CN103361287A - 一株耐热氨肽酶的产生菌及该酶的纯化方法 - Google Patents

Abstract

一株耐热氨肽酶的产生菌及该酶的纯化方法，属于与食品质量提升相关的外切型蛋白酶类及酶学特征研究领域。本发明的产酶菌株为铜绿假单胞杆菌（Pseudomonasaeruginosa）NJ-814，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.7638。该菌所产的氨肽酶，最适反应pH9.0，在pH7.5-10.5具有较好的稳定性；最适反应温度80℃，热稳定温度范围为80℃以下，80℃时的酶活半衰期达119min，表现出较好的耐热特性。该酶对末端为碱性氨基酸-赖氨酸和疏水氨基酸-亮氨酸的水解能力较强，表现出相对较窄的底物特异性。鉴于该酶耐热及特异性作用的特点，可选择其与内切蛋白酶协同作用，在蛋白水解液脱苦、生物活性多肽的制备等方面具有较为广阔的应用前景。

Description

一株耐热氨肽酶的产生菌及该酶的纯化方法

技术领域

一株耐热氨肽酶的产生菌及该酶的纯化方法与主要酶学特征，该种耐热氨肽酶，属于与食品质量提升相关的外切型蛋白酶类及酶学特征研究领域。

背景技术

氨肽酶（aminopeptidase，简称AP，EC 3.4.11）是一类从多肽链的N端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个游离出来的酶。氨肽酶的酶解产物为小肽和游离氨基酸，因此它们可切除苦味肽氨端的疏水氨基酸，从而脱除苦味。其广泛用于肉制品加工、乳品业等，减少苦味、增加游离氨基酸，提高食品营养价值；并且氨肽酶还可用作蛋白序列测定的分子工具及重组蛋白或融合产物的固化剂等。

本发明的耐热氨肽酶具有提高反应速率、简化工艺、降低成本、提高产品质量和耐贮藏等优点。所以该耐热氨肽酶对于氨肽酶应用于生物活性多肽的制备、工业生产等方面的研究具有较深远的意义，且对提高我国相关产业的加工水平，降低成本，增强行业竞争力，打破这种垄断局面具有重要的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的特点，提供一种新的能产耐热氨肽酶的铜绿假单胞杆菌NJ-814。

本发明目的是提供铜绿假单胞杆菌NJ-814发酵产氨肽酶的特点、酶的纯化方法、酶的底物特异性及酶学性质。

本发明的技术方案：一株耐热氨肽酶产生菌，其被鉴定分类命名为铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa ）NJ-814，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.7638。

用所述菌株制备耐热氨肽酶的纯化方法，出发菌株为铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）NJ-814，即CGMCC NO.7638，经过摇瓶发酵，离心获得的粗酶液，通过硫酸铵盐析和DEAE阴离子交换层析分离纯化，经SDS-PAGE检测获得电泳纯的耐热氨肽酶。

纯化所得到的耐热氨肽酶，其最适反应温度为80℃；在50℃或60℃保温120 min后，相对酶活仍高于80％；在70℃保温120 min相对酶活保留70％；在80℃处理120 min的相对酶活仍保留49.78%，即此温度下半衰期为119 min；最适反应pH为9.0；pH稳定范围为7.5-10.5；对Lys-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA作为底物均有一定的分解作用，其中对Lys-pNA的分解能力强。

A 粗酶液的制备及纯化

经过摇瓶发酵，离心获得的粗酶液，将上述粗酶液经硫酸铵盐析，收集沉淀并溶解于少量pH8.5 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液中得酶液A。经过Hiprep DEAE 16/10 FastFlow阴离子交换层析，收集活性峰，得到酶液B。经SDS-PAGE检测酶液B已达到电泳纯。

B 酶学性质（见图1-6）

（1）酶最适反应温度：将氨肽酶置于不同温度下（30-90℃）与底物发生反应，测定酶活力，结果见图1，酶的最适反应温度为80℃，在50-90℃之间均具有较高的催化能力。

（2）酶的热稳定性：将酶液置于不同的温度（50、60、70、80℃）保温120 min，每20 min取样测定酶活；在90℃选择分别保温5 min、10 min；均立即在0℃冰浴中冷却，将最高的酶活力定义为100％。结果见图2，该菌所产氨肽酶在50℃和60℃条件下相对稳定，保温120 min后，相对酶活仍高于80％；70℃，120 min相对酶活保留约70％；80℃，120 min的相对酶活仍保留49.78%，即此温度下该酶半衰期为119 min；90℃保温时，相对酶活保留率急剧下降，保温10 min后，相对酶活仅为19.87%。综上说明该菌所产的氨肽酶的温度稳定性较好，稳定范围为80℃以下。

（3）酶的最适反应pH：分析是在50 mmol/L的不同pH缓冲体系（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）。其中PBS缓冲溶液（pH 6.0-7.5）、Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.5-9.0）、Glycine-NaOH缓冲溶液（pH 9.0-10.5）。结果见图3，该氨肽酶的最适反应pH为9.0。在pH 7.5-9.5之间反应的酶活也较高。

（4）酶的pH稳定性：将稀释适当倍数的1 mL酶液与2 mL 50 mmol/L不同pH的缓冲体系（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）混合。分别50℃保持1 h、3 h。将pH9.0保存3 h测定的酶活定义为100%。结果如图4，该氨肽酶在pH8.5稳定性最好，氨肽酶的pH稳定范围为7.5-10.5。

（5）酶的底物特异性：分别用谷氨酰对硝基苯胺（GpNA）、赖氨酸对硝基苯胺（Lys-pNA）、丙氨酸对硝基苯胺（Ala-pNA）、缬氨酸对硝基苯胺（Val-pNA）、甲硫氨酸对硝基苯胺（Met-pNA）、精氨酸对硝基苯胺（Arg-pNA）、苯丙氨酸对硝基苯氨（Phe-pNA）、亮氨酸对硝基苯胺（Leu-pNA）、异亮氨酸对硝基苯胺（Ile-pNA）配制等摩尔的底物。将Leu-pNA为底物时的酶活，定义为100%。结果如图5，该氨肽酶对Lys-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA均有一定的分解能力，对其它底物未检测到分解活性。对Lys-pNA的分解能力最强，约是Leu-pNA的3.68倍。

（6）酶的米氏常数Km及最大反应速度Vmax：以Lys-pNA作为底物，分别测定底物不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L)的酶活。结果如图6，按照双倒数法作1/v-1/s曲线，计算该酶Km和Vmax分别是2.3155 mmol/L和5.3648 mmol/L/min。

酶活测定方法：

原理：在一定条件下，该菌株的酶液与底物（L-Leu-pNA）反应后，释放的对硝基苯胺的量，即在一定范围内其颜色的深浅与酶的活力成正比，故在405 nm的波长下进行比色，计算酶活力。

酶活测定步骤：首先加入2 mL pH9.0 Tris-HCl缓冲液和1 mL底物(L-Leu-pNA)混匀，然后加入稀释一定倍数的酶液，80℃保温10 min，OD₄₀₅比色测定酶活。

酶活力定义：在一定条件下，每分钟分解L-亮氨酸对硝基苯胺产生1 μmoL的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。

本发明的有益效果：该菌所产的氨肽酶，最适反应pH为9.0，在pH7.5-10.5具有较好的稳定性；最适反应温度为80℃，热稳定温度范围为80℃以下，80℃时的酶活半衰期可达119 min，表现出较好的耐热特性。该酶对末端为碱性氨基酸-赖氨酸和疏水氨基酸-亮氨酸的水解能力较强，表现出相对较窄的底物特异性。鉴于该酶耐热及特异性作用的特点，可选择其与内切蛋白酶协同作用，在蛋白水解液脱苦、生物活性多肽的制备等方面具有较为广阔的应用前景。

生物材料样品保藏：本发明所涉及的铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）NJ-814已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期2013年5月24日，保藏编号：CGMCC No.7638。 

附图说明

图1 酶最适反应温度。

图2 酶的热稳定性。

图3 酶反应的最适pH。

图4 酶的pH稳定性。

图5 酶的底物特异性。

图6 酶的米氏常数Km及最大反应速度Vmax的测定，1/v-1/s曲线。

具体实施方式

实施例1 粗酶液的制备

一种铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）ＮJ-814，以1%的接种量接种到30 mL/250 mL的种子培养基（蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 5 g/L，NaCl 5 g/L，pH7.0）中，37℃、200 r/min，培养9 h。将该菌的种子液以5%的接种量接种50 mL/250 mL发酵培养基（甘露醇20 g/L，豆饼粉10 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.5 g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.12 g/L，pH6.0）中，置于摇床中进行发酵培养，37℃、200 r/min、培养34 h，10000 r/min离心20 min，弃去菌体即为粗酶液。

实施例2 氨肽酶的分离纯化

将实施例1所得到的粗酶液，选择硫酸铵饱和度为30%-50%，4℃静止、过夜。10000 r/min离心20 min，获得沉淀，并溶解于少量pH8.5、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液中得酶液A。将酶液A进行透析过夜。采用pH8.5、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液预先平衡Hiprep DEAE 16/10 FastFlow柱子，上样量2.0 mL，流速为1 mL/min，用0-0.6 mol/L的NaCl溶液(溶于50 mmol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液)进行梯度洗脱，收集活性峰得到酶液B。经SDS-PAGE分析酶液B，得到单一条带，即获得电泳纯的氨肽酶。

实施例3 酶学性质的研究

将实施例2所述的方法所得到的氨肽酶，该氨肽酶具有以下特点：最适反应温度为80℃。在50℃或60℃条件下相对稳定，保温120 min后，相对酶活仍高于80％；70℃，120 min相对酶活仍保留约70％；80℃，半衰期为119 min。最适反应pH为9.0。在pH8.5下酶的稳定性最好，pH稳定范围为7.5-10.5。对Lys-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA作为底物均有一定的分解作用，其中对Lys-pNA的分解能力最强。

Claims (2)

1.一株耐热氨肽酶产生菌，其被鉴定分类命名为铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa ）NJ-814，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.7638。

2.一种用权利要求1所述菌株制备耐热氨肽酶的纯化方法，其特征在于出发菌株为铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）NJ-814，即CGMCC NO.7638，经过摇瓶发酵，离心获得的粗酶液，通过硫酸铵盐析和DEAE阴离子交换层析分离纯化，经SDS-PAGE检测获得电泳纯的耐热氨肽酶；

纯化所得到的耐热氨肽酶，其最适反应温度为80℃；在50℃或60℃保温120 min后，相对酶活仍高于80％；在70℃保温120 min相对酶活保留70％；在80℃处理120 min的相对酶活仍保留49.78%，即此温度下半衰期为119 min；最适反应pH为9.0；pH稳定范围为7.5-10.5；对Lys-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA作为底物均有一定的分解作用，其中对Lys-pNA的分解能力强。

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