CN105524861A - 一株可降解环烷酸的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株可降解环烷酸的芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株可降解环烷酸的芽孢杆菌及其应用。具体涉及分离并鉴定了一株可生物降解5种不同化学结构的环烷酸的蜡状芽孢杆菌(Bacillus？cereus)。该菌可以反-4-甲基-环己烷甲酸、顺-4-甲基-环己烷甲酸、反-4-叔丁基环己羧酸、反-4-戊基环己烷甲酸、二环己基乙酸为唯一碳源进行生长。对反-4-甲基-环己烷甲酸和反-4-戊基-环己烷甲酸的降解率分别为93.2％和42.2％，可应用环烷酸的生物降解之用。

Description

一株可降解环烷酸的芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株可降解环烷酸的芽孢杆菌及其应用。
背景技术
石油中的酸性物质包括环烷酸、芳香酸、脂肪酸和酚类等，这些酸性物质总称为石油酸。其中，环烷酸最为重要，约占石油酸总质量的90％以上。因此，在石油工业中通常不加区分，将石油酸称为环烷酸。环烷酸的化学成分复杂，通常由多种脂肪族羧酸和具有支链的单环或多环的脂环羧酸构成。环烷酸的经验通式为CnH2n+ZO2，式中n为碳数(一般为11～30)；Z为氢不饱和度，为0或负的偶数。
环烷酸废水污染是近年来伴随石油工业发展而产生的一种新环境问题。环烷酸是石油的天然组分，其含量越高，商业价值越低。目前，随着世界范围内高品质石油储量的不断减少，人们越来越多地把目光投向环烷酸的含量较高的重原油和含油沥青砂等。但是，重原油和含油沥青砂提炼过程会产生大量有毒的环烷酸。环烷酸是炼油厂污水和油砂处理污水中毒性最强的成分之一。环烷酸对细菌、浮游植物、浮游动物、鱼类、高等植物和哺乳动物等多种具有生物毒性。环烷酸废水特别是对水生生物危害较大，对水生态系统和人类健康具有潜在危害，如何有效处理环烷酸废水问题已引起国际社会和科学界的关注。
环烷酸化学性质稳定、难降解。采用絮凝气浮、光解法、臭氧氧化等物理和化学方法处理环烷酸废水不仅费用高而且难以实现大规模处理。微生物转化降解既是自然环境中有机污染物转化的重要途径，也是有机污染物污染控制与污染环境修复的有效技术方法，具有费用低、效果好、无二次污染和有利于大规模实施等特点。因此，寻找具有降解环烷酸的微生物对于处理环烷酸废水有重要意义。
目前，有关环烷酸微生物降解研究主要集中于国外，国内的相关研究的报道较少，尚处于起步阶段。已有关环烷酸微生物降解的研究主要围绕降解菌株的分离和代谢途径等。环烷酸的微生物降解以细菌好氧降解为主，目前已经报道的环烷酸的降解细菌主要包括Arthrobactersp.，Acinetobacteranitratum，Alcaligenesfaecallis,Pseudomonas，Corynebacteriumcyclohexanicum，Trichosporoncutaneum，Cupriavidus，Rhodococcus和Dietzia等。这些细菌多以降解单一结构的环烷酸为主。为此，亟待研发能降解多种环烷酸的降解菌，从而为采用生物降解方法处理大规模环烷酸废水提供有效的菌种资源。
发明内容
本发明的目的是提供一株可降解环烷酸的芽孢杆菌。
本发明所提供的芽孢杆菌是从国内油田采油厂的土壤中筛选得到的。根据其形态特征、培养特性、生理生化特性和16SrRNA基因序列分析等证实属于芽孢杆菌属(Bacillus)，将其命名为蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1。该菌株已于2013年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNo.：7638。
蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1为革兰氏阳性菌，在LB琼脂平板培养基上，30℃，培养24h，形成圆形、扁平、光滑、边缘整齐的乳白色菌落(似蜡烛样颜色)、直径为5-7mm。蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1属于兼性好氧。生长温度范围20～45℃，最适生长温度为30℃，可生长pH范围为4.0-10.0，最适生长pH值为7.2。
蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1的16SrRNA基因序列如序列表中序列1所示，与已发表的蜡状芽孢杆菌BacilluscereusATCC14579(T)的16SrRNA基因序列的同源性分别为99.92％。
本发明的另一个目的是提供一种降解环烷酸的方法。
本发明所提供的降解多环烷酸的方法，是用所述蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1对含有环烷酸的样品进行处理，使环烷酸得到生物降解。
上述方法中，所述的环烷酸为反-4-甲基-环己烷甲酸、顺-4-甲基-环己烷甲酸、反-4-叔丁基环己羧酸、反-4-戊基环己烷甲酸、二环己基乙酸。
以蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1为活性成分制备的生物制剂也属于本发明的保护范围。
本发明的蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1，分离自石油污染土壤。蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1能以5种不同化学结构的环烷酸为唯一碳源和能源进行生长。在不填加任何碳源的无机盐培养基中，144h内对含量为100mg/L反-4-甲基-环己烷甲酸和反-4-戊基环己烷甲酸的降解效率分别为93.2％和44.6％。因此，本发明提供蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1对于含有高浓度环烷酸废水的生物治理或生物修复的巨大潜力。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。
附图说明
图1为蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1的扫描电镜图片(A)及其在LB平板下生长的菌落形态照片(B)
图2为蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1的16SrRNA基因序列的系统发育分析图
图3为蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1对反-4-甲基环己烷酸的降解曲线图
图4为蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1对反-4-戊基环己烷甲酸的降解曲线图
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实验方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为蒸馏水。
环烷酸的检测方法采气相色谱-质谱测定。
样品处理：取5mL样品，用5mL的二氯甲烷分别以2.5mL、1.5mL和1mL重复萃取3次，合并有机相并通过无水硫酸钠柱脱水，最后用二氯甲烷定容到10mL。
采用美国安捷伦气-质联用仪，色谱柱为DB-35ms型。初始温度：80℃；升温程序：80℃，以10℃/min的速度升温至180℃；进样口温度：270℃；载气为He；流量：1.0mL/min；分流进样；采用离子监测模式；扫描时间100s。
实施例1.蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1的分离、纯化和鉴定。
蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1分离自国内油田采油厂的土壤，具体富集、分离、纯化过程如下：
基础无机盐培养基(MSM培养基)组成为：KH2PO41.36g，(NH4)2SO40.66g，Na2HPO4O.43g，MgSO4·7H2O0.25g，微量元素溶液10mL，蒸馏水990mL。
微量元素溶液的组成为：Ca(NO3)2·4H20800mg/L、FeSO4·7H20400mg/L、CuSO4·5H2080mg/L、ZnSO4·7H2040mg/L、MnSO4·4H2040mg/L、NaMO4·2H208mg/L、H3B036mg/L、K2HP04500mg/L，其余为蒸馏水。
MSM培养基中加入质量百分含量为1.5-1.8％的琼脂糖，在0.06MPa条件下灭菌20min。随后待灭菌MSM的培养基冷却至50-60℃后，加入反-4-甲基-环已烷酸，使其浓度为50mg/L。同时将不含环已烷酸的MSM平板上作为空白对照。
将采集的样品1g接种到生理盐水中(装液量为20ml/100ml三角瓶)，28℃，200rpm下振荡24h。取1ml悬液于离心管中，5000r/min离心10min，弃去上清液，再加入相同体积的生理盐水进行洗涤，重复以上洗涤过程3次。将所得沉淀进行一系列梯度稀释，涂布在上述含有环已烷酸的MSM平板上，将涂布后的平板置于30℃条件下静置培养直至长出明显可见的菌落。每个实验设三个重复。
结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加反-4-甲基-环已烷酸作为碳源的平板上，土壤样中的微生物无法生长；相应的，加有反-4-甲基-环已烷酸的平板经过5d培养后发现有10余个单菌落，说明这些单菌落对应的菌株能够降解反-4-甲基-环已烷酸并以其为唯一碳源生长。挑取单菌落直径最大的菌株，划线到新的MSM培养基(含100mg/L反-4-甲基-环已烷酸)平板上进行纯化，最后获得生长良好的菌株。
采用形态观察、生理生化鉴定和16SrRNA基因测序对菌株进行鉴定
采用电镜和固体平板对筛选的菌株进行形态观察。菌株呈杆状，在LB培养基上的可见白色、呈圆形、光滑的菌落。生理生化鉴定结果为：革兰氏染色为阳性；可分解葡萄糖，能产酸而不产气，V.P实验为阳性，接触酶为阳性。
菌株的16SrRNA基因序列测定和系统发育分析。提取菌株的总DNA，采用细菌16SrDNA通用引物，正向引物为27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，反向引物为1492r(5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3')’，进行PCR扩增。PCR反应条件为：先94℃6min；然后94℃45s，54℃45s，72℃90s，共30个循环；最后72℃延伸10min。
PCR扩增产物送上海生工生物有限公司进行测序；采用ClustalX程序(1.64b)，系统发育分析通过MEGA(2.1)软件采用近邻结合法和最大简约法分析。
结果表明，上述步骤一筛选到的菌株的16SrRNA基因序列见附件。
蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1的16SrRNA基因序列的系统发育分析图如图3所示。根据获得的16SrRNA基因序列比对和系统发育分析结果判定，上述步骤所筛选到的菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)，与已发表的蜡状芽孢杆菌模式菌株BacilluscereusATCC14579(T)的16SrRNA基因序列的同源性分别为99.2％。
基于以上菌株的形态、生理生化实验与16SrRNA测定结果，将上述步骤一筛选到的菌株鉴定并命名为蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCR1。该菌株已于2013年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNo.7638。
实施例2.蜡状芽胞杆菌BacilluscereusCR1对环烷酸的降解谱
为研究蜡状芽胞杆菌BacilluscereusCR1对环烷酸的降解谱，以MSM作为基本培养基，分别考察该菌株对5种不同化学结构的环烷酸作为唯一外加的碳源的生长情况。实验采用固体培养的方式，在28℃、静置培养一周，观察菌落形成的情况。蜡状芽胞杆菌BacilluscereusCR1对5种不同的环烷酸降解测试结果如表1。
表1蜡状芽胞杆菌BacilluscereusCR1对环烷酸的降解利用情况
注：表中“+”表示菌体在相应环烷酸平板上的生长情况。
“+”越多表示菌生长得越好，环烷酸被生物降解的越好
通过表1可知：(1)蜡状芽胞杆菌BacilluscereusCR1对环烷酸的降解谱较宽，可以降解反-4-甲基-环己烷甲酸、顺-4-甲基-环己烷甲酸、反-4-叔丁基环己羧酸、反-4-戊基环己烷甲酸、二环己基乙酸；(2)环烷酸的化学结构影响其微生物可降解性，包括环烷酸顺反异构、环烷酸侧链的长度和环的数目对环烷酸的生物可降解性具有明显的影响。相同分子量的环烷酸，反式结构更容易被蜡状芽胞杆菌BacilluscereusCR1生物代谢，生物可利用性更好。
实施例3.蜡状芽胞杆菌BacilluscereusCR1对反-4-甲基-环己烷甲酸的生物降解
将保存的菌体接种在含有100mg/L反-4-甲基-环己烷甲酸的LB富集培养基中，生长至最适菌龄，然后将菌于4000rpm、10min离心收集菌体、洗涤后后将菌接种到含有100mg/L反-4-甲基-环己烷甲酸的MSM培养基中，每隔一定时间取样，测定反-4-甲基-环己烷甲酸残留浓度，绘制出降解曲线，结果见图3。由图3可知，经过144h反应后，反-4-甲基-环己烷甲酸的最终浓度为6.84mg/L，降解率可达到93.2％。由此可见，筛选出的菌株对反-4-甲基-环己烷甲酸的有很高的降解效率。
实施例4.蜡状芽胞杆菌BacilluscereusCR1对反-4-戊基-环己烷甲酸的生物降解
实施例4的实施过程与方法与实施例3相同，唯一不同是所选用的降解目标化合物不同。实施例4中选用的环烷酸为反-4-戊基-环己烷甲酸，初始浓度为100mg/L。降解实验结果见图4。经过144h反应后，反-4-戊基-环己烷甲酸浓度为57.82mg/L，降解率为42.2％。

Claims (3)

1.一株可降解环烷酸的芽孢杆菌，该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)，编号为CR1已于2013年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCCNo.7638。
2.保藏号为CGMCCNo.7638的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)对环烷酸有较宽的降解谱，可以利用反-4-甲基-环己烷甲酸、顺-4-甲基-环己烷甲酸、反-4-叔丁基环己羧酸、反-4-戊基环己烷甲酸、二环己基乙酸为唯一碳源进行生长，其特征为：向MSM固体培养，分别加入上述5种不同化学结构的环烷酸作为唯一外加的碳源，在28℃、静置培养一周。
3.如权利要求2中所述的利用保藏号为CGMCCNo.7638的蜡状芽孢杆菌，对反-4-甲基-环己烷甲酸和反-4-戊基-环己烷甲酸的生物降解，其特征为：将保存的菌体接种在含有100mg/L反-4-甲基-环己烷甲酸的LB富集培养基中，生长至最适菌龄，然后将菌于4000rpm、10min离心收集菌体、洗涤后后将菌接种到含有100mg/L反-4-甲基-环己烷甲酸的MSM培养基中，经过144h反应后，反-4-甲基-环己烷甲酸降解率可达到93.2％。利用同样的方法，反-4-戊基-环己烷甲酸浓度降解率为42.2％。
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