CN114540330A - 一种碱性蛋白酶突变体AprBpM及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于酶工程及微生物工程领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体AprBpM及其应用。首先，本发明以碱性蛋白酶AprBp为出发模板，通过增加二硫键和点突变获得突变体AprBpM，本发明获得的碱性蛋白酶突变体AprBpM在70℃热处理5分钟后的酶活保留率是AprBp的3.52倍；其次，通过优化启动子和信号肽实现突变体AprBpM在枯草芽孢杆菌高效表达，在高密度发酵培养条件下最高酶活达到65230U/mL；最后，通过突变体AprBpM水解废弃虾蟹壳制备多肽应用于农业种植领域。

Description

一种碱性蛋白酶突变体AprBpM及其应用

技术领域

本发明属于酶工程及微生物工程领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体AprBpM及其应用。

背景技术

多肽作为一种新型生物刺激素能够促进植物生长、提高植物抗逆，在绿色农业种植发挥重要作用。目前氨基酸多肽制备方法主要分为化学法和酶法。相比于化学法，酶法具有反应条件温和，产物结构完好，绿色无污染等优势，因此酶法是目前最最推崇的方法。

蛋白酶能够水解蛋白原料制备氨基酸多肽，蛋白酶根据反应条件可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。在前期的研究中（专利公开号CN111893126A）我们对来自芽孢杆菌Bacillus patagoniensis的碱性蛋白酶（简称AprBp）进行重组表达和特性表征。碱性蛋白酶AprBp对许多蛋白原料（鱼粉、鸡肉粉、大豆蛋白粉等）具有良好的水解能力。但是较差的热稳定性以及较低的表达量限制了AprBp的产业化应用，因此需要定向的提升AprBp的热稳定性以及表达量，从而为其进一步应用奠定基础。在本发明中，首先以碱性蛋白酶AprBp为出发模板，通过增加理性设计获得突变体AprBpM。碱性蛋白酶突变体AprBpM在70℃热处理5分钟后的酶活保留率是AprBp的3.95倍。其次通过优化启动子和信号肽实现突变体AprBpM在枯草芽孢杆菌高效表达，在高密度发酵培养条件下最高酶活达到65230U/mL。最后通过突变体AprBpM水解废弃虾蟹壳制备多肽应用于农业种植领域。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种碱性蛋白酶突变体AprBpM及其应用。本发明获得的碱性蛋白酶突变体AprBpM，在70℃热处理5分钟后的酶活保留率为出发模板AprBp的3.95倍，有效提高了热稳定性。此外通过启动子、信号肽以及高密度发酵优化使突变体AprBpM最高发酵酶活达到65230U/mL。通过响应面优化使突变体AprBpM能够高效水解废弃虾蟹壳制备多肽应用于农业有机种植。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种碱性蛋白酶突变体AprBpM，所述碱性蛋白酶突变体AprBpM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

GCTGAAGAAGCTAAAGAAAAATACCTTATCGGCTTCACAGAACAAGAAGCTGTTTCTACATTCGTTGAACAAATCGAAGAAGAAGAAGTTTCTATCTCTGAAGTTGATGATGTTGAAATCGATCTTCTTTACGAATTCGAAACAATCCCTGTTCTTTCTGTTGAACTTAACCCTGAAGATGTTGCTTCTCTTGAATCTGATCCTGCTATCTCTTACATCGAAGAAGATGCTGAAGTTACAACAATGGCTCAATCTGTTCCTTGGGGCATCTCTCGTGTTTGTGCTCAATCTGCTCATAACCGTGGCATCACAGGCTCTGGCGTTAAAGTTGCTGTTCTTGATACAGGCATCTCTACACATGAAGATCTTAACGTTCGTGGCGGCGCTTCTTTCGTTGCTGGCGAACCTGGCTACCAAGATGGCAACGGCCATGGCACACATGTTGCTGGCACAATCGCTGCTCTTAACAACTCTATCGGCGTTCTTGGCGTTGCTCCTAACGCTGAACTTTACGCTGTTAAAGTTCTTGGCGCTTCTGGCTCTGGCTCTATCTCTGGCATCGCTCAAGGCCTTCAATGGGCTGGCAACAACGGCATGCATATCGCTAACATGTCTCTTGGCACATCTGCTCCTTCTGCTACACTTGAACAAGCTGTTAACGCTGCTACATCTCGTGGCGTTCTTGTTATCGCTGCTTCTGGCAACTCTGGCGCTGGCTCTGTTGGCTACCCTGCTCGTTACGCTAACGCTATGGCTGTTGGCGCTACAGATCAAAACAACAACCGTGCTTCTTTCTCTCAATACGGCGCTGGCCTTGATATCGTTGCTCCTGGCGTTGGCGTTCAATCTACATACCCTGGCAACCGTTACGCTTCTCTTAACGGCACATCTATGGCTACACCTCATGTTGCTGGCGTTGCTGCTCTTGTTAAACAAAAAAACCCTTCTTGGTCTAACGTTCAAGTTCGTAACCATCTTAAAAACACAACAAACCTTGGCAACACAAACCTTTACGGCTCTGGCCTTGTTAACGCTTGTGCTGCTACACGTTAA（SEQID NO.1）。

优选的，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

AEEAKEKYLIGFTEQEAVSTFVEQIEEEEVSISEVDDVEIDLLYEFETIPVLSVELNPEDVASLESDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVCAQSAHNRGITGSGVKVAVLDTGISTHEDLNVRGGASFVAGEPGYQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSISGIAQGLQWAGNNGMHIANMSLGTSAPSATLEQAVNAATSRGVLVIAASGNSGAGSVGYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVGVQSTYPGNRYASLNGTSMATPHVAGVAALVKQKNPSWSNVQVRNHLKNTTNLGNTNLYGSGLVNACAATR（SEQ ID NO.2）。

本发明的又一个目的是提供一种重组表达载体pHY-P_cry-SP_Bs1-aprbpm，包含上述所述的碱性蛋白酶突变体AprBpM的编码基因aprbpm、启动子P_cry和信号肽SP_Bs1。

所述启动子P_cry和信号肽SP_Bs1的序列如SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62所示。

本发明又一个目的是提供一种重组菌，包含所述的重组表达载体pHY-P_cry-SP_Bs1-aprbpm；所述重组菌为重组表达载体转化菌株得到的。

优选的，所述菌株为枯草芽孢杆菌。

优选的，所述菌株为枯草芽孢杆菌WB800N。

本发明的又一个目的是提供一种表达如上述所述碱性蛋白酶突变体AprBpM的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、通过三维建模软件SWISS-MODEL获得碱性蛋白酶突变体AprBp三维构象；

S2、通过结合二硫键设计软件bridgeD和Disulfide by Design确定目标二硫键突变体，通过筛选获得有效二硫键突变体；

S3、以有效二硫键突变体为模板，通过生物信息学软件Discovery studio2.5和B-factor分析突变体二硫键三维构象，删除Loop区域表面不稳定氨基酸，进一步获得热稳定性提升的突变体AprBp；

S4、对步骤S3所述的热稳定性提升的突变体AprB进行启动子优化和信号肽优化，进一步得到高效表达突变体AprBpM；

S5、在枯草芽孢杆菌中高效表达突变体AprBpM并测定其酶学特性。

本发明又一个目的是提供一种如上述所述的碱性蛋白酶突变体AprBpM在制备动物多肽中的应用。

优选的，所述动物多肽通过采用突变体AprBpM水解废弃虾蟹壳制备获得。

本发明最后一个目的是提供一种如上述所述碱性蛋白酶突变体AprBpM在农业有机种植中的应用，将所述碱性蛋白酶突变体AprBpM水解废弃虾蟹壳制备的多肽应用于农业有机种植。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种碱性蛋白酶突变体AprBpM及其应用。本发明获得的碱性蛋白酶突变体AprBpM，在70℃热处理5分钟后的酶活保留率是出发模板AprBp的3.95倍；本发明通过优化策略最终蛋白酶突变体AprBpM的发酵酶活达到65230U/mL；通过响应面优化，蛋白酶突变体AprBpM能够高效酶解废弃虾蟹壳制备多肽并应用于农业有机种植。

附图说明

图1为碱性蛋白酶AprBp及突变体AprBpM三维构象图；

图2为碱性蛋白酶AprBp及突变体AprBpM最适反应温度（A）和热稳定性（B）图；

图3为启动子和信号肽优化线路图；

图4为重组工程菌高密度发酵图；

图5为碱性蛋白酶突变体AprBpM酶解虾蟹壳单因素优化图；

图6为碱性蛋白酶突变体AprBpM酶解虾蟹壳响应面图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明中涉及到的实验材料和试剂：

1.菌株与载体

大肠杆菌菌株Top10购自深圳辉诺生物科技有限公司、枯草芽孢杆菌WB800N购自深圳辉诺生物科技有限公司、pHY-P₄₃-aprbp表达载体由前期实验（专利公开号：CN111893126A记载的方法）构建，构建过程如下：

将来源于Bacillus patagoniensis（GenBank: WP_078392427.1）的碱性蛋白酶根据枯草芽孢杆菌密码子进行优化；将优化后的基因aprbp连接至表达载体pHY-P₄₃获得表达载体pHY-P₄₃-aprbp。

2.酶与试剂盒

Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司；质粒提取试剂盒（#DP103-03），胶纯化试剂盒（#DP209-02）购自天根生化科技(北京)有限公司；Taq酶MIX（EmeraldAmp®MAX PCR MasterMix）购自宝日医生物技术(北京)有限公司；四环素和氨苄青霉素购自麦克林试剂公司。

3.培养基

大肠杆菌培养基为LB（1%（w/v）蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物，1%（w/v）NaCl，pH7.0）。LBA为LB培养基加入氨苄青霉素，浓度为25μg/mL，LBT为LB培养基加入四环素，浓度为50μg/mL。

枯草芽孢摇瓶发酵培养基为麦芽糖培养基，其组成成分如下：酵母浸膏2.5%、蛋白胨1.5%、麦芽糖4%、柠檬酸钠1%、氯化钙0.3%、磷酸氢二钾1%。

高密度发酵培养基，其组成成分如下：麦芽糖7%、豆粕2.5%、酵母粉1.5%、麸皮2%、磷酸氢二钾1%、柠檬酸三钠0.3%、氯化钙0.3%。

实施例1 二硫键理性设计提升碱性蛋白酶AprBp热稳定性

通过在线软件SWISS-MODEL同源建模获得碱性蛋白酶AprBp三维构象，通过在线软件MolProbity和QMEANDisCo Global分析，表明获得的三维构象结构准确，可用于下一步分析研究。通过分子动力学模拟软件Gromacs对AprBp三维构象进行分子动力学模拟，发现碱性蛋白酶AprBp存在多个蛋白柔性区域。增加蛋白质柔性区域的刚性能够提升其热稳定性，因此在本专利中首先拟通过增加二硫键提升碱性蛋白酶AprBp的热稳定性。通过在线软件Disulfide by Design 2.0（参考网址：

）和BridgeD（参考网址：

）预测分析碱性蛋白酶AprBp不同氨基酸之间二硫键成键的可能性。通过结合两种软件预测结果，最终选择10对二硫键突变体进行实验，这10对二硫键分别为Q94C-E347C、Y138C-A172C、A153C-A168C、N235C-F265C、L272C-G340C、S106C-N167C、A165C-G305C、A188C-A218C、L228C-N319C、W317C-Q321C。

分别设计引物和构建突变体，其中，10对二硫键引物序列信息如下表1（SEQ IDNO.3-40）所示，二硫键突变体的构建过程如下：

（以突变体Q94C-E347C为例，其他以此类推）：以构建好的pHY-P₄₃-aprbp为模板，先用上下游引物Q94C-fw和Q94C-rev进行PCR扩增，所述PCR反应体系如下表2所示，琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物。PCR产物回收过程大致如下：（1）将目标产物进行切胶放入2mL离心管；（2）加入溶胶液，在60℃条件下反应10分钟；（3）将第二步的溶胶液体加入收集管，10000rpm离心1分钟；（4）用75%乙醇洗两次后晾干；（5）加入50μL水，离心3分钟。

表1 二硫键突变体引物序列表

表2 PCR反应体系

PCR反应程序如下：

模板质粒pHY-P₄₃-aprbp的存在会导致转化以及菌液PCR的时候出现假阳性，因此需要去掉模板质粒pHY-P₄₃-aprbp。用限制性内切酶DpnI将pHY-P₄₃-aprbp分解。将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，具体的菌液PCR验证实验步骤为：用高压灭菌的牙签挑取单个菌落至含有500μL的LBA培养基中37℃，200rpm培养4小时；吸取2μL菌液作为PCR的模板，PCR反应体系如表3所示；菌液PCR所用引物为aprbp-fw和aprbp-rev；所述引物aprbp-fw和引物aprbp-rev的序列信息如下SEQ ID NO.41和SEQ IDNO.42所示；其中，反应体系如下表3所示，PCR扩增条件为95℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，33循环，电泳后，观察结果，对阳性的结果相对应的平板上的菌落进行测序。

GCTGAAGAAGCTAAAGAAAAA（SEQ ID NO.41）；

ACGTGTAGCAGCTTCAGC GTTAACA（SEQ ID NO.42）。

表3 菌液PCR反应体系

按照相同的方法以Q94C突变体质粒pHY-P₄₃-aprbp-q94c为模板，用引物E347C-fw和E347C-rev进行PCR扩增，纯化，转化大肠杆菌Top10，使用天根生化科技(北京)有限公司质粒提取试剂盒（#DP103-03）提取质粒，测序，最终获得突变体Q94C-E347C所对应的表达载体pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c。将测序正确的突变体，转入枯草芽孢杆菌WB800N。

重组枯草芽孢杆菌构建过程第一步是制备感受态细胞，枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞制备过程大致如下：（1）从37℃培养16-20小时的平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm)，转到一个含有5mL LB培养基的50mL离心管中，37℃剧烈振摇过夜；（2）1%接种量接种于50mL GM（LB+0.5M山梨醇），测量摇管内OD，控制好接种量，使接种后培养基的OD在0.19-0.2之间。37℃，200rpm培养至OD600=0.8-1.0（大约3-4小时）左右；（3）取全部菌液冰水浴10分钟，然后5000rpm，8分钟，4℃离心收集菌体；（4）用30mL预冷的电转缓冲液ETM（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油，可以加入0.5M海藻糖提高效率）洗涤菌体，5000rpm，8分钟，4℃离心去上清，如此漂洗3次；（5）将洗涤后的菌体重悬于等500μL的ETM中，每管分装100μL；

将制备好的枯草芽孢杆菌WB800N感受态进行电转化实验，电转化过程如下：（1）将100μL感受态细胞中加入1-6μL不同二硫键突变体表达载体，冰浴孵育5分钟，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。电转仪设置：1.5-2.0kv，25μF，200Ω，1mm，电击1次。（持续时间4.5ms-5ms之间）；（2）电击完毕立即加入0.5mL复苏培养基RM（LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇），37℃，120rpm，复苏3h后，将转化物涂布于LBT固体平板，37℃过夜培养。

实施例2 二硫键突变体筛选

用牙签逐个将二硫键枯草芽孢重组转化子挑至每孔含有1.6mL麦芽糖培养基的24孔板中，37℃，200rpm培养24h后，离心取上清进行酶活测定。每个二硫键突变体挑选一个酶活最高的重组工程菌种进行摇瓶培养。摇瓶培养在250mL三角瓶中进行，首先将相应的重组工程菌种接入含有5mL麦芽糖培养基的50mL离心管中，30℃，220rpm培养24小时左右，将培养好的重组枯草芽孢工程菌种按1%（v/v）的接种量接入含有50mL麦芽糖培养基的250mL三角瓶中。摇瓶培养条件为37℃，200rpm，培养48小时后取样进行活性测定和热稳定性测试。

碱性蛋白酶活性测定参照国标GB/T 23527-2009进行，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，用U表示。

热稳定性测试方法如下：将发酵上清酶液稀释5倍，将稀释好的酶液在70℃水浴保温5分钟后进行残留酶活测定，以没有热处理的样品作为对照。原始AprBp及二硫键突变体重组菌摇瓶培养48小时酶活及初步热稳定性如表4所示。

由表4可知，10对二硫键突变体中，只有突变体Q94C-E347C能够提升AprBp的热稳定性，在70℃水浴保温5分钟后，突变体Q94C-E347C剩余酶活为65.5%，相比出发模板其热稳定性提升了252.1%。

表4 不同二硫键摇瓶酶活及热稳定性

实施例3 删除Loop区域表面不稳定氨基酸提升热稳定性

有研究表明删除蛋白表面Loop区域不稳定氨基酸能够提升重组蛋白热稳定性。通过生物信息学软件Discovery studio2.5和B-factor预测分析，可以找到目标蛋白不稳定氨基酸。本专利以突变体Q94C-E347C为出发模板，通过生物信息学软件Discoverystudio2.5和B-factor分析突变体Q94C-E347C三维构象找出其前20个最不稳定氨基酸，其中G127、G143、A238、G269、A330、G334和G340位于Q94C-E347C蛋白表面Loop区域，因此通过构建删除Loop区域不稳定氨基酸的突变体进一步提升热稳定性，其中，构建删除Loop区域不稳定氨基酸突变体所用引物如表5（SEQ ID NO.43-SEQ ID NO.56）所示。

表5 删除Loop区域不稳定氨基酸突变体引物序列表

删除Loop区域不稳定氨基酸突变体表达载体的构建过程同实施列1二硫键突变体构建过程一致，大致如下：（1）以表达载体pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c为模板，通过删除Loop区域不稳定氨基酸突变体的引物进行PCR扩增，纯化回收PCR产物；（2）用限制性内切酶DpnI处理纯化PCR产物后转入大肠杆菌Top10；（3）菌液PCR验证获得阳性转化子，通过测序验证从而获得不同的删除Loop区域不稳定氨基酸突变体的表达载体，包括：pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c-D_G127、pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c-D_G143、pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c-D_A238、pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c-D_G269、pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c-D_A330、pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c-D_G334和pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c-D_G340。

不同的删除Loop区域不稳定氨基酸突变体的重组枯草芽孢杆菌的构建过程和实施列1一致，将不同的删除Loop区域不稳定氨基酸突变体的表达载体通过电转化转入枯草芽孢杆菌WB800N，重组转化子的筛选和实施列2一致，实验结果如表6所示。由表6可知，实验构建的7个删除Loop区域不稳定氨基酸的突变体，只有突变体Q94C-E347C-D_A330能够进一步提升碱性蛋白酶AprBp的热稳定性，在70℃水浴保温5分钟后，突变体Q94C-E347C-D_A330剩余酶活为73.6%，是二硫键突变体Q94C-E347C的1.12倍，是碱性蛋白酶AprBp的3.95倍。

表6 不同删除Loop区域不稳定氨基酸突变体摇瓶酶活及热稳定性

实施例4 突变体温度特性

将热稳定性提升的突变体Q94C-E347C-D_A330命名为AprBpM，取AprBp和突变体AprBpM所对应的发酵液进行热稳定性测定。首先离心获得上清液，其次通过10kDa（Millipore，MWCO10kD）超滤管进行浓缩和纯化。纯化后的上清酶液分别进行最适反应温度和热稳定性测定。

最适反应温度测定方法大致如下：分别测定AprBp和突变体AprBpM在40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃和80℃的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100%，计算其他温度下的相对酶活，实验结果如图2A所示。

由图2A可知，出发模板AprBp的最适反应温度为60℃，突变体AprBpM的最适反应温度为60℃。此外在60℃至75℃范围内，突变体AprBpM的相对酶活均高于AprBp。

热稳定性测定方法大致如下：在40℃，50℃，60℃，70℃和80℃条件下水浴保温5分钟后测定剩余酶活，以没有做热处理样品的酶活为100%，计算其他温度下的相对剩余酶活。实验结果如图2B所示。

由图2B可知，在40℃至60℃范围内，AprBp和突变体AprBpM均具有较好的热稳定性，剩余酶活均大于80%；当热处理温度大于60℃时，AprBp剩余酶活急剧下降，在70℃和80℃热处理5分钟，AprBp剩余酶活分别为18.6%和2.6%。突变体AprBpM在70℃和80℃热处理5分钟后的剩余酶活分别为73.5%和21.3%，分别是出发模板AprBp的3.95倍和8.19倍。

实施例5 启动子优化

以实施列4构建好的突变体AprBpM表达载体pHY-P₄₃-aprbp-q94c/e347c-D_A330（简称pHY-P₄₃-aprbpm）为模板，分别构建不同启动子表达载体。筛选的启动子包括：P_Bsamy（枯草芽孢杆菌中温淀粉酶启动子）、P_gsib（来源于枯草芽孢杆菌）、P_Bsapr（枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子）、P_Bsnpr（枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子）和P_cry（苏云金芽孢杆菌结晶蛋白启动子），启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.61所示，所有启动子序列均由安徽通用生物公司进行合成，基因合成过程中在启动子序列两端均加上了XbaI和Hind III酶切位点，其中，SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.61中波浪线为XbaI酶切位点，下划线部分为HindIII酶切位点。

TCTAGACCGAGAATGGACACCAAAGAAGAACTGCAAAAACGGGTGAAGCAGCAGCGAATAGAATCAATTGCGGTCGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTTACGATGTACGACAGGGGGATTCCCCATACATTCTTCGCTTGGCTGAAAATGATTCTTCTTTTTATCGTCTGCGGCGGCGTTCTGTTTCTGCTTCGGTATGTAATTGTGAAGCTGGCTTACAGAAGAGCGGTAAAAGAAGAAATAAAAAAGAAATCATCTTGAAAAATAGATGGTTTCTTTTTTTGTTTGGAAAGCGAGGGAAGCGTTCACAGTTTCGGGCAGCTTTTTTTATAGGAACATTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTGTTTTGATAGAGTGATTGTGATAATTTAAAATGTAAGCGTTAACAAAATTCTCCAGTCTTCACATCAGTTTGAAAGGAGGAAGCGGAAGAATGAAGTAAGAGGGATTTTTGACTCCGAAGTAAGTCTTCAAAAAATCAAATAAGGAGTGTCAAGAAAGCTT（SEQ ID NO.57）；

TCTAGAGATCAAGACCGTACATATAAGAATGTCGCTTCTCAAATCCAAGGCTGGCGAGAAGTCGTTTTGGGCTATCGAGACACGTTTGGCTGGAAAAAACTTTTCCAGATAGTGCCGGTTGCCGGAATGGTTTTTGGCGCCGCTGCCAATCGCTCAACATTAAACGACATTACCGAGACAGGCATGATGCTGTACAAAAAGAGGCGCATTCTTGAACGACTGAAAGAAACAGAACGAGAGATGGAATAGCAGAAAGCAGACGGACACCGCGATCCGCCTGCTTTTTTTAGTGGAAACATACCCAATGTGTTTTGTTTGTTTAAAAGAATTGTGAGCGGGAATACAACAACCAACACCAATTAAAGGAGGAATTCAAAAAGCTT（SEQ ID NO.58）；

TCTAGAGTTCTTTTCTGTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTCTACGGAAATAGCGAGAGATGATATACCTAAATAGAGATAAAATCATCTCAAAAAAATGGGTCTACTAAAATATTATTCCATCTATTACAATAAATTCACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAACTTAAGCAAAAGGAGAGGGACGCGTAAGCTT（SEQ ID NO.59）；

TCTAGACACTAAACAGCAAGTCATATCTGTCCGTCCTTCCTTTTTTCCGCCAAGTGCTGTTTCAGCTGCATTCTCGCCCTGTACAGGGTGCTCTTCACCTTCGAAAGACTCCAGTCCAAAACATCTGCAATCTCTTCGTAAGACAGCTCTTGAAATATCTGTCGAAATGCTGAATAAAATGACTGAAAATCTCTGACATCTGAAACAATCCTTTTCGTTTATTAAGGCCTCACCCGTTTAGACAAACGGCTATAAAAAAAGTTTTACAAATCGGAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCGACTTCATTTGTCATTTTTTTCAGAATAAATCGCATCATTCGACTCATGTCTGATTCAACACGTGCCTCTCGGCTTATCCCCCGATGCTGGCCTCCGGAAGCCTTTCCGGGACGATTCTATCAATTCATCAGCGGAGTCTAGTTTTATATTGCAGAATGAGAGAATGCTGGTTTATTATAACAATATAAGTTTTCATTATTTTCAAAAAGGGGGATTTATTAAG CTT（SEQ ID NO.60）

TCTAGACGAAACGTAAGATGAAACCTTAGATAAAAGTGCTTTTTTTGTTGCAATTGAAGAATTATTAATGTTAAGCTTAATTAAAGATAATATCTTTGAATTGTAACGCCCCTCAAAAGTAAGAACTACAAAAAAAGAATACGTTATATAGAAATATGTTTGAACCTTCTTCAGATTACAAATATATTCGGACGGACTCTACCTCAAATGCTTATCTAACTATAGAATGACATACAAGCACAACCTTGAAAATTTGAAAATATAACTACCAATGAACTTGTTCATGTGAATTATCGCTTTATTTAATTTTCTCAATTCAATATATAATATGCCAATACATTGTTACAAGTAGAAATTAAGACACCCTTGATAGCCTTACTATACCTAACATGATGTAGTATTAAATGAATATGTAAATATATTTATGATAAGAAGCGACTTATTTATAATCATTACATATTTTTCTATTGGAATGATTAAGATTCCAATAGAATAGTGTATAAATTATTTATCTTGAAAGGAGGGATGCCTAAAAACGAAGAACATTAAAAACATATATTTGCACCGTCTAATGGATTTATGAAAAATCATTTTATCAGTTTGAAAATTATGTATTATGAAAAGAAGCTT（SEQ ID NO.61）。

不同启动子表达载体构建过程如下（以pHY-P_Bsamy-aprbpm为例，其它类同）：

首先用限制性内切酶XbaI和Hind III分别酶切表达载体pHY-P₄₃-aprbpm和合成的启动子P_Bsamy质粒；其次通过琼脂糖凝聚分别回收主框架（不含有启动子P₄₃）以及P_Bsamy启动子，并且将P_Bsamy启动子连接至主框架，转入大肠杆菌Top10；最后通过菌落PCR、测序验证确定获得表达载体pHY-P_Bsamy-aprbpm。依此方法分别获得pHY-P_Bsamy-aprbpm、pHY-P_gsib-aprbpm、pHY-P_Bsapr-aprbpm、pHY-P_Bsnpr -aprbpm和pHY-P_cry-aprbpm，共5个表达载体。

采用实施例1相同的转化方法，将5个不同启动子表达载体分别转入枯草芽孢杆菌WB800N。转化子的筛选和实施例2一致，5个不同启动子表达载体所对应重组菌的酶活如表5所示。由表7可知，P_Bsamy（枯草芽孢杆菌中温淀粉酶启动子），P_gsib（来源于枯草芽孢杆菌）、P_Bsapr（枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子），P_Bsnpr（枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子）和P_cry（苏云金芽孢杆菌结晶蛋白启动子）所对应重组菌的酶活均要好于启动子P_cry所对应的重组菌。其中启动子P_cry效果最好，因此选择其进行下一步的研究。

表7 不同二硫键摇瓶酶活及热稳定性

实施例6 信号肽优化

以实施列5构建好的表达载体pHY-P_cry-aprbpm为模板，进行信号肽优化，所选信号肽包括：SP_Bs1（枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽）、SP_Bs2（枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽）、SP_Bs3（枯草芽孢杆菌中温淀粉酶信号肽）、SP_Bs4（枯草芽孢杆菌氨肽酶信号肽）和SP_Bs5（枯草芽孢杆菌几丁质酶信号肽），信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO.62～SEQ ID NO.66所示。

ATGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTTGCTGTCGCTGCTTCGTTTATGAGTTTATCAATCAGCCTGCCAGGTGTTCAGGCT（SEQ ID NO.62）；

ATGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCT（SEQ ID NO.63）；

ATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTCATTTGGTTCTGGCAGGACCGGCGGCTGCGAGTGCT（SEQ ID NO.64）；

ATGAAAAAGCTTTTGACTGTCATGACGATGGCTGTTTTAACTGCCGGCACACTGCTCTTGCCGGCACAGAGTGTCACCCCTGCCGCGCACGCT（SEQ ID NO.65）；

ATGAAAAAAGTGTTTTCAAACAAAAAGTTTCTCGTTTTTTCTTTCATTTTTGCGATGATTTTAAGTCTGTCTTTTTTTAATGGGGAAAGTGCAAAAGCC（SEQ ID NO.66）。

分别设计引物和构建不同信号肽表达载体，其中，5对信号肽合成引物序列信息如下表8（SEQ ID NO.67-SEQ ID NO.78）所示。

不同信号肽表达载体构建过程如下（以pHY-P_cry-SP_Bs1-aprbpm为例，其它类同）：（1）以表达载体pHY-P_cry-aprbpm为模板，通过引物S-fw和S-rev扩增获得主框架；（2）以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，通过引物SP_Bs1-fw和SP_Bs1-rev，进行PCR扩增获得信号肽SP_Bs1；（3）采用无缝克隆将SP_Bs1和主框架进行连接获得表达载体pHY-P_cry-SP_Bs1-aprbpm。依此方法分别获得pHY- P_cry-SP_Bs2-aprbpm、pHY-P_cry-SP_Bs3-aprbpm、pHY-P_cry-SP_Bs3-aprbpm、pHY- P_cry-SP_Bs4-aprbpm和pHY-P_cry-SP_Bs5-aprbpm，共5个表达载体。

表8不同信号肽扩增引物

采用实施例1相同的转化方法，将5个不同信号肽表达载体分别转入枯草芽孢杆菌WB800N，以表达载体pHY-P_cry-aprbpm作为对照。转化子的筛选和实施例2一致，5个不同信号肽表达载体所对应重组菌的酶活如表9所示。由表9可知，信号肽SP_Bs2所对应的重组菌酶活最高，培养48小时后，发酵酶活达到2256U/mL。此外，以表达载体P_cry-SP_Bs2-aprbpm所对应的重组菌Ap3作为下一步高密度发酵的实验菌种。

表9 不同信号肽重组菌酶活

实施例7 高密度发酵优化

重组工程菌Ap3高密度发酵在7升发酵罐进行，具体过程大致如下：将单菌落接入含有50mL麦芽糖培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养。再将过夜培养的重组工程菌Ap3按1%（v/v）的接种量接入含有100mL麦芽糖培养基的500mL三角瓶中，37℃，200rpm振荡过夜培养。将二次过夜培养的重组工程菌Ap3按10%（v/v）的接种量接入含有3L麦芽糖培养基的7L发酵罐。

对重组工程菌在7L发酵罐的培养条件进行优化，首先进行发酵温度的优化，发酵温度分别设置为30℃、33℃和37℃，pH控制在6.0、搅拌速度为500rpm。由图4A可知，当发酵温度为37℃时，效果最好发酵酶活达到48510U/mL。

在最适培养温度的基础上进行培养pH优化，培养过程中发酵温度为37℃，搅拌速度为400rpm，pH分别设置为5，6，7和8。由图4B可知，当发酵pH为7.0时，效果最好，发酵酶活达到53210U/mL。

在最适培养温度和pH的基础上，进行培养基还原糖浓度的优化，培养过程中发酵温度为37℃，发酵pH为7.0，搅拌速度为400rpm。还原糖含量分别控制在0.5%，1.0%，1.5%和2%。由图4C可知，还原糖含量为1.5%时，效果最好，发酵酶活达到65230U/mL。

实施例8 突变体AprBpM水解虾蟹壳制备多肽优化

突变体AprBpM水解虾蟹壳制备多肽，单因素优化所用酶为实施列7高密度发酵获得的酶液，虾蟹壳则是购自山东省晓旭贸易有限公司。单因素实验，包括底物含量的优化、酶添加量优化、反应pH优化、反应温度优化、反应时间优化。实验过程大致如下：（1）将虾蟹壳在100℃进行烘干后，粉碎，过100目筛；（2）总反应体系是50mL，根据实验需求加入相应的虾蟹壳粉、酶液、缓冲液，反应条件为150rpm，根据实验需求分别在不同温度进行实验；（3）根据多肽的形成量判断水解效果。

多肽的含量参照Lowry法进行检测，大致如下：（1）碱性铜溶液制备：量取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液各0.5mL，4%碳酸钠溶液与0.8%氢氧化钠溶液各25mL，摇匀，即得；（2）取稀释好的样品0.2mL，加入碱性铜溶液1mL，室温放置10min；（3）加入0.1mL福林酚溶液，室温反应30min后在OD650nm下测定吸光值；（4）根据吸光值计算多肽含量。

首先进行底物含量的优化，虾蟹壳含量分别设置为5%、10%、15%、20%和25%，酶添加量为300U/mL，反应温度为40℃，反应初始pH为9.0，150rpm，反应时间为2小时。实验结果如图5A所示，由图5A可知，底物含量越高，多肽形成率越低，5%、10%、15%、20%和25%底物含量所对应的多肽生产率分别为73.3%、62.2%、56.5%、48.7%和44.1%。综合考虑分析，最终选择底物含量为10%进行下一步的实验。

在底物含量实验结果基础上进行酶添加量的优化，酶添加量分别设置为100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、1000U/mL、1500U/mL和2000U/mL。底物含量10%，反应温度为40℃，反应初始pH为9.0，150rpm，反应时间为2小时，实验结果如图5B所示。由图5B可知，随着酶添加量的增加，多肽生成率逐渐增加，当酶添加量为2000U/mL时，多肽生成率最高为65.5%。酶添加量300U/mL、400U/mL、500U/mL和1000U/mL的多肽生成率分别为61.3%、62.1%、62.8%和62.3%。从用酶成本角度考虑，最终选择酶添加量为300U/mL。

在底物含量和用酶量的基础上进行反应pH优化，反应pH分别设置为7.0、8.0、9.0、10.0以及11.0。底物含量10%，酶添加量300U/mL，反应温度为40℃，150rpm，反应时间为2小时，实验结果如图5C所示。由图5C可知，随着初始pH的增加，多肽生成率逐渐增加，当pH为11.0时，多肽生成率最高为63.3%，其次为pH10.0和pH9.0，分别为62.1%和61.5%。考虑到实际应用，最终选择pH9.0进行下一步实验。

在底物含量、用酶量、最适pH的基础上进行反应温度优化，反应温度分别设置为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃。底物含量10%，酶添加量300 U/ml，反应pH9.0，150rpm，反应时间为2小时，实验结果如图5D所示。由图5D可知，反应温度45℃时效果最好，多肽生成率达到65.2%。因此选择45℃进行下一步的实验。

在底物含量、用酶量、最适pH以及最适反应温度的基础上进行反应时间优化，反应时间设置为1小时、2小时和3小时。底物含量10%，酶添加量400U/mL，反应pH9.0，反应温度45℃，150rpm，实验结果如图5E所示。由图5E可知，反应3小时效果最好，多肽生成率为66.1%，其次为2小时，多肽生成率65.2%。

实施例9 突变体AprBpM水解虾蟹壳制备多肽响应面优化

在实施例8单因素的基础上，固定酶解pH9.0，转速150rpm，进行响应面优化实验。采用Design Expert10.0软件，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以酶添加量（A），底物含量（B），反应时间（C）以及反应温度（D）四个为考察因素，以多肽形成率（R）为响应值，设计四因素三水平的响应面实验，进行二次多元回归方程拟合及其优化分析。响应面实验因素水平和响应面设计及结果如表10和表11所示。

表10 响应面试验因素水平

表11 响应面设计及实验结果

利用Design Expert 10.0软件对表11数据进行多元回归拟合，响应值与各因素之间的二次多元回归方程如下：R₁=61.66+3.33*A-12.77*B+6.19*C+6.30*D-2.26*AB-0.25*AC+1.39*AD-2.23*BC+2.03*BD+0.67*CD-1.54*A²+2.45*B²-3.07*C²-1.67*D²。表11各个因素对多肽形成率的影响如图6所示。此外通过Design Expert 10.0根据表11实验结果，预测获得虾蟹壳最佳水解条件为：酶添加量为385.66U/mL，底物浓度为8.51%，反应时间为2.94小时，反应温度为46℃，在此条件下多肽形成率为75.5%。根据Design Expert 10.0预测获得最佳水解条件，进行了5次水解验证，水解反应体系为200mL，水解率分别为73.5%，74.2%，76.1%，75.3%和74.3%，与预测值相近，表明获得的模型能够较好的预测各因素与响应值之间的影响关系。

为了能够进一步验证该水解工艺的效果，将反应体系扩大到30升，水解实验在50升发酵罐进行，实验过程大致如下：首先加入pH9.0缓冲液27升，其次加入虾蟹壳粉2.553公斤和151毫升突变体酶液，将pH调整至9.0，在46℃，反应2.94小时后进行多肽形成率测定。通过实验验证，在50升发酵条件下，多肽形成率达到77.8%。

实施例10 水解产物应用于种植实验

以小白菜为研究对象，研究实施列9获得的虾蟹壳多肽水解产物对水培小白菜生根促长的应用效果。实验采用水培法，将小白菜种子放置于实验室水培培养瓶中，采用基础营养液进行水培。虾蟹壳多肽水解产物稀释2000倍、3000倍、4000倍、5000倍以及6000倍进行实验，以基础营养液培养组作为对照，定期测定根系长度、植株重量。实验结果如表12所示，由表12可知，添加虾蟹壳多肽水解产物能够促进小白菜生根和生长，培养35天后，添加虾蟹壳多肽水解产物实验组小白菜的根长和鲜重均高于对照组。其中稀释4000倍效果最明显，该组小白菜的鲜重和根长分别为25.3g和48.6厘米，相比对照组分别提升47.1%和60.9%，说明样品对小白菜有较好的促长和增产作用。

表12 虾蟹壳多肽水解产物小白菜种植实验

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳润康生态环境股份有限公司

<120> 一种碱性蛋白酶突变体AprBpM及其应用

<130> 2022/4/2

<160> 78

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> 碱性蛋白酶突变体AprBpM的氨基酸序列（Amino acid sequence of alkalineprotease mutant AprBpM）

<400> 1

gctgaagaag ctaaagaaaa ataccttatc ggcttcacag aacaagaagc tgtttctaca 60

ttcgttgaac aaatcgaaga agaagaagtt tctatctctg aagttgatga tgttgaaatc 120

gatcttcttt acgaattcga aacaatccct gttctttctg ttgaacttaa ccctgaagat 180

gttgcttctc ttgaatctga tcctgctatc tcttacatcg aagaagatgc tgaagttaca 240

acaatggctc aatctgttcc ttggggcatc tctcgtgttt gtgctcaatc tgctcataac 300

cgtggcatca caggctctgg cgttaaagtt gctgttcttg atacaggcat ctctacacat 360

gaagatctta acgttcgtgg cggcgcttct ttcgttgctg gcgaacctgg ctaccaagat 420

ggcaacggcc atggcacaca tgttgctggc acaatcgctg ctcttaacaa ctctatcggc 480

gttcttggcg ttgctcctaa cgctgaactt tacgctgtta aagttcttgg cgcttctggc 540

tctggctcta tctctggcat cgctcaaggc cttcaatggg ctggcaacaa cggcatgcat 600

atcgctaaca tgtctcttgg cacatctgct ccttctgcta cacttgaaca agctgttaac 660

gctgctacat ctcgtggcgt tcttgttatc gctgcttctg gcaactctgg cgctggctct 720

gttggctacc ctgctcgtta cgctaacgct atggctgttg gcgctacaga tcaaaacaac 780

aaccgtgctt ctttctctca atacggcgct ggccttgata tcgttgctcc tggcgttggc 840

gttcaatcta cataccctgg caaccgttac gcttctctta acggcacatc tatggctaca 900

cctcatgttg ctggcgttgc tgctcttgtt aaacaaaaaa acccttcttg gtctaacgtt 960

caagttcgta accatcttaa aaacacaaca aaccttggca acacaaacct ttacggctct 1020

ggccttgtta acgcttgtgc tgctacacgt taa 1053

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> 碱性蛋白酶突变体AprBpM的多聚核苷酸序列（Polynucleotide sequence ofalkaline protease mutant AprBpM）

<400> 2

Ala Glu Glu Ala Lys Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Thr Glu Gln Glu

1 5 10 15

Ala Val Ser Thr Phe Val Glu Gln Ile Glu Glu Glu Glu Val Ser Ile

20 25 30

Ser Glu Val Asp Asp Val Glu Ile Asp Leu Leu Tyr Glu Phe Glu Thr

35 40 45

Ile Pro Val Leu Ser Val Glu Leu Asn Pro Glu Asp Val Ala Ser Leu

50 55 60

Glu Ser Asp Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr

65 70 75 80

Thr Met Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Cys Ala Gln

85 90 95

Ser Ala His Asn Arg Gly Ile Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val

100 105 110

Leu Asp Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly

115 120 125

Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Pro Gly Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His

130 135 140

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

145 150 155 160

Val Leu Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

165 170 175

Gly Ala Ser Gly Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Gln

180 185 190

Trp Ala Gly Asn Asn Gly Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Thr

195 200 205

Ser Ala Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ala Ala Thr Ser

210 215 220

Arg Gly Val Leu Val Ile Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser

225 230 235 240

Val Gly Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr

245 250 255

Asp Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu

260 265 270

Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Gly Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn

275 280 285

Arg Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala

290 295 300

Gly Val Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val

305 310 315 320

Gln Val Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Thr Asn Leu Gly Asn Thr Asn

325 330 335

Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Cys Ala Ala Thr Arg

340 345 350

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Q94C-fw

<400> 3

gggcatctct cgtgtttgtg ctcaatctgc tca 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Q94C-rev

<400> 4

tgagcagatt gagcacaaac acgagagatg ccc 33

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> E347C-fw

<400> 5

gccttgttaa cgcttgtgct gctacacgtc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> E347C-rev

<400> 6

gacgtgtagc agcacaagcg ttaacaaggc 30

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Y138C-fw

<400> 7

gcgaacctgg ctgtcaagat ggcaacgg 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Y138C-rev

<400> 8

ccgttgccat cttgacagcc aggttcgc 28

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> A172C-fw

<400> 9

cgctgaactt tactgtgtta aagttcttgg cgc 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> A172C-rev

<400> 10

gcgccaagaa ctttaacaca gtaaagttca gcg 33

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> A153C-fw

<400> 11

tgctggcaca atctgtgctc ttaacaactc ta 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> A153C-rev

<400> 12

tagagttgtt aagagcacag attgtgccag ca 32

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> A168C-fw

<400> 13

gttgctccta actgtgaact ttacgctgtt aa 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> A168C-rev

<400> 14

ttaacagcgt aaagttcaca gttaggagca ac 32

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> N235C-fw

<400> 15

tcgctgcttc tggctgttct ggcgctggct ctgt 34

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> N235C-rev

<400> 16

acagagccag cgccagaaca gccagaagca gcga 34

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> F265C-fw

<400> 17

aacaaccgtg cttcttgttc tcaatacggc gc 32

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> F265C-rev

<400> 18

gcgccgtatt gagaacaaga agcacggttg tt 32

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> L272C-fw

<400> 19

tcaatacggc gctggctgtg atatcgttgc tcc 33

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> L272C-rev

<400> 20

ggagcaacga tatcacagcc agcgccgtat tga 33

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> G340C-fw

<400> 21

acacaaacct ttactgttct ggccttgtta a 31

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> G340C-rev

<400> 22

ttaacaaggc cagaacagta aaggtttgtg t 31

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> S106C-fw

<400> 23

gtggcatcac aggctgtggc gttaaagttg c 31

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> S106C-rev

<400> 24

gcaactttaa cgccacagcc tgtgatgcca c 31

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> N167C-fw

<400> 25

ttggcgttgc tccttgtgct gaactttacg ctgtt 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> N167C-rev

<400> 26

aacagcgtaa agttcagcac aaggagcaac gccaa 35

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> A165C-fw

<400> 27

gcgttcttgg cgtttgtcct aacgctgaac tt 32

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> A165C-rev

<400> 28

aagttcagcg ttaggacaaa cgccaagaac gc 32

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> G305C-fw

<400> 29

acacctcatg ttgcttgtgt tgctgctctt gttaa 35

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> G305C-rev

<400> 30

ttaacaagag cagcaacaca agcaacatga ggtgt 35

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> A188C-fw

<400> 31

tctatctctg gcatctgtca aggccttcaa tggg 34

<210> 32

<211> 34

<212> DNA

<213> A188C-rev

<400> 32

cccattgaag gccttgacag atgccagaga taga 34

<210> 33

<211> 36

<212> DNA

<213> A218C-fw

<400> 33

ctgctacact tgaacaatgt gttaacgctg ctacat 36

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> A218C-rev

<400> 34

atgtagcagc gttaacacat tgttcaagtg tagcag 36

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> L228C-fw

<400> 35

tacatctcgt ggcgtttgtg ttatcgctgc ttctg 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> L228C-rev

<400> 36

cagaagcagc gataacacaa acgccacgag atgta 35

<210> 37

<211> 39

<212> DNA

<213> N319C-fw

<400> 37

aaaacccttc ttggtcttgt gttcaagttc gtaaccatc 39

<210> 38

<211> 39

<212> DNA

<213> N319C-rev

<400> 38

gatggttacg aacttgaaca caagaccaag aagggtttt 39

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> W317C-Q321C-fw

<400> 39

acccttcttg ttctaacgtt tgtgttcgta acc 33

<210> 40

<211> 33

<212> DNA

<213> W317C-Q321C-rev

<400> 40

ggttacgaac acaaacgtta gaacaagaag ggt 33

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> aprbp-fw

<400> 41

gctgaagaag ctaaagaaaa a 21

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> aprbp-rev

<400> 42

acgtgtagca gcttcagcgt taaca 25

<210> 43

<211> 31

<212> DNA

<213> DG127-fw

<400> 43

aacgttcgtg gcgcttcttt cgttgctggc g 31

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> DG127-rev

<400> 44

ccagcaacga aagaagcgcc acgaacgtta 30

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> DG143-fw

<400> 45

taccaagatg gcaaccatgg cacacatgtt 30

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> DG143-rev

<400> 46

aacatgtgtg ccatggttgc catcttggta 30

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> DA238-fw

<400> 47

tctggcaact ctggcggctc tgttggctac 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> DA238-rev

<400> 48

gtagccaaca gagccgccag agttgccaga 30

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> DG269-fw

<400> 49

tctttctctc aatacgctgg ccttgatatc 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> DG269-rev

<400> 50

gatatcaagg ccagcgtatt gagagaaaga 30

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> DA330-fw

<400> 51

catcttaaaa acacaacaaa ccttggcaac 30

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> DA330-rev

<400> 52

gttgccaagg tttgttgtgt ttttaagatg 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> DG334-fw

<400> 53

acagctacaa accttaacac aaacctttac 30

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> DG334-rev

<400> 54

gtaaaggttt gtgttaaggt ttgtagctgt 30

<210> 55

<211> 31

<212> DNA

<213> DG340-fw

<400> 55

aacacaaacc tttactctgg ccttgttaac g 31

<210> 56

<211> 31

<212> DNA

<213> DG340-rev

<400> 56

cgttaacaag gccagagtaa aggtttgtgt t 31

<210> 57

<211> 522

<212> DNA

<213> PBsamy启动子的核苷酸序列（Nucleotide sequence of PBsamy promoter）

<400> 57

tctagaccga gaatggacac caaagaagaa ctgcaaaaac gggtgaagca gcagcgaata 60

gaatcaattg cggtcgcctt tgcggtagtg gtgcttacga tgtacgacag ggggattccc 120

catacattct tcgcttggct gaaaatgatt cttcttttta tcgtctgcgg cggcgttctg 180

tttctgcttc ggtatgtaat tgtgaagctg gcttacagaa gagcggtaaa agaagaaata 240

aaaaagaaat catcttgaaa aatagatggt ttcttttttt gtttggaaag cgagggaagc 300

gttcacagtt tcgggcagct ttttttatag gaacattgat ttgtattcac tctgccaagt 360

tgttttgata gagtgattgt gataatttaa aatgtaagcg ttaacaaaat tctccagtct 420

tcacatcagt ttgaaaggag gaagcggaag aatgaagtaa gagggatttt tgactccgaa 480

gtaagtcttc aaaaaatcaa ataaggagtg tcaagaaagc tt 522

<210> 58

<211> 383

<212> DNA

<213> Pgsib启动子的核苷酸序列（Nucleotide sequence of Pgsib promoter）

<400> 58

tctagagatc aagaccgtac atataagaat gtcgcttctc aaatccaagg ctggcgagaa 60

gtcgttttgg gctatcgaga cacgtttggc tggaaaaaac ttttccagat agtgccggtt 120

gccggaatgg tttttggcgc cgctgccaat cgctcaacat taaacgacat taccgagaca 180

ggcatgatgc tgtacaaaaa gaggcgcatt cttgaacgac tgaaagaaac agaacgagag 240

atggaatagc agaaagcaga cggacaccgc gatccgcctg ctttttttag tggaaacata 300

cccaatgtgt tttgtttgtt taaaagaatt gtgagcggga atacaacaac caacaccaat 360

taaaggagga attcaaaaag ctt 383

<210> 59

<211> 203

<212> DNA

<213> PBsapr启动子的核苷酸序列（Nucleotide sequence of PBsapr promoter）

<400> 59

tctagagttc ttttctgtat gaaaatagtt atttcgagtc tctacggaaa tagcgagaga 60

tgatatacct aaatagagat aaaatcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc 120

catctattac aataaattca cagaatagtc ttttaagtaa gtctactctg aacttaagca 180

aaaggagagg gacgcgtaag ctt 203

<210> 60

<211> 527

<212> DNA

<213> PBsnpr启动子的核苷酸序列（Nucleotide sequence of PBsnpr promoter）

<400> 60

tctagacact aaacagcaag tcatatctgt ccgtccttcc ttttttccgc caagtgctgt 60

ttcagctgca ttctcgccct gtacagggtg ctcttcacct tcgaaagact ccagtccaaa 120

acatctgcaa tctcttcgta agacagctct tgaaatatct gtcgaaatgc tgaataaaat 180

gactgaaaat ctctgacatc tgaaacaatc cttttcgttt attaaggcct cacccgttta 240

gacaaacggc tataaaaaaa gttttacaaa tcggaacatt tttcccctat catttttccc 300

gacttcattt gtcatttttt tcagaataaa tcgcatcatt cgactcatgt ctgattcaac 360

acgtgcctct cggcttatcc cccgatgctg gcctccggaa gcctttccgg gacgattcta 420

tcaattcatc agcggagtct agttttatat tgcagaatga gagaatgctg gtttattata 480

acaatataag ttttcattat tttcaaaaag ggggatttat taagctt 527

<210> 61

<211> 630

<212> DNA

<213> Pcry启动子的核苷酸序列（Nucleotide sequence of Pcry promoter）

<400> 61

tctagacgaa acgtaagatg aaaccttaga taaaagtgct ttttttgttg caattgaaga 60

attattaatg ttaagcttaa ttaaagataa tatctttgaa ttgtaacgcc cctcaaaagt 120

aagaactaca aaaaaagaat acgttatata gaaatatgtt tgaaccttct tcagattaca 180

aatatattcg gacggactct acctcaaatg cttatctaac tatagaatga catacaagca 240

caaccttgaa aatttgaaaa tataactacc aatgaacttg ttcatgtgaa ttatcgcttt 300

atttaatttt ctcaattcaa tatataatat gccaatacat tgttacaagt agaaattaag 360

acacccttga tagccttact atacctaaca tgatgtagta ttaaatgaat atgtaaatat 420

atttatgata agaagcgact tatttataat cattacatat ttttctattg gaatgattaa 480

gattccaata gaatagtgta taaattattt atcttgaaag gagggatgcc taaaaacgaa 540

gaacattaaa aacatatatt tgcaccgtct aatggattta tgaaaaatca ttttatcagt 600

ttgaaaatta tgtattatga aaagaagctt 630

<210> 62

<211> 81

<212> DNA

<213> SPBs1信号肽核苷酸序列（SPBs1 signal peptide nucleotide sequence）

<400> 62

atgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgctgctt cgtttatgag tttatcaatc 60

agcctgccag gtgttcaggc t 81

<210> 63

<211> 87

<212> DNA

<213> SPBs2信号肽核苷酸序列（SPBs2 signal peptide nucleotide sequence）

<400> 63

atgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgc gcaggct 87

<210> 64

<211> 99

<212> DNA

<213> SPBs3信号肽核苷酸序列（SPBs3 signal peptide nucleotide sequence）

<400> 64

atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60

tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgct 99

<210> 65

<211> 93

<212> DNA

<213> SPBs4信号肽核苷酸序列（SPBs4 signal peptide nucleotide sequence）

<400> 65

atgaaaaagc ttttgactgt catgacgatg gctgttttaa ctgccggcac actgctcttg 60

ccggcacaga gtgtcacccc tgccgcgcac gct 93

<210> 66

<211> 99

<212> DNA

<213> SPBs5信号肽核苷酸序列（SPBs5 signal peptide nucleotide sequence）

<400> 66

atgaaaaaag tgttttcaaa caaaaagttt ctcgtttttt ctttcatttt tgcgatgatt 60

ttaagtctgt ctttttttaa tggggaaagt gcaaaagcc 99

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> S-fw

<400> 67

gctgaagaag ctaaagaaaa at 22

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> S-rev

<400> 68

agatctctag atataatggt acc 23

<210> 69

<211> 38

<212> DNA

<213> SPBs1-fw

<400> 69

accattatat ctagagatct atgggtttag gtaagaaa 38

<210> 70

<211> 36

<212> DNA

<213> SPBs1-rev

<400> 70

tttctttagc ttcttcagca gcctgaacac ctggca 36

<210> 71

<211> 41

<212> DNA

<213> SPBs2-fw

<400> 71

gcggtaccat tatatctaga gatctatgag aagcaaaaaa t 41

<210> 72

<211> 34

<212> DNA

<213> SPBs2-rev

<400> 72

tttctttagc ttcttcagca gcctgcgcag acat 34

<210> 73

<211> 34

<212> DNA

<213> SPBs3-fw

<400> 73

ccattatatc tagagatcta tgtttgcaaa acga 34

<210> 74

<211> 32

<212> DNA

<213> SPBs3-rev

<400> 74

ctttagcttc ttcagcagca ctcgcagccg cc 32

<210> 75

<211> 39

<212> DNA

<213> SPBs4-fw

<400> 75

ggtaccatta tatctagaga tctatgaaaa agcttttga 39

<210> 76

<211> 34

<212> DNA

<213> SPBs4-rev

<400> 76

ttctttagct tcttcagcag cgtgcgcggc aggg 34

<210> 77

<211> 36

<212> DNA

<213> SPBs5-fw

<400> 77

taccattata tctagagatc tatgaaaaaa gtgttt 36

<210> 78

<211> 33

<212> DNA

<213> SPBs5-rev

<400> 78

ttctttagct tcttcagcgg cttttgcact ttc 33

Claims (10)

1.一种碱性蛋白酶突变体AprBpM，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体AprBpM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体AprBpM，其特征在于，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体pHY-P_cry-SP_Bs1-aprbpm，其特征在于，包含权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体AprBpM的编码基因aprbpm、启动子P_cry和信号肽SP_Bs1；所述启动子P_cry和信号肽SP_Bs1的序列分别如SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62所示。

4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求3所述的重组表达载体pHY-P_cry-SP_Bs1-aprbpm；所述重组菌为重组表达载体转化菌株得到的。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述菌株为枯草芽孢杆菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述菌株为枯草芽孢杆菌WB800N。

7.一种表达如权利要求1所述碱性蛋白酶突变体AprBpM的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、通过三维建模软件SWISS-MODEL获得碱性蛋白酶突变体AprBp三维构象；

S2、通过结合二硫键设计软件bridgeD和Disulfide by Design确定目标二硫键突变体，通过筛选获得有效二硫键突变体；

S3、以有效二硫键突变体为模板，通过生物信息学软件Discovery studio2.5和B-factor分析突变体二硫键三维构象，删除Loop区域表面不稳定氨基酸，获得热稳定性提升的突变体AprBp；

S4、对步骤S3所述的热稳定性提升的突变体AprB进行启动子优化和信号肽优化，进一步得到高效表达突变体AprBpM；

S5、在枯草芽孢杆菌中高效表达突变体AprBpM并测定其酶学特性。

8.一种如权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体AprBpM在制备动物多肽中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述动物多肽通过采用突变体AprBpM水解废弃虾蟹壳制备获得。

10.一种如权利要求1所述碱性蛋白酶突变体AprBpM在农业有机种植中的应用，其特征在于，将所述碱性蛋白酶突变体AprBpM水解废弃虾蟹壳制备的多肽应用于农业有机种植。

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