶突变体CsnBa1及其应用。

背景技术

据统计，我国农业土地使用化肥和农药的程度远高于世界平均水平。化肥和农药的过度使用，导致我国耕地板结化、酸性化严重，危害农业生态环境，威胁粮食安全。作为绿色植物疫苗，壳寡糖能够促进植物生长、提高植物抗逆、抗病毒能力，在绿色农业种植发挥重要作用。目前壳寡糖的制备主要分为物理法、化学法以及酶法。相比于物理和化学法，酶法具有反应条件温和、产物结构明确且活性高、绿色无污染等优势，酶法是目前最推崇的方法。

壳聚糖酶能够分解壳聚糖变成不同分子量的壳寡糖，壳聚糖酶根据基因序列相似性分为46家族、75家族、8家族等。目前关于46家族壳聚糖酶的研究最多，46家族中报道最多的则分别是芽孢杆菌壳聚糖酶。在我们前期的研究中获得了高效壳聚糖酶CsnBaa（专利申请号CN202011392286.4），壳聚糖酶CsnBaa能够高效分解壳聚糖制备不同聚合度的壳寡糖。通过进一步的研究我们发现壳聚糖酶CsnBaa热稳定性较差，当处理温度为60℃的时候，壳聚糖酶CsnBaa快速失活，限制了其产业化应用，因此提升其热稳定性具有重要意义。通过提升壳聚糖酶CsnBaa热稳定性，能够降低其生产成本，此外可以提升其稳定性，有利于其产业化应用。本专利通过结合二硫键突变以及糖基化修饰获得了热稳定性提升的突变体CsnBa1，为其产业化应用奠定基础。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种壳聚糖酶突变体CsnBa1及其应用。本发明获得的壳聚糖酶突变体CsnBa1，在45℃到55℃范围内具有良好的稳定性，热处理30分钟后剩余酶活均大于80%，在60℃热处理30分钟后，剩余酶活为41.2%，为壳聚糖酶CsnBaa剩余酶活约17.8%的2.3倍，有效提高了壳聚糖酶的热稳定性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种壳聚糖酶突变体CsnBa1，所述壳聚糖酶突变体CsnBa1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

AGLNKDQKRRAEQLTSIFENGTTEIQYGYVEHLPDGRGYTCGRAGFTTATGDALEVVEVYTKAVPNNKLKKYLPELRRLAKEESDDISNLKGFDSAWRSLGKDKDFRAAQDTVNDRLYYQPAMKQSDNIGLKTALAKAVMYDTIIQHGGGDDCDSLNSLIKRTNKKAGGSPKNGVDEKKWLNKFLDVRYDDLMNPCDPDTRDEWRESVARVDVLRSIAKANNYNLNGPINVYSEEYGDFVIK（SEQ ID NO.1）

优选的，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

GCTGGTTTGAACAAGGACCAAAAGAGAAGGGCTGAGCAGTTGACTTCCATCTTCGAGAACGGTACTACCGAGATCCAGTACGGTTACGTTGAACACTTGCCAGACGGTAGAGGTTACACTTGTGGTAGAGCTGGTTTCACTACTGCTACTGGTGACGCTTTGGAGGTTGTTGAGGTTTACACTAAGGCCGTGCCAAACAACAAGCTGAAGAAGTACTTGCCCGAGCTGAGAAGATTGGCCAAAGAAGAATCTGACGACATCTCCAACCTGAAGGGTTTCGATTCTGCTTGGAGATCCCTTGGTAAGGACAAGGATTTCAGAGCTGCTCAGGACACTGTTAACGACAGACTGTACTACCAGCCAGCTATGAAGCAGTCCGACAACATCGGTTTGAAAACCGCTTTGGCTAAGGCTGTCATGTACGACACTATTATCCAACACGGTGGTGGTGATGATTGTGACTCTTTGAACTCCCTGATCAAGAGGACCAACAAGAAAGCTGGTGGTTCCCCAAAGAACGGTGTTGACGAAAAGAAGTGGCTGAACAAGTTCCTGGACGTCAGATACGACGACTTGATGAACCCATGTGACCCAGACACTAGAGATGAATGGCGTGAATCCGTTGCCAGAGTTGACGTCTTGAGATCCATTGCTAAGGCCAACAACTACAACCTGAACGGTCCAATCAACGTCTACTCCGAAGAATACGGTGACTTCGTCATCAAGTAA（SEQ ID NO.2）

本发明的又一个目的是提供一种重组表达载体pPICZαA-csnba1，包含所述的壳聚糖酶突变体CsnBa1的序列。

本发明的又一个目的是提供一种重组菌，包含所述的重组表达载体pPICZαA-csnba1。

优选的，所述重组菌以毕赤酵母工程菌作为宿主。

优选的，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母X33。

本发明的又一个目的是提供一种高效表达如上述所述壳聚糖酶突变体CsnBa1的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）通过三维建模软件SWISS-MODEL获得壳聚糖酶CsnBaa三维模型；

（2）通过结合二硫键设计软件bridgeD和Disulfide by Design确定目标二硫键突变体，通过筛选获得有效二硫键突变体；

（3）以有效二硫键突变体为模板，通过构建糖基化突变体进一步获得热稳定性提升的突变体CsnBa1；

（4）在毕赤酵母高效表达突变体CsnBa1并测定其酶学特性。

本发明最后一个目的是提供一种所述壳聚糖酶突变体CsnBa1在制备壳寡糖中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供了一种壳聚糖酶突变体CsnBa1及其应用。本发明以壳聚糖酶CsnBaa为出发模板，通过二硫键以及糖基化突变获得热稳定性提升的突变体CsnBa1，加强了改酶合成壳聚糖酶的能力，为起工业化生产提供了一种实际有效策略；

（2）突变体CsnBa1在45℃到55℃范围内具有良好的稳定性，热处理30分钟后剩余酶活均大于80%，在60℃热处理30分钟后，剩余酶活为41.2%，为壳聚糖酶CsnBaa剩余酶活约17.8%的2.3倍，有效提高了壳聚糖酶的热稳定性；

（3）实验结果表明，突变体CsnBa1的最适反应pH为6.0，在pH4.0-10.0条件下，室温保存2小时后剩余酶活均大于80%，表明突变体CsnBa1具有良好的稳定性。

附图说明

图1为突变体CsnBa1重组工程菌高密度发酵曲线图；

图2为高密度发酵上清蛋白电泳图；

图3为突变体CsnBa1温度特性图；

图4中A为突变体CsnBa1最适反应pH图，B为pH稳定性图；

图5为突变体CsnBa1酶解壳聚糖薄层层析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明中涉及到的实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Top10为实验室常规保存、毕赤酵母X33购自美国Invitrogen公司，表达载体pPICZαA-csnbaa由前期实验构建（详细参考专利CN202011392286.4）。

2、酶与试剂盒

Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司；质粒提取试剂盒（#DP103-03），胶纯化试剂盒（#DP209-02）购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶SacI、限制性内切酶DpnI、Taq酶MIX（EmeraldAmp MAX PCR Master Mix）购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Zeocin购自Invitrogen公司；Biotin购自上海源叶生物科技有限公司，货号S13004-25g；

纯化试剂盒为购自上海生工生物工程有限公司的Ni-IDA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒（C600292-0001）。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB（1%（w/v）蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物，1%（w/v）NaCl，pH7.0）；

LBZ为LB培养基加25μg/mL Zeocin（博莱霉素）；

酵母培养基为YPD（1%（w/v）酵母提取物，2%（w/v）蛋白胨，2%（w/v）葡萄糖）；

酵母筛选培养基为YPDZ（YPD+100mg/L zeocin）；

酵母诱导培养基为BMGY（1％（w/v）酵母提取物、2％（w/v）蛋白胨、1.34％（w/v）YNB、0.00004％（w/v）Biotin、1％甘油(V/V)），注：YNB为酵母氮源基础(Yeast NitrogenBase)；Biotin为生物素。

4.壳聚糖酶活性测定所用试剂

乙酸乙酸钠的浓度（0.2mol/L，pH5.0）；壳聚糖底物：（（0.5%（w/v）壳聚糖溶于pH5.5，0.2mol/L乙酸乙酸钠溶液）；DNS试剂（6.3‰（w/v）3,5-二硝基水杨酸，18.2%（w/v）四水酒石酸钾钠，5‰（w/v）苯酚，5‰（w/v）无水亚硫酸钠）。

5.壳聚糖酶活性测定所用试剂

壳聚糖酶活性的测定方法如下：首先将壳聚糖底物和酶液在50℃进行预热；将预热好的50μL酶液加入1.5mL离心管，然后加入350μL壳聚糖底物，50℃反应10分钟后加入600μL DNS试剂终止反应，于100℃沸水浴5分钟进行显色，冷却后离心取上清在540nm下测定吸光值。酶活单位的定义为：每分钟生成1μmol还原糖所用酶的量定义为一个活力单位。

实施例1 二硫键突变体表达载体构建

通过在线软件SWISS-MODEL同源建模获得壳聚糖酶CsnBaa蛋白三维构象。通过在线软件Disulfide by Design 2.0（参考网址http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php）和bridgeD（参考网址

）预测分析壳聚糖酶CsnBaa不同氨基酸之间二硫键成键的可能性。通过结合两种软件预测结果，最终选择7对二硫键突变体进行实验，这7对二硫键分别为Q7C/A134C、F18C/R210C、V30C/D94C、Y60C/A109C、L90C/F93C、G130C/P171C和P153C/S196C。

分别设计引物构建突变体，其中，7对二硫键引物序列信息如下表1所示，引物序列如SEQ ID NO.3~34所示，二硫键突变体的构建过程如下：

（以突变体Q7C/A134C为例，其他以此类推）：

（1）以构建好的pPICZαA-csnbaa为模板，先用上下游引物Q7C-fw和Q7C-rev进行PCR扩增，上游引物序列信息如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列信息如SEQ ID NO.4所示，所述PCR反应体系如下表2所示，琼脂糖电泳检测PCR扩增结果；

PCR反应程序如下：

98℃，预变性1分钟；98℃，变性10秒；55℃，退火20秒；72℃，延伸1分钟；30个循环，最后72℃，延伸5分钟。

（2）在扩增成功的PCR产物中加入限制性内切酶DpnI进行酶切，去除模板载体pPICZαA-csnbaa，从而降低转化子的假阳性率；

（3）将酶切完的PCR产物纯化回收后，转入大肠杆菌Top10中；

PCR产物回收过程大致如下：

a.将目标产物进行切胶放入2mL离心管；

b.加入溶胶液，在60℃条件下反应10分钟；

c.将第二步的溶胶液体加入收集管，10000rpm离心1分钟；

d.用75%乙醇洗两次后晾干；

e.加入50μL水，离心3分钟；

（4）大肠杆菌转化子的筛选采用菌液PCR法，首先将重组转化子分别以单菌落的形式挑入LB培养基，200rpm，37℃培养4小时后，取2微升菌液作为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系如表3所示，菌液PCR所用引物为5’AOX-fw和3’AOX-rev，其中，5’AOX-fw的引物序列信息如SEQ ID NO.35所示，3’AOX-rev的引物序列信息如SEQ ID NO.36所示，PCR扩增条件为：94℃，预变性3分钟；94℃，预变性10秒；50℃，退火30秒；72℃，延伸1分钟；30个循环，最后72℃，延伸5分钟。将验证正确的产物进行测序，根据测序结果确定突变位点Q7C，从而获得突变表达载体pPICZαA-Q7C；

引物5’AOX-fw和3’AOX-rev的序列信息为：

5’AOX-fw：GACTGGTTCCAATTGACAAGC（SEQ ID NO.35）；

3’AOX-rev：GGCACCTGGCATTCTGACATCC（SEQ ID NO.36）。

（5）以表达载体pPICZαA-Q7C为模板，按照构建突变体Q7C相同的方法，只是将扩增引物换成A134C-fw和A134C-rev，从而获得二硫键突变体表达载体pPICZαA-Q7C/A134C。

通过实验最终获得7个二硫键表达载体，分别是pPICZαA-Q7C/A134C，pPICZαA-F18C/R210C，pPICZαA-V30C/D94C，pPICZαA-Y60C/A109C，pPICZαA-L90C/F93C，pPICZαA-G130C/P171C和pPICZαA- P153C/S196C。

实施例2 二硫键突变体筛选

将7对不同二硫键表达载体分别用限制性内切酶SacI线性化后，转入毕赤酵母X33，获得重组转化子。

转入过程大致如为：

（1）将酵母感受态细胞置于冰上放置20分钟；

（2）加入80ng线性化后的表达载体，混匀冰上放置5分钟后进行电转化，电转化条件为1.5千伏，400欧姆；

（3）电击完后立即加入0.6mL预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；

（4）30℃，静止放置2小时后涂布于YPDZ平板，培养2-3天后观察转化子的情况。为了使壳聚糖酶表达框以单拷贝的形式存在，转入的质粒浓度控制在80-100ng。

毕赤酵母重组转化子的筛选大致如下：

（1）每个二硫键突变体分别挑选3个重组转化子接入含有5mL BMGY培养基的50mL离心管中，30℃，200rpm培养；

（2）培养过程中每隔24小时加入0.5%甲醇进行诱导培养；

（3）培养48小时后10000转离心5分钟取上清进行酶活测定；

（4）根据酶活结果，进一步测定酶初步热稳定性，热稳定性测试方法如下：将稀释好的酶液在55℃水浴保温30分钟后进行残留酶活测定，以壳聚糖酶CsnBaa作为对照。

通过筛选测定获得7对不同二硫键表达载体对应重组菌的酶活以及热稳定性，实验结果如表4所示，由表4可知，在7对二硫键突变体中，P153C/S196C热稳定性提升最明显，60℃水浴保温30分钟后，剩余酶活为28.6%，而原始壳聚糖酶CsnBaa为17.5%。剩余的6对二硫键效果均不理想，因此选取突变体P153C/S196C进行下一步实验。

实施例3 糖基化突变体构建及筛选

研究表明蛋白糖基化可以提升热稳定性，因此理性设计糖基化位点可以提升重组蛋白的稳定性。异源蛋白在毕赤酵母重组表达的过程中，以N-糖基化为主，因此在本专利中以二硫键突变体P153C/S196C为出发模板，理性设计3个N-糖基化位点，以期能够进一步提升突变体P153C/S196C的热稳定性。N-糖基化识别元件一般为“NXS/T”，通过分析CsnBaa氨基酸序列，分别将第22位的M突变成T，第197位的D突变成T，第232位的Y突变成T，从而获得三个N-糖基化识别位点“NGTT”、“NPST”和“NVTS”。

突变体的构建过程和实施列2中的二硫键突变体构建基本一致，只是PCR扩增模板换成了表达载体pPICZαA-P153C/S196C，扩增引物分别换成了M22T-fw和M22T-rev，D197T-fw和D197T-rev以及Y232T-fw和Y232T-rev。通过实验最终获得表达载体pPICZαA-csnba1（含有突变位点P153C/S196C/M22T），pPICZαA-csnba2（含有突变位点P153C/S196C/D197T）和pPICZαA-ba3（含有突变位点P153C/S196C/Y232T）。分别将3个糖基化突变体表达载体线性化转入毕赤酵母X33，重组转化子的筛选、酶活测定以及热稳定性测定均和实施列2一致。

通过实验筛选，发现突变体P153C/S196C/M22T、P153C/S196C/D197T和P153C/S196C/Y232T对应重组工程菌酶活分别为12.5、13.6和9.8U/ml，热稳定性方面，60℃水浴保温30分钟后剩余酶活分别为41.2%，27.5%和28.6%。实验结果表明只有第22位的M突变成T所构建的糖基化突变体能够有效提升热稳定性。为了标注方便，将突变体P153C/S196C/M22T命名为CsnBa1。

实施例4 高酶活重组菌构建、筛选以及高密度发酵

基因拷贝数和发酵酶活呈正相关，因此筛选高拷贝重组菌可以提升重组壳聚糖酶在毕赤酵母的表达量。通过增加筛选平板YPD的zeocin浓度，可以提升重组菌目标基因的拷贝数。因此，本专利将表达载体pPICZαA-csnba1线性化后转入毕赤酵母X33，重组转化子均匀涂布于高浓度YPDZ平板（zeocin的浓度为300mg/L至500mg/L）。筛选方法和实施列2一致，通过筛选120个菌最终获得一个酶活优势菌（命名为Ba1），其培养48小时后发酵酶活为21.2U/ml。

重组工程菌Ba1高密度发酵在5L发酵罐进行，具体过程大致如下：将单菌落重组酵母工程菌接入含有50mL YPG培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养。再将过夜培养的重组酵母工程菌按1%（v/v）的接种量接入含有100mL YPG培养基的500mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养，至OD 600大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌按10%（v/v）的接种量接入含有2L BSM培养基的5L发酵罐。重组酵母工程菌在5L发酵罐的培养条件为：温度为30℃、pH值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40L/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到一定的量（190g/L左右），停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后（溶氧迅速上升）开始用甲醇诱导。甲醇的添加量根据溶氧进行调整。培养过程中，每24小时取样测定酶活。

由图1可知，随着发酵时间的增加，壳聚糖酶活性逐渐增加，当诱导培养至168小时重组工程菌Ba1发酵酶活达到2530U/mL，细胞湿重为456g/l。将发酵上清酶液进行蛋白电泳，如图2所示，发现突变体CsnBa1呈现两条带，大小分别约为35kDa和29kDa，表明突变体CsnBa1存在糖基化修饰。

实施例5 突变体CsnBa1温度特性测定

将实施列4获得的突变体CsnBa1上清酶液，通过10kDa超滤管进行浓缩，将超滤好的酶液，用上海生工生物工程有限公司的Ni-IDA蛋白纯化试剂盒进行纯化。将纯化好的突变体CsnBa1进行温度特性测定。

壳聚糖酶突变体CsnBa1温度特性测定具体如下：在pH5.5条件下测定突变体CsnBa1在40-70℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100%，计算其他温度下的相对酶活；在45℃-65℃不同温度条件下水浴热处理30分钟后测定剩余酶活，以没有做热处理样品的酶活为100%，计算其他温度下的相对剩余酶活。

突变体CsnBa1的温度特性如图3所示，由图3可知，突变体CsnBa1最适反应温度为55℃，在45℃到65℃范围内相对酶活均大于70%；由图3可知突变体CsnBa1在45℃到55℃范围内具有良好的稳定性，热处理30分钟后剩余酶活均大于80%，在60℃热处理30分钟后，剩余酶活为41.2%。相比于出发模板壳聚糖酶CsnBaa，突变体CsnBa1热稳定性得到有效提升，壳聚糖酶CsnBaa在60℃热处理30分钟后剩余酶活约为17.8%（具体数据见专利CN202011392286.4）。

实施例6 突变体CsnBa1 pH特性测定

突变体CsnBa1的pH特性测定具体如下：在55℃条件下测定壳聚糖酶CsnBa1在pH4.0-7.0下的酶活，以测定酶活最高pH下的酶活为100%，计算其他pH下的相对酶活；在pH4.0-10.0条件下，室温保存2小时后测定剩余酶活，以没有做任何处理的样品的酶活为100%，计算其他温度下的相对剩余酶活。

突变体CsnBa1的pH特性如图4所示。由图4A可知，突变体CsnBa1的最适反应pH为6.0，pH稳定性方面，在pH4.0-10.0条件下，室温保存2小时后剩余酶活均大于80%（图4B），表明在该pH范围内突变体CsnBa1具有良好的稳定性。

实施例7 突变体CsnBa1水解产物分析

突变体CsnBa1水解壳聚糖反应如下：称取4g壳聚糖溶于100ml乙酸乙酸钠缓冲液（pH5.0），加入500U突变体CsnBa1，50℃，100rpm进行水解反应，选取不同水解时间（5分钟-30分钟）样品进行薄层层析和水解率测定。

薄层层析大致如下：取1μL水解反应产物和4μL壳寡糖标准混合物，分别点到硅胶板（Silica gel 60，Merck）上；将点好样的硅胶板放置在扩展缸进行扩展，扩展缓冲液为异丙醇、水和氨水混合物（体积比例为15:1:7.5）；将扩展完的硅胶板从扩展缸取出吹干后喷显示剂（显示剂为0.2%的茚三酮乙醇溶液）；吹干后将硅胶板放置在100℃条件下进行高温显色。

水解率的测定大致如下：

（1）首先分别称量不同2mL规格离心管的重量；

（2）其次取不同反应时间的壳寡糖样品500微升，加入300微升NaOH调pH至8.0左右；

（3）离心去上清后，将含有沉淀的离心管放入100℃，烘干至恒重；

（4）烘干后的重量减去离心管的重量便是没有水解的壳聚糖；

（5）水解率的计算如下：水解率=（理论壳聚糖重量-没有水解壳聚糖重量）/理论壳聚糖重量。

由图5可知，当水解时间在5分钟至15分钟范围内，水解产物主要由壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖构成。当水解时间在20分钟至30分钟范围内，壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖构成，含有部分壳六糖。壳寡糖在医药、农业、食品等行业具有很好的应用效果。本发明中突变体CsnBa1可以制备不同分子量的壳寡糖，在壳寡糖的酶解制备领域具有很大的应用潜力。

实施例8 突变体CsnBa1水解产物应用研究

以小白菜为研究对象，研究突变体CsnBa1水解产物对水培小白菜生根促长的应用效果。实验采用水培法，将小白菜种子放置于实验室水培培养瓶中，采用基础营养液进行水培。突变体CsnBa1水解壳寡糖样品，水解时间20分钟，稀释500倍、1000倍、1500倍、2000倍以及2500倍进行实验，以基础营养液培养组作为对照，定期测定根系长度、植株重量。

实验结果如表5所示，由表5可知，添加壳寡糖能够促进小白菜生根和生长，培养35天后，添加壳寡糖实验组小白菜的根长和鲜重均高于对照组。其中稀释2000倍效果最明显，该组小白菜的鲜重和根长分别为22.5g和47.2厘米，相比对照组分别提升30.8%和56.3%，说明样品对小白菜有较好的促长和增产作用。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳润康生态环境股份有限公司

<120> 一种壳聚糖酶突变体CsnBa1及其应用

<130> 2021.11.2

<160> 36

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> 壳聚糖酶突变体CsnBa1的氨基酸序列（Amino acid sequence of chitosanasemutant CsnBa1）

<400> 1

Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ser

1 5 10 15

Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu His

20 25 30

Leu Pro Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr

35 40 45

Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys Ala Val

50 55 60

Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala

65 70 75 80

Lys Glu Glu Ser Asp Asp Ile Ser Asn Leu Lys Gly Phe Asp Ser Ala

85 90 95

Trp Arg Ser Leu Gly Lys Asp Lys Asp Phe Arg Ala Ala Gln Asp Thr

100 105 110

Val Asn Asp Arg Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Gln Ser Asp Asn

115 120 125

Ile Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Lys Ala Val Met Tyr Asp Thr Ile

130 135 140

Ile Gln His Gly Gly Gly Asp Asp Cys Asp Ser Leu Asn Ser Leu Ile

145 150 155 160

Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asn Gly Val Asp

165 170 175

Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu

180 185 190

Met Asn Pro Cys Asp Pro Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val

195 200 205

Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Ala Asn Asn Tyr Asn

210 215 220

Leu Asn Gly Pro Ile Asn Val Tyr Ser Glu Glu Tyr Gly Asp Phe Val

225 230 235 240

Ile Lys

<210> 2

<211> 729

<212> DNA

<213> 壳聚糖酶突变体CsnBa1的多聚核苷酸序列（The polynucleotide sequence ofchitosanase mutant CsnBa1）

<400> 2

gctggtttga acaaggacca aaagagaagg gctgagcagt tgacttccat cttcgagaac 60

ggtactaccg agatccagta cggttacgtt gaacacttgc cagacggtag aggttacact 120

tgtggtagag ctggtttcac tactgctact ggtgacgctt tggaggttgt tgaggtttac 180

actaaggccg tgccaaacaa caagctgaag aagtacttgc ccgagctgag aagattggcc 240

aaagaagaat ctgacgacat ctccaacctg aagggtttcg attctgcttg gagatccctt 300

ggtaaggaca aggatttcag agctgctcag gacactgtta acgacagact gtactaccag 360

ccagctatga agcagtccga caacatcggt ttgaaaaccg ctttggctaa ggctgtcatg 420

tacgacacta ttatccaaca cggtggtggt gatgattgtg actctttgaa ctccctgatc 480

aagaggacca acaagaaagc tggtggttcc ccaaagaacg gtgttgacga aaagaagtgg 540

ctgaacaagt tcctggacgt cagatacgac gacttgatga acccatgtga cccagacact 600

agagatgaat ggcgtgaatc cgttgccaga gttgacgtct tgagatccat tgctaaggcc 660

aacaactaca acctgaacgg tccaatcaac gtctactccg aagaatacgg tgacttcgtc 720

atcaagtaa 729

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Q7C-fw

<400> 3

gtttgaacaa ggactgtaag agaagggctg agcag 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Q7C-rev

<400> 4

ctgctcagcc cttctcttac agtccttgtt caaac 35

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> A134C-fw

<400> 5

catcggtttg aaaacctgtt tggctaaggc tgt 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> A134C- rev

<400> 6

acagccttag ccaaacaggt tttcaaaccg atg 33

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> F18C-fw

<400> 7

cagttgactt ccatctgtga gaacggtatg accg 34

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> F18C-rev

<400> 8

cggtcatacc gttctcacag atggaagtca actg 34

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> R210C-fw

<400> 9

cgtgaatccg ttgcctgtgt tgacgtcttg ag 32

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> R210C-rev

<400> 10

ctcaagacgt caacacaggc aacggattca cg 32

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> V30C-fw

<400> 11

tccagtacgg ttactgtgaa cacttgccag acg 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> V30C-rev

<400> 12

cgtctggcaa gtgttcacag taaccgtact gga 33

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> D94C-fw

<400> 13

aacctgaagg gtttctgttc tgcttggaga tccctt 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> D94C-rev

<400> 14

aagggatctc caagcagaac agaaaccctt caggtt 36

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> Y60C-fw

<400> 15

ggaggttgtt gaggtttgta ctaaggccgt gc 32

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> Y60C-rev

<400> 16

gcacggcctt agtacaaacc tcaacaacct cc 32

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> A109C-fw

<400> 17

aaggatttca gagcttgtca ggacactgtt aacgac 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> A109C-rev

<400> 18

gtcgttaaca gtgtcctgac aagctctgaa atcctt 36

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> L90C/F93C-fw

<400> 19

atctgacgac atctccaact gtaagggttg tgattctgct tggagatccc 50

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> L90C/F93C-rev

<400> 20

gggatctcca agcagaatca caacccttac agttggagat gtcgtcagat 50

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> G130C-fw

<400> 21

tccgacaaca tctgtttgaa aaccgcttt 29

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> G130C-rev

<400> 22

aaagcggttt tcaaacagat gttgtcgga 29

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> P171C-fw

<400> 23

aagctggtgg ttcctgtaag aacggtgttg acgaaa 36

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> P171C-rev

<400> 24

tttcgtcaac accgttctta caggaaccac cagctt 36

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> P153C-fw

<400> 25

ggtggtggtg atgattgtga ctctttgaac tccct 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> P153C-rev

<400> 26

agggagttca aagagtcaca atcatcacca ccacc 35

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> S196C-fw

<400> 27

cttgatgaac ccatgtgacc cagacactag a 31

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> S196C-rev

<400> 28

tctagtgtct gggtcacatg ggttcatcaa g 31

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> M22T-fw

<400> 29

atcttcgaga acggtactac cgagatccag t 31

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213> M22T-rev

<400> 30

actggatctc ggtagtaccg ttctcgaaga t 31

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> D197T-fw

<400> 31

cgacttgatg aacccatgta ctccagacac tagag 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> D197T-rev

<400> 32

ctctagtgtc tggagtacat gggttcatca agtcg 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> Y232T-fw

<400> 33

gtccaatcaa cgtcacttcc gaagaatacg gtgac 35

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> Y232T-rev

<400> 34

gtcaccgtat tcttcggaag tgacgttgat tggac 35

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物5’AOX-fw（Primer 5’AOX-fw）

<400> 35

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物3’AOX-rev（Primer 3’AOX-rev）

<400> 36

ggcacctggc attctgacat cc 22

Claims (8)

1.一种壳聚糖酶突变体CsnBa1，其特征在于，所述壳聚糖酶突变体CsnBa1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖酶突变体CsnBa1，其特征在于，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体pPICZαA-csnba1，其特征在于，包含权利要求2所述的壳聚糖酶突变体CsnBa1的序列。

4.一种重组菌，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体pPICZαA-csnba1。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以毕赤酵母工程菌作为宿主。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母X33。

7.一种高效表达如权利要求1所述壳聚糖酶突变体CsnBa1的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）通过三维建模软件SWISS-MODEL获得壳聚糖酶CsnBaa三维模型；

（2）通过结合二硫键设计软件bridgeD和Disulfide by Design确定目标二硫键突变体，通过筛选获得有效二硫键突变体；

（3）以有效二硫键突变体为模板，通过构建糖基化突变体进一步获得热稳定性提升的突变体CsnBa1；

（4）在毕赤酵母高效表达突变体CsnBa1并测定其酶学特性。

8.一种如权利要求1所述壳聚糖酶突变体CsnBa1在制备壳寡糖中的应用。

Images