CN104877930A

CN104877930A - 一种耐盐碱石油烃降解菌的分离筛选方法

Info

Publication number: CN104877930A
Application number: CN201510197937.7A
Authority: CN
Inventors: 唐景春; 张海荣; 孙克静
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2015-09-02

Abstract

本发明提供一种从油污土壤中分离并筛选耐盐碱石油烃降解纯菌株的方法。首先从油田采集盐碱化石油烃污染土壤，按10％的量添加至原油为唯一碳源的无机盐培养基中，在恒温摇床上进行富集培养。然后取10％富集液接种于新鲜原油无机盐培养基中，相同条件连续驯化培养4～5次，驯化过程中培养基的pH、盐度和原油含量逐渐升高。取驯化完成之后的培养液梯度稀释后涂布于LB-琼脂平板，待菌落长出后，挑取不同形态的单菌落，并划线纯化，分离单菌。后将分离的单菌涂布于原油无机盐-琼脂平板，检测是否有菌落长出，若有菌落长出，说明该菌株为石油烃降解菌。测定单菌株石油烃降解率，并对其进行16S rDNA分子鉴定，确定菌株的种属关系。

Description

一种耐盐碱石油烃降解菌的分离筛选方法

技术领域

本发明涉及一种用于修复石油烃污染盐碱化土壤的微生物分离筛选方法，具体涉及一种筛选耐盐碱石油烃降解菌应用于修复盐碱性石油污染环境的技术方法，其属于环境修复技术领域。

背景技术

我国大港油田、大庆油田、胜利油田等多个油田的土壤因其特定的地质条件和不合理的人类活动均有不同程度的盐碱化。在石油开采和油井施工作业过程中，易造成石油泄漏，污染土壤。盐碱土壤本身理化性质差，石油污染进一步恶化了其理化性质，对土壤微生物造成显著胁迫，干扰土壤物质循环。此外，石油中含有的多环芳烃等污染物具有“三致”效应，具有较高的生态风险，对人类健康具有潜在威胁。因此，石油污染盐碱土壤的修复是一项紧迫任务。然而目前的土壤修复方法大多集中在石油或者盐碱单一胁迫方面，针对石油和盐碱复合胁迫下的土壤修复制剂罕见报道。

目前，石油污染土壤的修复方法主要有：萃取、淋洗、堆肥、植物修复、微生物修复等。微生物由于具有繁殖能力强、适应性强、降解谱广等优点，常用于清除石油类污染物；从被污染土壤环境中筛选出来的土著石油降解菌也常用于石油污染土壤的修复。目前报道的可以降解石油烃、修复石油污染土壤的微生物主要包括：假单胞菌(Pseudomonas sp.)、棒杆菌(Corynebacterium sp.)、微球菌(Micrococcus sp.)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、芽抱杆菌(Bacillus sp.)、无色杆菌(Achromobacter sp.)、诺卡氏菌(Nocardia sp.)，等等。从石油污染土壤中分离高效石油烃降解菌，特别是适应特定土壤环境的降解菌，仍是石油污染土壤修复的研究热点之一。通常情况下，石油烃降解菌不太适应盐碱性土壤环境，盐碱胁迫影响其生长活性剂其降解效果的发挥。从石油污染盐碱土壤中分离得到的耐盐碱石油烃降解菌能够较好地适应盐碱土壤环境，可以在高盐碱条件下高效地降解石油烃。

发明内容

1、本发明的目的是提供一种修复石油烃污染盐碱化土壤的微生物分离筛选方法，其特征在于，其步骤如下：

1)取样：采集石油污染盐碱化土壤10g，记录采集位置、土壤含水量、含油量等，进行编号；

2)富集培养：将土样按质量体积比10％加入灭过菌的以1％原油为唯一碳源的无机盐培养基(M9MM)中，30℃、160rpm条件下，在恒温振荡器中振荡培养7d；

3)驯化培养：然后取富集液10mL接种于新鲜原油无机盐培养基中，相同条件连续培养4～5次，每次驯化为在30℃、160rpm条件下，在恒温振荡器中振荡培养7d。驯化过程中培养基的pH、盐度和原油含量逐渐升高，具体条件如表1所示；

4)分离纯化：采用LB固体培养基对第三步中的驯化完成的石油烃降解菌进行涂布分离，待菌落长出后，挑取不同形态的单菌落，划线纯化，取纯化之后的菌落在显微镜下观察菌株是否单一，若为纯菌则在-80℃甘油保种，若非纯菌，则继续纯化。所述LB固体培养基成分为(1L)：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15～20g琼脂粉，pH 7.0～7.2；

5)石油烃降解检测：将分离纯化完成之后的单菌挑入LB液体培养基中，培养至对数生长期，5000rmp离心5min，用0.85％的氯化钠溶液冲洗两次来除去剩余的碳源，用该氯化钠溶液重悬至原体积，梯度稀释后涂布于M9MM-琼脂平板，然后取少量灭菌原油涂布于该平板上，恒温培养箱中30℃培养3～5天，观察是否有菌落长出，以及菌落和溶油圈的大小，若有菌落长出，说明该菌能够利用石油烃为碳源生长；

6)菌株鉴定：对上述分离出的石油烃降解菌进行分子生物学鉴定，利用OMEGA bio-tee细菌DNA提取试剂盒D3350-01对每种菌株的基因组DNA进行提取。提取结果通过1％的琼脂糖凝胶电泳来监测。对提取的DNA进行16S rDNA PCR扩增，将16S rDNA PCR产物送至测序公司测序，然后将测定的序列在GenBank中用Blast软件与已知序列进行同源性分析。

7)耐盐碱性检测：以LB液体培养基为基础，将NaCl浓度分别设置为5、10、20、30、50、70、90、110g/L，菌液接种量为1％，pH调至7.0～7.2，30℃、180rpm恒温摇床培养至对数期，于600nm波长处测定吸光度OD值，测定菌株的耐盐性；以LB液体培养基为基础，将pH值分别设置为5、6、7、8、9、10、11，盐度设置为1％，接种量为1％，30℃、180rpm恒温摇床培养至对数期，于600nm波长处测定吸光度OD值，测定菌株的耐碱性。

8)降解率测定：将适量石油烃加入无机盐培养基(M9MM)中，灭菌之后接种菌液，在150rpm，30℃条件下培养7天。降解完成之后的样品用1∶1H2SO4酸化至PH为2，加入1g NaCl(25ml体系)破乳化作用，然后加入20ml二氯甲烷60w条件下超声萃取15min，用分液漏斗将水相和有机相分离，剩余水相中再添加20ml二氯甲烷，重复上述超声萃取过程，此过程进行三次，收集有机相，无水硫酸钠脱水，40℃旋蒸蒸干，并用色谱纯二氯甲烷定容。样品制备完成之后，用配备有HP-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25um)，FID检测器的气象色谱仪来检测，计算降解率。

2.发明内容1所述的无机盐培养基(M9MM)，其特征在于，无机盐培养基成分为(1L)：8.5g Na2HPO4·2H2O，3.0g KH2PO4，1.0g NH4Cl，0.49g MgSO4·7H2O，0.011g CaCl2，NaCl的量根据需要加入。微量元素：0.4mg CuSO4，1.0mg KI，4.0mg MnSO4·H2O，4.0mg ZnSO4·7H2O，5.0mg H3BO3，1.6mg H2MoO4·2H2O，2.0mg FeCl3·6H2O。其中1mol/l的MgSO4·7H2O和1mol/l的CaCl2分开灭菌之后再加入培养基中；

3.发明内容1第六步中所述的PCR引物为27F(5-AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3′)与1492R(5-TACggTTACCTTgTTACgATCC-3)。

4.发明内容1第六步中所述的PCR反应体系(50uL)为：3ul模版DNA，5ul10×EasyBuffer，4ul dNTPs(2.5mM)，1ul EasyDNA Polymerase，27F、1492R各1ul，35ul ddH2O。PCR扩增条件为：94℃预变性5nin，94℃预变性1min，退火温度从65℃到55℃，每个循环降低1℃，72℃延伸1min，共10个循环；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25个循环，再72℃延伸7min。用1％琼脂糖凝胶电泳监测PCR产物。

5.发明内容1第八步中所述的GC检测条件如下：氮气作为载气；不分流模式；进样口温度和检测器温度都为300℃；柱箱温度为：40℃保持0.5min，以每分钟15℃的速度升至290℃并保持5min。

6.采用微生物法处理石油污染盐碱土壤具有处理成本低、利于石油专性降解菌适应新的污染环境、提高和改善土壤的微生态环境质量和对环境不造成二次污染的优点，可以显著地提高盐碱土壤中石油烃的降解效率，同时也可适用于有一定含盐量的石油污染水体的修复。

具体实施方式：

结合以下具体实施案例进一步阐明本发明。需理解，以下实施方式仅用于解释本发明，而不限制本发明的适用范围。下列实施方式中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作。

实施例：

(1)菌株筛选

分别称取10g石油污染土壤和油泥(均采自大港油田)，无菌操作将其接种于灭过菌的盛有90ml无机盐培养基的250ml锥形瓶中，30℃、160rpm条件下，振荡培养7d，然后取富集液10mL接种于新鲜原油无机盐培养基中，相同条件连续培养4～5次，驯化过程中培养基的pH、盐度和原油含量逐渐升高，具体条件如表1所示。

取驯化完成之后的培养液梯度稀释后涂布于LB-琼脂平板，待菌落长出后，挑取不同形态的单菌落，并划线纯化，分离单菌。显微镜下观察细菌的形态，如图1所示。

再将分离纯化完成之后的单菌挑入LB液体培养基中，培养至对数生长期，5000rmp离心5min，用0.85％的氯化钠溶液冲洗两次来除去剩余的碳源，用该氯化钠溶液重悬至原体积，梯度稀释后涂布于M9MM-琼脂平板，然后取少量灭菌原油涂布于该平板上，恒温培养箱中30℃培养3～5天，观察是否有菌落长出，以及菌落和溶油圈的大小。四株菌在油平板上生长的菌落形态如图2所示。

(2)菌株鉴定与保藏

利用OMEGA bio-tec细菌DNA提取试剂盒D3350-01对每种菌株的基因组DNA进行提取。提取结果通过1％的琼脂糖凝胶电泳来监测。检测结果如图3所示。

对提取的DNA进行16S rRNA PCR扩增，所用引物为：27F(5’AGTTTGATCCTGGCTCAG 3’)和1492R(5’ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3’)。PCR反应体系(50uL)为：3ul模版DNA，5ul 10×EasyBuffer，4ul dNTPs (2.5mM)，1ul EasyDNA Polymerase，27F、1492R各1ul，35ul ddH₂O。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃预变性1min，退火温度从65℃到55℃，每个循环降低1℃，72℃延伸1min，共10个循环；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25个循环，再72℃延伸7min。用1％琼脂糖凝胶电泳监测PCR产物。检测结果如图3所示。

将16S rDNA PCR产物送至北京华大基因测序公司测序，然后将测定的序列在GenBank中用Blast软件与已知序列进行同源性分析。

综合生理生化鉴定、16S rDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的四株菌株分别为苍白杆菌、变异棒杆菌和迪茨菌，分别将四株菌命名并于2014年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。包括：苍白杆菌(Ochrobactrum ciceri)B01菌株(保藏编号CGMCC 1.14995)；迪茨菌(Dietzia sp.)B03菌株(保藏编号CGMCC 1.15015)；迪茨菌(Dietzia sp.)B04菌株(保藏编号CGMCC 1.15021)；变异棒杆菌(Corynebacterium variabile)B05菌株(保藏编号CGMCC No.10134)。其中变异棒杆菌(Corynebacterium variabile)B05菌株(保藏编号CGMCC No.10134)为专利保藏，其他三株菌为公开寄存。

(3)耐盐碱性测定

耐盐碱实验表明，4株菌均有较高的耐盐碱性能，如图4所示。在盐度为3％，pH为9的盐碱环境下，10株菌的生长性能均未受到影响。其中，菌B05能够耐受11％的盐度环境；菌B01能够耐受PH为10的碱度环境，菌B03和B04能够耐受pH为11的碱度环境。菌B03，B04，B05为具有较好耐盐碱性能的微生物，有望在盐碱化石油烃污染现场应用。

(4)单株菌降解率测定

无机盐培养基(M9MM)配方(1L)：8.5g Na₂HPO₄·2H₂O，3.0g KH₂PO₄，1.0g NH₄Cl，0.49g MgSO₄·7H₂O，0.011g CaCl₂，NaCl的量根据需要加入。微量元素：0.4mg CuSO₄，1.0mg KI，4.0mg MnSO₄·H₂O，4.0mg ZnSO₄·7H₂O，5.0mg H₃BO₃，1.6mg H₂MoO₄·2H₂O，2.0mg FeCl₃·6H₂O。pH值根据需要调节。

混合烃组成：将上述烃类混合在一起即得到降解实验所需要的碳源，混合烃由以下组分组成(质量分数)：n-C16(0.2)，n-C18(0.2)，n-C19(0.1)，n-C26 (0.1)，n-C28(0.1)，萘(0.1)，菲(0.1)，芘(0.1)。将其中固体的组分添加到液体组分中，100℃加热30分钟得到均一的液相混合物。其中直链烃与PAHs的比例与原油中脂肪烃和芳香烃的比例相近。

无菌操作将单菌接种于灭过菌的盛有25ml无机盐培养基的50ml锥形瓶中(含0.125g混合烃)(如图5所示)，30℃、160rpm条件下，振荡培养7d。气相色谱检测降解结果。

由图6可知经过7天的培养，B05几乎能够降解掉全部的短链烃和中长链烃，对长链烃的降解率也能达到70％以上，说明B05对烷烃的降解效果非常好；但是B05对多环芳烃的降解效果不太好，培养7天之后，对菲和芘的降解率均小于10％。

B03和B04对短链和中长链烷烃也有较好的降解效果，其中B03经过7天的时间能够降解掉大于80％的正十六烷和正十八烷，对于C26和C28的降解率也能达到20％，对多环芳烃菲和芘的降解效果依然不理想。B04降解效果虽然不如B05和B03好，但对烷烃依然有较好的降解效果。B01对石油烃的降解效果较差。

Claims

1.一种耐盐碱石油烃降解菌的分离筛选方法，其特征在于，其步骤如下：

3)驯化培养：然后取富集液10mL接种于新鲜原油无机盐培养基中，相同条件连续培养4～5次，每次驯化为在30℃、160rpm条件下，在恒温振荡器中振荡培养7d。驯化过程中培养基的pH、盐度和原油含量逐渐升高，具体条件如表1所示；

6)菌株鉴定：对上述分离出的石油烃降解菌进行分子生物学鉴定，利用OMEGA bio-tec细菌DNA提取试剂盒D3350-01对每种菌株的基因组DNA进行提取。提取结果通过1％的琼脂糖凝胶电泳来监测。对提取的DNA进行16S rDNAPCR扩增，将16S rDNA PCR产物送至测序公司测序，然后将测定的序列在GenBank中用Blast软件与已知序列进行同源性分析；

7)耐盐碱性检测：以LB液体培养基为基础，将NaCl浓度分别设置为5、10、20、30、50、70、90、110g/L，菌液接种量为1％，pH调至7.0～7.2，30℃、180rpm恒温摇床培养至对数期，于600nm波长处测定吸光度OD值，测定菌株的耐盐性；以LB液体培养基为基础，将pH值分别设置为5、6、7、8、9、10、11，盐度设置为1％，接种量为1％，30℃、180rpm恒温摇床培养至对数期，于600nm波长处测定吸光度OD值，测定菌株的耐碱性；

8)降解率测定：将适量石油烃加入无机盐培养基(M9MM)中，灭菌之后接种菌液，在150rpm，30℃条件下培养7天。降解完成之后的样品用1∶1H₂SO₄酸化至PH为2，加入1gNaCl(25ml体系)破乳化作用，然后加入20ml二氯甲烷60w条件下超声萃取15min，用分液漏斗将水相和有机相分离，剩余水相中再添加20ml二氯甲烷，重复上述超声萃取过程，此过程进行三次，收集有机相，无水硫酸钠脱水，40℃旋蒸蒸干，并用色谱纯二氯甲烷定容。样品制备完成之后，用配备有HP-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25um)，FID检测器的气象色谱仪来检测，计算降解率。

2.权利要求1所述的无机盐培养基(M9MM)，其特征在于，无机盐培养基成分为(1L)：8.5g Na₂HPO₄·2H₂O，3.0g KH₂PO₄，1.0g NH₄Cl，0.49g MgSO₄·7H₂O，0.011g CaCl₂，NaCl的量根据需要加入。微量元素：0.4mg CuSO₄，1.0mg KI，4.0mgMnSO₄·H₂O，4.0mg ZnSO₄·7H₂O，5.0mg H₃BO₃，1.6mg H₂MoO₄·2H₂O，2.0mgFeCl₃·6H₂O。其中1mol/l的MgSO₄·7H₂O和1mol/l的CaCl₂分开灭菌之后再加入培养基中。

3.权利要求1所述的鉴定高效石油烃降解菌的方法，其特征在于：所述PCR引物为27F(5-AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3)与1492R(5-TACggTTACCTTgTTACgATCC-3)。

4.权利要求1所述的PCR反应体系(50uL)为：3ul模版DNA，5ul 10×4ul dNTPs(2.5mM)，1ul27F、1492R各1ul，35ul ddH2O。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃预变性1min，退火温度从65℃到55℃，每个循环降低1℃，72℃延伸1min，共10个循环；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25个循环，再72℃延伸7min。用1％琼脂糖凝胶电泳监测PCR产物。

5.权利要求1所述的GC检测条件如下：氮气作为载气；不分流模式；进样口温度和检测器温度都为300℃；柱箱温度为：40℃保持0.5min，以每分钟15℃的速度升至290℃并保持5min。

6.权利要求1所筛选的耐盐碱石油烃降解菌，其特征在于：其应用于盐碱性石油烃污染土壤的生物修复。