CN115896072A

CN115896072A - 一种氨肽酶BmAp、突变体BmApM及其应用

Info

Publication number: CN115896072A
Application number: CN202211329966.0A
Authority: CN
Inventors: 王建荣; 祝木金; 陈微; 王平; 钟斌; 曹革
Original assignee: Shenzhen Raink Plant Nutrition Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Raink Plant Nutrition Technology Co ltd
Priority date: 2022-10-27
Filing date: 2022-10-27
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2042-10-27
Also published as: CN115896072B

Abstract

本发明属于蛋白质理性设计及酶催化领域，具体涉及一种氨肽酶BmAp、突变体BmApM及其应用。本发明提供的氨肽酶BmAp来源于莫海威芽孢杆菌。本发明通过同源克隆、异源表达以及特性表征获得氨肽酶BmAp及其酶学特性。以氨肽酶BmAp为出发模板，通过蛋白自由能优化获得热稳定性提升的突变体BmApM。以毕赤酵母为宿主，实现氨肽酶BmAp和突变体BmApM的高效制备。本发明最终将氨肽酶BmAp及其突变体BmApM应用于蛋白水解，为其下一步产业化应用提供技术参考。

Description

一种氨肽酶BmAp、突变体BmApM及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质理性设计及酶催化领域，具体涉及一种氨肽酶BmAp、突变体BmApM及其应用。

背景技术

蛋白酶作为一种水解蛋白质形成多肽及游离氨基酸的生物催化剂，在许多领域具有巨大的应用潜力。根据水解底物的方式，蛋白酶可以分为内切酶和外切酶，内切酶蛋白酶随机切割蛋白内部的肽键，从而形成不同长度的多肽，外切酶则将多肽进一步分解成游离氨基酸。外切酶根据水解氨基酸的位点，可以分为羧肽酶和氨肽酶，羧肽酶作用于多肽的C-末端，氨肽酶则主要识别多肽N-末端从而进行水解反应。

氨肽酶作为蛋白水解过程中重要的一员，能够将多肽水解成游离氨基酸，提升蛋白水解物的生物活性，从而在食品、农业、医药等许多领域具有重要的应用价值。迄今已报道的多种氨肽酶主要来源于真核及原核生物，主要集中于曲霉、芽孢杆菌、根霉等，而关于莫海威芽孢杆菌氨肽酶的报道还未见报道。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种氨肽酶BmAp、突变体BmApM及其应用。本发明提供的氨肽酶来源于莫海威芽孢杆菌，可以实现蛋白质的高效水解。本发明的技术方案如下：

一种来源于莫海威芽孢杆菌的氨肽酶BmAp，所述氨肽酶BmAp的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明还提供了一种编码所述氨肽酶BmAp氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种突变体BmApM，所述突变体BmApM以权利要求1所述氨肽酶BmAp为出发模板，通过对蛋白Loop区域优化获得。

优选地，所述突变体BmApM的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种编码所述突变体BmApM氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种表达载体pPICZαA-bmap1，包含编码所述氨肽酶BmAp氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达载体pPICZαA-bmapm，包含编码所述突变体BmApM氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组毕赤酵母工程菌株，包含编码所述氨肽酶BmAp氨基酸序列的核苷酸序列或编码所述突变体BmApM氨基酸序列的核苷酸序列。。

优选地，所述毕赤酵母为毕赤酵母X33。

本发明还提供了一种所述氨肽酶BmAp或所述突变体BmApM结合碱性蛋白酶在水解蛋白质中的应用(即氨肽酶BmAp、突变体BmApM均可以与碱性蛋白酶结合用于蛋白质水解)。

与现有技术相比，本发明具有如下技术优势：

本发明采用同源克隆获得莫海威芽孢杆菌氨肽酶BmAp的编码基因bmap；以大肠杆菌为宿主，实现异源表达、纯化，并通过酶学表征获得氨肽酶BmAp酶学特性；以氨肽酶BmAp为出发模板，通过蛋白Loop区域优化获得热稳定性提升的突变体BmApM，提升了氨肽酶BmAp的热稳定性，以毕赤酵母为宿主，实现氨肽酶BmAp及其突变体BmApM高效制备，实现了蛋白质的高效水解，为氨肽酶BmAp的产业化应用奠定良好的基础。

附图说明

图1大肠杆菌重组表达氨肽酶BmAp蛋白电泳结果图；

图2氨肽酶BmAp酶学特性图；

图3氨肽酶BmAp及突变体BmApM三维构象图；

图4突变体BmApM酶学特性图；

图5重组工程菌产氨肽酶BmAp及突变体BmApM发酵曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明中涉及到的试验材料和试剂：

1、莫海威芽孢杆菌R1由前期实验筛选获得(筛选过程大致如下：(1)从深圳不同海鲜市场取废弃的虾蟹壳进行粉碎；(2)将1克粉碎后的虾蟹壳加入含有10ml无菌水的50ml离心管，混匀；(3)采用10倍稀释法(稀释范围为10^-2至10^-6倍)分别进行稀释，将稀释后的溶液均匀涂布于固体筛选培养基(LB固体培养基加入1％酪蛋白)，放置于37℃静置培养；(4)将在固体筛选培养基上呈现透明圈的菌种，分别在LB固体培养基划线纯化，将纯化后的菌种进行16sRNA分子鉴定。

经过16sRNA分子鉴定，保存于实验室-60℃冰箱。毕赤酵母X33、大肠杆菌菌株Top10、大肠杆菌菌株BL21、TA克隆载体pMD20-T、表达载体pET-22b和pPICZαA均从商业途径购买获得。

2、酶与试剂盒

高保真Taq酶

HS(Premix)、TaKaRa Taq^TM(Code No.R001B)、无缝克隆试剂盒

HD Cloning Kit(Code No.639649)以及限制性内切酶(SacI、EcoRI和NotI)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；质粒提取试剂盒(#DP103-03)以及胶纯化试剂盒(#DP209-02)均购自天根生化科技(北京)有限公司；Zeocin购自Invitrogen公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，L-亮氨酸-4-硝基苯胺购自上海源叶生物科技有限公司；其它化学试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB(1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)NaCl，pH7.0)。LBZ为LB培养基加25μg/mL Zeocin(博莱霉素)。LBA为LB培养基加25μg/mL氨苄青霉素。

酵母培养基为YPD(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+不同浓度zeocin)。

酵母诱导培养基BMGY(1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、1.34％(w/v)YNB、0.00004％(w/v)Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY培养基(除以0.5％(v/v)甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。

注：YNB为酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)；Biotin为生物素。

实施例1氨肽酶BmAp基因克隆

将低温保存的莫海威芽孢杆菌R1在LB固体培养基37℃活化后接入LB液体培养基，37℃，200r/min培养24h后提取基因组用于PCR扩增。根据美国国家生物信息中心数据库(NCBI)莫海威芽孢杆菌PS17基因组序列假定氨肽酶基因序列(基因登录号：CP066516.1，186886-188250)和莫海威芽孢杆菌LDFZ001基因组序列假定氨肽酶基因序列(基因登录号：CP063276.1，3700473-3701840)设计一对引物(bmap-fw和bmap-rev)用于氨肽酶基因bmap扩增。以提取的莫海威芽孢杆菌R1基因组为模板，通过PCR扩增获得编码基因bmap。PCR扩增体系如表1所示，PCR扩增条件大致如下：98℃，预变性30秒，98℃变性5秒，50℃退火20秒，72℃延伸20秒，扩增33个循环。

表1 PCR扩增体系

试剂	体积(μL)
		<![CDATA[TaKaRa Taq<sup>TM</sup>(Premix)]]>	25
bmap-fw	1
		bmap-rev	1
莫海威芽孢杆菌R1基因组DNA	0.5
		无菌水	22.5

通过琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增获得长度约为1400bp的特异条带，将该PCR产物纯化回收，与TA克隆载体pMD20-T进行连接反应，转入大肠杆菌Top10。

转化实验过程如下：(1)从-60℃冰箱取出大肠杆菌Top10感受态细胞，在冰上放置20分钟；(2)加入10μL连接产物(PCR产物)，冰上放置10分钟，42℃热激90秒，继续在冰上放置3分钟后加入600μL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养1小时；(3)将培养1小时后的菌液均匀涂布于LBA固体平板，37℃，培养18小时后，将LBA固体平板上的单菌落接入LBA液体培养基，200rpm培养4小时后作为菌液PCR的模板；(4)菌液PCR反应体系如表2所示，反应条件如下：94℃，预变性4分钟，94℃变性30秒，52℃退火20秒，72℃延伸90秒，扩增33个循环；(5)根据菌液PCR结果确定阳性转化子，提取阳性转化子的质粒送至广州艾基生物公司进行测序分析。

通过上述实验获得载体pMD20-T-bmap，通过测序获得bmap的DNA序列。通过NCBI在线软件blastn分析，发现获得的DNA序列与来源于莫海威芽孢杆菌PS17相似性最高，达到94.93％，表明获得的基因是氨肽酶基因。通过在线软件ORF Finder(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)，发现该序列完整开放阅读框为1365bp。

表2菌液PCR扩增体系

试剂	体积(μL)
		<![CDATA[TaKaRa Taq<sup>TM</sup>Mix]]>	10
bmap-fw	0.5
		bmap-rev	0.5
菌液	1
		无菌水	10

实施例2氨肽酶BmAp重组工程菌构建、表达及纯化

以大肠杆菌BL21为宿主重组表达氨肽酶BmAp，实验过程大致如下：(1)构建表达载体pET-22b-bmap1；(2)将表达载体pET-22b-bmap1转化大肠杆菌BL21并且筛选阳性转化子；(3)制备重组氨肽酶BmAp；(4)纯化回收重组氨肽酶BmAp。

由于异源表达，因此构建表达载体过程中，需要去掉氨肽酶BmAp自身信号肽。以获得的载体pMD20-T-bmap为模板，通过引物bmap1-fw和引物bmap1-rev，进行PCR扩增，获得基因bmap1(不含信号肽编码序列)，通过无缝克隆的方式将bmap1连接至表达载体pET-22b。转化、筛选实验均和实施例1一致。通过测序分析，最终成功构建表达载体pET-22b-bmap1。

将表达载体pET-22b-bmap1转入大肠杆菌BL21，获得重组表达氨肽酶BmAp大肠杆菌(命名为BL21-Ap12)，转化筛选过程均和实施例1的方法一致。

制备重组氨肽酶BmAp的实验过程如下：(1)将重组菌株BL21-Ap12划线于含抗生素LBA固体平板，37℃倒置培养18小时后，挑取长势良好的单菌落，接种于10mL的LBA液体培养基，37℃、200rpm振荡培养8小时(OD₆₀₀约为1.0)，即为种子液；(2)按1％(v/v)将种子液接种于含有200mL的LB液体培养基的1000mL摇瓶，37℃、200rpm振荡诱导4小时(OD₆₀₀约为0.8)；(3)加入终浓度为0.5mmol/L IPTG后，将培养条件转换为16℃，120rpm，培养6小时；(4)将培养好的菌液，8000rpm冷冻离心10分钟后，弃上清液，获得菌体；(5)加入50mmol/L pH 7.4的磷酸缓冲液洗涤2次，然后加入10mL预冷的50mmol/LpH 7.4磷酸缓冲液重悬，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mmol/L；(6)超声处理(300W超声10秒，间隔15秒，共30次)使细胞破碎，6℃、10000rpm离心10分钟后，取上清进行SDS-PAGE电泳检测。

由图1可知，重组氨肽酶BmAp在大肠杆菌BL21成功表达，其大小约为42kDa。由于大肠杆菌重组表达自身蛋白太多，因此需要对重组氨肽酶BmAp进行纯化，才能进行下一步实验。

重组氨肽酶BmAp纯化过程如下：(1)将超声破碎的上清液0.45μm滤膜过滤后，按说明书使用Ni-NTA柱(北京索莱宝科技有限公司)进行亲和层析纯化，使用浓度100mmol/L咪唑缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳检测。将纯化的蛋白装入透析袋，放入pH7.0磷酸缓冲液(浓度为50mmol/L)透析过夜，超滤浓缩，即为纯化重组氨肽酶BmAp。

由图1可知，与超声破碎的上清液相比，纯化后的重组氨肽酶BmAp蛋白电泳只有一条大小约为42kDa的条带，表明获得的重组氨肽酶BmAp具有较高的纯度，可以用于下一步实验。

实施例3酶比活及反应动力学参数测定

将实施例2纯化后的重组氨肽酶BmAp进行酶活、酶比活及酶反应动力学参数测定。酶活测定方法如下：(1)建立标准曲线；(2)测定酶活；(3)计算酶活。

标准曲线建立过程如下：(1)将硝基苯胺溶解于Tris-HCl缓冲液(pH8.0，浓度50mmol/L)，分别配置终浓度为0μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，60μmol/L，80μmol/L和100μmol/L的硝基苯胺溶液；(2)分别取1mL不同浓度硝基苯胺溶液(0mmol/L至100mmol/L)测定其在OD₄₁₀下的吸光值；(3)以不同浓度硝基苯胺对应OD₄₁₀下的吸光值为横坐标，以不同浓度硝基苯胺为纵坐标，得到硝基苯胺浓度计算公式为：Y＝53.9X-0.57。

酶活测定过程如下：(1)将L-亮氨酸-4-硝基苯胺溶解于Tris-HCl缓冲液(pH8.0，浓度50mmol/L)，配置成终浓度为5μmol/L，作为底物备用；(2)分别取600μL底物(5μmol/L的L-亮氨酸-4-硝基苯)和稀释好的酶液200μL(稀释约50倍)，在50℃预热2分钟；(3)将预热后的底物和酶液混合，50℃水浴反应10分钟后，加入200μL乙酸溶液终止反应；(4)将测定反应产物在OD₄₁₀下的吸光值，整个过程以灭活的重组氨肽酶BmAp为对照；(5)酶活单位定义为在50℃，pH8.0条件下，每分钟水解亮氨酸对硝基苯胺生成1μmol硝基苯胺所需要酶量，定义为一个酶活单位；(6)根据标准曲线进行酶活计算，通过换算最终酶活计算公式为：酶活＝N×(23.9X-0.57)/2，N为酶液稀释倍数。

通过测定纯化回收的重组氨肽酶BmAp的酶活为98.5U/mL。

此外参照改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒(货号C503041-1000，上海生工股份有限公司)进行蛋白浓度测定。实验过程大致如下：将纯化回收的重组氨肽酶BmAp稀释成不同倍数(分别为5倍、10倍、15倍和20倍)；取100μL稀释好的酶液，加入1mL Bradford染色液，室温放置10分钟后，在OD₅₉₅测定吸光值，根据吸光值计算蛋白浓度。

通过实验测定，纯化回收的重组氨肽酶BmAp蛋白浓度为0.81mg/mL。根据重组氨肽酶BmAp的酶活(98.5U/mL)和蛋白浓度(0.81mg/mL)，计算出其酶比活为121.5U/mg。

重组氨肽酶BmAp酶反应动力学参数测定如下：(1)配置不同浓度(0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L和4.0mmol/L)的亮氨酸对硝基苯胺作为底物备用；(2)分别测定重组氨肽酶BmAp酶对不同浓度亮氨酸对硝基苯胺的水解反应速度；(3)以不同浓度亮氨酸对硝基苯胺为横坐标，以重组氨肽酶BmAp对不同浓度底物的水解反应速度为纵坐标，通过软件Graphpad Prism 8进行拟合分析，获得重组氨肽酶BmAp的米氏常数和最大反应速度。

重组氨肽酶BmAp酶反应动力学常数如表3所示，重组氨肽酶BmAp米氏常数K_m和最大反应速度分别为2.13mmol/L和145.2μM/min/mg，表明重组氨肽酶BmAp对亮氨酸对硝基苯胺具有良好的亲和力和水解活性。

表3重组氨肽酶BmAp酶动力学参数

酶动力学参数	数值
		<![CDATA[米氏常数K<sub>m</sub>(mmol/L)]]>	2.13
<![CDATA[最大反应速度V<sub>max</sub>(μM/min/mg)]]>	145.2
		<![CDATA[催化常数k<sub>cat</sub>(/s)]]>	81.2
专一性常数(L/mmol/s)	38.12

实施例4重组氨肽酶BmAp特性表征

重组氨肽酶BmAp特性表征实验包括，pH特性测定、温度特性测定和金属离子稳定性测定。

重组氨肽酶BmAppH特性测定包括最适反应pH和pH稳定性。最适反应pH测定如下：测定重组氨肽酶BmAp在pH6.5至pH10.0的酶活，把酶活最高pH下的数值设置为100％，计算其它pH条件下的相对酶活。

由图2A可知，重组氨肽酶BmAp最适反应pH为8.0，在pH7.0至pH9.0范围内相对酶活大于70％。

重组氨肽酶BmAp在不同pH条件下稳定性测定如下：将重组氨肽酶BmAp在pH6.5至pH10.0条件下，室温放置6小时后，测定剩余酶活。以没有处理的样品作为对照。

由图2A可知，重组氨肽酶BmAp在pH6.0至pH9.0条件下具有良好的稳定性，处理6小时后，剩余酶活均大于80％。

重组氨肽酶BmAp温度特性测定包括最适反应温度和热稳定性。最适反应温度测定如下：测定重组氨肽酶BmAp在不同温度下的酶活(40℃至70℃)，以酶活最高温度下的数值设置为100％，计算其它温度下的相对酶活。

由图2B可知，重组氨肽酶BmAp最适反应温度为50℃，当温度高于55℃，剩余酶活急剧下降，60℃、65℃和70℃的相对酶活分别为42.1％，12.3％和6.2％。

重组氨肽酶BmAp热稳定性测定如下：将重组氨肽酶BmAp在不同温度下(40℃至70℃)水浴处理30分钟后进行剩余酶活测定，以没有热处理的样品为对照。

由图2B可知，在40℃至55℃范围内，重组氨肽酶BmAp具有良好的稳定性，剩余酶活大于82％；当处理温度大于55℃，重组氨肽酶BmAp剩余酶活急剧下降。

不同金属离子对重组氨肽酶BmAp稳定性影响测定如下：用Tric-Hcl缓冲液分别配置1mM和5mM金属离子缓冲液，将重组氨肽酶BmAp加入不同浓度金属离子缓冲液，室温放置6小时后测定剩余酶活，以没有处理的样品作为对照。

由表4可知，金属离子Co²⁺和Zn²⁺对重组氨肽酶BmAp具有激活作用，在1mM和5mM条件下，重组氨肽酶BmAp剩余酶活分别为186％和126％以及176％和136％；金属离子Cu²⁺对重组氨肽酶BmAp具有抑制作用，在1mM和5mM条件下，重组氨肽酶BmAp剩余酶活分别为45％和13％；其它金属离子对重组氨肽酶BmAp稳定性影响较小，剩余酶活均大于80％。

表4不同金属离子对重组氨肽酶BmAp稳定性影响

金属离子

<![CDATA[K+]]>

<![CDATA[Na+]]>

<![CDATA[Co2+]]>

<![CDATA[Zn2+]]>

<![CDATA[Ca2+]]>

<![CDATA[Mg2+]]>

<![CDATA[Cu2+]]>

<![CDATA[Mn2+]]>

1mM

96％

90％

186％

176％

86％

83％

45％

90％

5mM

88％

81％

126％

136％

81％

80％

13％

83％

实施例5蛋白自由能优化单点突变体计算分析及表达载体构建

在实施例4重组氨肽酶BmAp特性表征中过程中，发现重组氨肽酶BmAp热稳定性较差，在60℃热处理30分钟后，剩余酶活仅为35.3％，限制其产业化应用，因此需要提升其热稳定性。蛋白构象自由能优化作为一种蛋白质理性设计方法，能够有效提升蛋白热稳定性。本专利拟通过蛋白构象自由能优化提升重组氨肽酶BmAp热稳定性，实验过程大致分成三部分：(1)同源建模获得氨肽酶BmAp三维构象；(2)预测分析获得目标突变位点；(3)分析单点突变体热稳定性，获得有效单点突变体；(4)将有效突变体进行叠加突变，获得最佳组合突变体。

以在线软件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)进行氨肽酶BmAp同源建模，过程如下：(1)通过同源比对氨肽酶BmAp氨基酸序列，找到最适模板；(2)以最适模板为基础，进行同源建模，获得氨肽酶BmAp三维构象；(3)通过蛋白三维构象在线评估软件SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)对氨肽酶BmAp三维构象进行质量评估。

通过预测分析，最终以枯草芽孢杆菌氨肽酶晶体结构(晶体登录号：6HC6)为模板，获得氨肽酶BmAp三维构象(图3)。

分别用预测软件FoldX(http://protein.org.cn/ddg.html)、PoPMuSiC(https://soft.dezyme.com/)和DeepDDG(http://protein.org.cn/ddg.html)对氨肽酶BmAp进行自由能突变计算分析。三种软件计算分析结果显示，对氨肽酶BmAp多个位点进行突变，能够降低其自由能，提升其稳定性。最终选择21个单点突变，进行验证实验。这21个单点突变体分别为：K161W(-0.8kcal/mol)、A172F(-0.82kcal/mol)、G200F(-0.78kcal/mol)、D205F(-0.94kcal/mol)、G206F(-0.89kcal/mol)、Q228I(-1.17kcal/mol)、N229F(-1.47kcal/mol)、K234W(-1.41kcal/mol)、A249Y(-1.36kcal/mol)、N261W(-1.06kcal/mol)、D262Y(-1.31kcal/mol)、N263W(-1.06kcal/mol)、S265C(-1.29kcal/mol)、G266Y(-1.61kcal/mol)、A290F(-1.19kcal/mol)、N319W(-1.22kcal/mol)、N321Y(-1.32kcal/mol)、D372F(-1.31kcal/mol)、S383C(-1.04kcal/mol)、E394G(-1.06kcal/mol)和D405L(-1.42kcal/mol)。

根据不同单点突变体设计相应的扩增引物，所有单点突变体扩增引物序列信息见序列表。不同突变体对应表达载体构建过程参照实验室前期方法进行，主要包括PCR产物扩增和转化大肠杆菌两部分。本专利涉及的21个突变体建方法相同，只是扩增引物不同。实验过程如下(以突变体K161W为例)：(1)以实施例2获得的表达载体pET22b-bmap1为模板，通过引物K161W-fw和K161W-rev进行PCR扩增，扩增体系如表5所示，扩增条件大致如下：98℃，预变性30秒，98℃变性5秒，50℃退火20秒，72℃延伸20秒，扩增33个循环；(2)将获得的PCR扩增产物，通过琼脂糖电泳进行分析，通过纯化试剂盒将目标PCR产物进行纯化；(3)将限制性内切酶DpnI加入纯化后的PCR产物，酶解反应2小时后，纯化回收，用于转化实验。

将纯化后的PCR产物转入大肠杆菌Top10，实验过程和实施例1所提到的转化方法一致，通过筛选测定，最终获得突变体K161W所对应的表达载体pET22b-k161w。采用相同的方法，分别获得其它20个突变体所对应的表达载体，分别是pET22b-a172f(突变体A172F)、pET22b-g200f(突变体G200F)、pET22b-d205f(突变体D205F)、pET22b-g206f(突变体G206F)、pET22b-q228i(突变体Q228I)、pET22b-n229f(突变体N229F)、pET22b-k234w(突变体K234W)、pET22b-a249y(突变体A249Y)、pET22b-n261w(突变体N261W)、pET22b-d262y(突变体D262Y)、pET22b-n263w(突变体N263W)、pET22b-s265c(突变体S265C)、pET22b-g266y(突变体G266Y)、pET22b-a290f(突变体A290F)、pET22b-n319w(突变体N319W)、pET22b-n321y(突变体N321Y)、pET22b-d372f(突变体D372F)、pET22b-s383c(突变体S383C)、pET22b-e394g(突变体E394G)和pET22b-d405l(突变体D405L)。

表5突变体PCR扩增体系

实施列6单点突变体热稳定性测定及组合突变体构建

实施例5将构建好的21个突变体表达载体分别转入大肠杆菌BL21，转化筛选、纯化以及活性测定过程均和实施例2一致。

不同突变体热稳定性测定如下：将纯化后的不同突变体在60℃热处理30分钟后，进行剩余酶活测定，整个实验过程以纯化后的重组氨肽酶BmAp为对照，实验结果如表6所示。由表6可知，突变体N261W、D262Y、N263W、E394G和D405L能够提升重组氨肽酶BmAp的热稳定性。这5个有效突变体N261W、D262Y、N263W、E394G和D405L在60℃热处理30分钟后，分别是出发模板(氨肽酶BmAp)的1.11倍、1.14倍、1.17倍、1.09倍和1.12倍。通过分析三维构象(图3)，发现5个有效突变体均处于无规则蜷曲区域。前期报道的许多研究表明，无规则蜷曲是蛋白最不稳定的区域，高温条件下，容易发生结构变化，从而导致蛋白变性失活。通过构建有效突变体N261W、D262Y、N263W、E394G和D405L，分别将氨肽酶BmAp自由能降低-1.06kcal/mol、-1.31kcal/mol、-1.06kcal/mol、-1.06kcal/mol和-1.42kcal/mol，从而有效提升其热稳定性。

表6不同单点突变体重组菌发酵酶活及热稳定性

将获得的有效突变体N261W、D262Y、N263W、E394G和D405L进行组合突变进一步提升热稳定性。由于N261W、D262Y和N263W三个突变体距离很近，因此首先将这三个突变体进行组合。突变体构建过程和实施例5一致，只是将扩增引物换成N261W-N263W-fw和N261W-N263W-rev。通过实验获得突变体N261W-D262Y-N263W所对应的表达载体pET22b-n261w-d262y-n263w。以表达载体pET22b-n261w-d262y-n263w为模板，进一步构建了突变体表达载体pET22b-n261w-d262y-n263w-e394g(对应突变体N261W-D262Y-N263W-E394G)、pET22b-n261w-d262y-n263w-d405l(对应突变体N261W-D262Y-N263W-D405L)和pET22b-n261w-d262y-n263w-e394g-d405l(对应突变体N261W-D262Y-N263W-E394G-D405L)。

分别将组合突变体表达载体转入大肠杆菌BL21，转化、筛选、培养和纯化均和实施例2一致。热稳定性测定方法和单点突变体一致。实验结果如表7所示。由表7可知，组合突变可以进一步提升热稳定性，其中组合突变体N261W-D262Y-N263W-E394G-D405L效果最好，60℃热处理30分钟后，剩余酶活为56.8％，是出发模板(氨肽酶BmAp)的1.61倍。为了便于书写，将最优突变体N261W-D262Y-N263W-E394G-D405L命名为BmApM，其对应的基因简称为bmapm。

表7不同单点突变体重组菌发酵酶活及热稳定性

实施列7突变体BmApM特性表征

突变体BmApM特性表征包括pH特性测定和温度特性测定，测定过程均和实施例4一致。

突变体BmApM的pH特性如图4A所示，突变体BmApM最适反应pH为8.0，在pH7.0至pH9.0之间，具有良好的活性，相对酶活均大于70％；此外突变体BmApM在pH6.0至pH9.0之间具有良好的稳定性，剩余酶活均大于80％。与氨肽酶BmAp的pH特性进行比较分析，发现组合点突变并没有改变其pH特性。

突变体BmApM的温度特性如图4B所示，突变体BmApM最适反应温度为55℃，相比于氨肽酶BmAp(图2B)，其最适反应温度提升了5℃，此外突变体BmApM在高温条件下的活性要好于氨肽酶BmAp；此外由图4B可知，相比于氨肽酶BmAp(图2B)，突变体BmApM的热稳定性得到有效提升，在60℃、65℃和70℃，水浴处理30分钟后，剩余酶活分别为57.2％、35.2％和16.3％，而氨肽酶BmAp在60℃、65℃和70℃，水浴处理30分钟后，剩余酶活分别仅为30.2％，8.1％和3.3％(图2B)。

实施例7重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM在毕赤酵母高效表达

以毕赤酵母X33为宿主，高效制备重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM。实验过程如下：(1)构建氨肽酶BmAp及突变体BmApM所对应的毕赤酵母表达载体pPICZαA-bmap1和pPICZαA-bmapm；(2)将表达载体pPICZαA-bmap和pPICZαA-bmapm分别转入毕赤酵母X33，通过筛选获得氨肽酶BmAp及突变体BmApM所对应的重组酵母工程菌种；(3)通过7L发酵罐，进行高密度发酵，高效制备重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM；(4)进行酶活性及总蛋白浓度测定。

表达载体pPICZαA-bmap1和pPICZαA-bmapm构建过程相同，实验过程如下(以表达载体pPICZαA-bmap1构建为例)：(1)以实施例2获得的载体pET-22b-bmap1，通过引物Xbmap1-fw和引物Xbmap1-rev进行PCR扩增，扩增体系和条件均和实施例2一致；(2)将扩增获得PCR产物，纯化回收后，通过无缝克隆的方式和载体pPICZαA进行连接反应；(3)将连接反应产物，转入大肠杆菌top10，通过菌液PCR获得阳性转化子，转化、筛选以及菌液PCR等反应均和实施例2一致；(4)通过测序验证，最终获得表达载体pPICZαA-bmap1。

将构建好的表达载体pPICZαA-bmap1和pPICZαA-bmapm，用限制性内切酶SacI线性化后，转入毕赤酵母X33。转化过程大致如下：(1)将酵母感受态细胞置于冰上放置20分钟；(2)加入3μg线性化后的表达载体，混匀冰上放置5分钟后进行电转化，电转化条件为1.5kV，400Ω；(3)电击完后立即加入0.6mL预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；(4)30℃，静止放置2小时后涂布于YPDZ平板，培养2～3天后观察转化子的情况。

转化子的筛选采用24孔板法，具体步骤如下：将YPDZ平板上的重组转化子用牙签逐个挑至每孔含有2mL BMGY培养基的24孔板，30℃，200rpm过夜培养24h后，4000rpm离心去掉上清，加入2mL的BMMY培养基，30℃，200rpm培养24h，测定重组氨肽酶活性。酶活测定过程和实施例3一致。通过筛选，重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM各获得一个酶活优势菌，分别命名为X33-BmAp和X33-BmApM，这两个菌在24孔的发酵酶活分别为8.5U/mL和9.6U/mL。

高密度发酵培养能够有效提升重组蛋白在毕赤酵母中的表达量，因此将重组工程菌X33-BmAp和X33-BmApM进行高密度发酵，进一步提升发酵酶活。

高密度发酵在7L发酵罐进行，实验过程如下：将单菌落重组酵母工程菌接入含有50mL YPG培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养。再将过夜培养的重组酵母工程菌按1％(v/v)的接种量接入含有100mL YPG培养基的500mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养，至OD600大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌按10％(v/v)的接种量接入含有3L BSM培养基的7L发酵罐中。重组酵母工程菌在7L发酵罐的培养条件为：温度为30℃、pH值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40L/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到一定的量(180g/L左右)，停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后(溶氧迅速上升)开始用甲醇诱导，甲醇的流加根据发酵时间进行调整：诱导前期(24小时至72小时)，甲醇添加量控制在0.75％；诱导中期(72小时至120小时)甲醇添加量控制在1.1％；诱导后期(120小时至168小时)甲醇添加量控制在1.3％。培养过程中每隔24小时取样，进行酶活和总蛋白浓度的测定。酶活的测定和实施例3一致。

由图5A可知，高密度发酵能够有效提升重组BmAp及突变体BmApM的表达量。重组工程菌X33-BmAp和X33-BmApM在7L发酵罐培养条件下，最高酶活分别为400.9U/mL和510.3U/mL，分别是24孔板的47.2倍和53.1倍。

由图5B和5C可知，重组工程菌X33-BmAp和X33-BmApM发酵液上清中，主要为重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM，便于下游后处理。

实施例8重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM应用效果

蛋白质分解成氨基酸的过程大致可分为两个环节：(1)蛋白质在内切蛋白酶的作用下分解成多肽；(2)肽酶将多肽进一步分解形成小肽和多种游离氨基酸。氨肽酶可以在氨基端将多肽的氨基酸进行水解，形成游离氨基酸。因此氨肽酶可以和内切蛋白酶进行组合，能够有效将蛋白质分解形成多种游离氨基酸，为下一步产业化应用奠定基础。

重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM应用效果实验大致如下：(1)用50mM pH9.0的Tris-HCl缓冲液配制2％的酪蛋白溶液，按照2000U/mL的添加量，加入碱性蛋白酶AprBpM(该酶来源于前期专利CN202210419863.7)，45℃反应3小时后，80℃热处理10分钟；(2)按照10U/mL的添加量，分别加入重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM，50℃反应2小时；(3)将反应水解液，8000rpm，10℃的条件下离心15分钟获得上清液进行游离氨基酸测定，游离氨基酸含量测定由广东省微生物分析检测中心完成。

重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM结合碱性蛋白酶AprBpM水解酪蛋白实验结果如表8所示，由表8可知，重组氨肽酶BmAp及突变体BmApM能够有效提升水解液中游离氨基酸的含量，二者所对应的水解液中游离氨基酸的含量分别为2754.3mg/L和2844.1mg/L，相比于单独碱性蛋白酶AprBpM水解(1137.8mg/L)，含量分别提升142.2％和150.1％。

表8不同酶解产物游离氨基酸组成比较(单位为mg/L)

最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种来源于莫海威芽孢杆菌的氨肽酶BmAp，其特征在于，所述氨肽酶BmAp的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述氨肽酶BmAp氨基酸序列的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种突变体BmApM，其特征在于，所述突变体BmApM以权利要求1所述氨肽酶BmAp为出发模板，通过对蛋白Loop区域优化获得。

4.如权利要求3所述的突变体BmApM，其特征在于，所述突变体BmApM的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种编码权利要求4所述突变体BmApM氨基酸序列的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种表达载体pPICZαA-bmap1，其特征在于，包含权利要求2所述的核苷酸序列。

7.一种表达载体pPICZαA-bmapm，其特征在于，包含权利要求5所述的核苷酸序列。

8.一种重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于，包含权利要求2或权利要求5所述的核苷酸序列。

9.如权利要求8所述的重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母X33。

10.一种如权利要求1所述的氨肽酶BmAp或权利要求3所述的突变体BmApM结合碱性蛋白酶在水解蛋白质中的应用。