CN103160452A - 一种产生物表面活性剂烃降解菌的分离筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速从油污土壤中分离并筛选产表面活性剂石油烃降解纯菌株的方法。首先从油田采集油污土壤，按5％的量添加至原油为唯一碳源并且含量逐渐提高的烃降解培养基中，在恒温摇床上进行富集培养。富集后的菌液稀释到一定程度后在血平板上涂布培养，30℃培养1-3d，取血平板上透明圈边缘清晰而大的菌落，液体肉胨培养基培养后用灭菌牙签钝头蘸取菌液点种于油平板上，30℃培养3d，取噬油斑明显且较大的菌落接种于肉胨斜面并保存备用并用肉胨培养基培养后，先后接种烃降解培养基和产表面活性剂培养基中，30℃培养7d和3d，测定烃降解能力和产表面活性剂的能力，获得产表面活性剂的石油烃降解菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，属于环境生物工程和环境微生物领域。
背景技术
随着石油的开采、运输和泄漏以及含油废水的排放，每年有800多万吨石油进入环境，污染土壤、地下水、河流和海洋，对生态环境造成了很大危害，影响生产和人民生活。因此，石油污染问题引起了人们越来越多的关注，对之进行治理也成为了最迫切的事情。
石油污染环境的修复有物理、化学和生物修复等三种方法。微生物修复技术是生物修复中最重要、最核心的组成部分，具有成本低、应用方法简单、污染物氧化完全、无二次污染、可原位处理、不需大型设备等优点，日益引起重视。
微生物修复的关键技术是选用高效的石油烃降解菌株。主要在被石油污染的水环境和土壤环境中采样后进行分离和筛选。虽然产表面活剂被认为是微生物乳化石油促进降解的机制之一，但筛选产表面活性剂的烃降解菌的方法尤其是高效初筛方法仍令研究者感到困难。因此，本发明结合发明人自身的研究体会，归纳并有所创新，提出了一套较简洁高效的产表面活性剂烃降解菌的分离和筛选方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种产表面活性剂的烃降解菌的分离 筛选方法，能够较快地分离与纯化到既产较高产量的表面活性剂，又有效去除石油烃污染的降解纯菌株。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
具体方法步骤为：
(1)取样：取原油污染地或加油站附近污染表层5-20cm深的土样，记录采集位置、土壤含水量、含油量等，进行编号；
(2)富集培养：各土样按质量体积比5％加入含有原油的矿质盐培养基(MSM，加入原油作为唯一碳源后称烃降解培养基)中，原油含量分别0.5％、1.0％和1.5％，每个浓度在30℃条件下培养7天，之后转移至更高浓度原油的烃降解培养基中，直到含油1.5％的培养基培养完成，驯化结束，使能利用原油做单一碳源的微生物得到富集；
矿质盐培养基按以下方法配制(/L)：MgSO40.2g，KH2PO41.0g，(NH4)2SO41.0g，CaCl20.02g，K2HPO41.0g，FeCl30.05g，蒸馏水1L，pH值最后调整为7.0-7.2，做发酵培养基时，事先在250mL三角瓶中加入一定量的原油，再加入50mL MSM，121℃灭菌20min备用。
(3)血平板分离：取富集后的菌液，稀释至适宜倍数涂布于血平板上，30℃培养1-3天，直到有明显的溶血圈产生(见图1)，平板采用肉胨培养基中加入5-7％的脱纤维羊血获得。肉胨培养基成份为(/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，纯净水或自来水1L，调pH至7.0左右。配制血平板时要加1.5％的琼脂粉，灭菌后取出冷却至50℃左右时，加入5-7％的脱纤维无菌羊血，迅速分配至培养皿中，冷却后即得血平板，血平板不耐贮存，一般随用随配；
(4)油平板分离：挑取血平板上产透明圈的菌株50个左右，肉胨培养基活化后接种于油平板上，用牙签钝头接种于油平板上，每个油平板接种4-5个菌株。 30℃条件下培养3天(见图2)；
油平板配制方法如下：将原油溶于浓度10％的石油醚中，滤纸剪成直径85mm，置90mm培养皿中，加2mL10％石油溶液，待石油醚挥发后，121℃蒸汽高压灭菌20min，取出烘干备用。MSM中事先加入1.5％的琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即成油平板。
(5)菌种保存、编号：挑取油平板产噬油斑的菌落接种于斜面中30℃培养1-2天长出菌苔后，置4℃备用；
(6)烃降解能力摇瓶鉴定和筛选：取平板初筛出来的菌株，用液体肉胨培养基(肉汤培养基)做种子培养后接于含原油1％的烃降解培养基中，30℃摇床培养7d，观察原油乳化和降解情况，挑取原油乳化或降解明显的摇瓶(见图3)，测定残余烃的量和发酵液离心后的上清液的表面张力，测定残余烃的量和发酵液离心后的上清液的表面张力。测定残余烃的量采用重量法，测定表面张力采用表面张力仪进行(见图4)；
(7)产表面活性剂能力摇瓶鉴定：取上述原油降解率较高且发酵液上清液表面张力明显降低的菌株接种于产表面活性剂培养基(碳源可以是葡萄糖、废弃植物油脂等)，30℃培养3d后测定表面张力和发酵液排油圈大小。测定表面张力采用表面张力仪，排油圈测定大小的方法是：在90mm培养皿小盖中，加入15mL去离子水，滴加200mL柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取样器加入10uL的发酵液。如果排油圈直径超过培养皿小盖的直径，则将发酵液稀释10倍后再加入。产表面活性剂培养基成份为：NaNO32.5g，K2HPO44.0g，KH2PO44.0g，CaCl2·2H2O0.1g，MgSO40.2g，NaCl1.0g，KCl1.0g，酵母粉1.0g，甘油30g，去离子水1000mL，pH值最后调整为6.5，分装摇瓶后加入碳源，121℃灭菌后备用；
(8)菌种保存：既可在烃降解培养基中降解石油，降低表面张力并可以在产表活培养基中明显降低表面张力、排油圈直径大于3的菌株接种于肉胨培养基斜面中，30℃培养1-2天长出菌苔后，置4℃备用；
(9)摇瓶发酵验证：取上述入选菌株按上述(6)～(7)的方法进行1-2轮摇瓶发酵验证，最终获得既可在烃降解培养基中降解石油，降低表面张力并可以在产表活培养基中明显降低表面张力、排油圈直径大于3的菌株保留，最终获得产表面活性剂的石油烃降解菌。
由于采用上述技术方案，本发明所具有的优点和有益效果是：能够较快地分离与纯化到既产较高产量的表面活性剂，又有效去除石油烃污染的降解纯菌株。
具体实施方式
本发明提供一种快速从油污土壤中分离并筛选产表面活性剂石油烃降解纯菌株的方法。首先从油田采集油污土壤，按5％的量添加至原油为唯一碳源并且含量逐渐提高(0.5％、1％和1.5％)的烃降解培养基中，在30℃、180rmp转速的恒温摇床上进行耐油污驯化和富集培养，一般每个原油梯度培养时间为1周，共3周时间。富集后的菌液稀释到一定程度后在血平板上涂布培养，30℃培养1-3d，取血平板上透明圈边缘清晰而大的的菌落，接种于液体肉胨培养基中过夜培养，培养基浑浊后用灭菌牙签钝头蘸取菌液点种于油平板上，30℃培养3d，取噬油斑明显且较大的菌落接种于肉胨斜面并保存备用。液体肉胨培养基(肉汤培养基)培养后，按1％的接种量接入烃降解培养基中，30℃培养7d，测定烃降解率和发酵液上清表面张力，表现好的菌株再接入产表面活性剂培养基中，30℃培养3天后评价产表面活性剂的能力，通过综合评价，即得产表面活性剂的石油烃降解菌株。通过这种方法得到的微生物多是细菌。
通过以上方法，先后从大庆油田、胜利油田、河南油田、江苏油田等油田采集土样和水样，进行了烃降解菌的分离和筛选工作，获得50多个有价值和有潜力的产表面活性剂的烃降解菌株，其中Z1、Z41、Z49、HBO3、10-18等表现较好。其中Z41为铜绿假单胞菌，利用单个菌株进行摇瓶好氧培养，周降解率稳定在40％以上，可利用废弃食用油脂产表面活性剂，有效产物经鉴定为鼠李糖脂，单菌株摇瓶好氧发酵条件下，产量10g/L以上，发酵液稀释100倍后表面张力在35-40mN/m左右，CMC在174.0mg/L左右，对柴油、石蜡、原油等均可较好地乳化(见图5)。
Claims (3)
1.一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，其特征是：
具体方法步骤为：
(1)取样：取原油污染地或加油站附近污染表层5-20cm深的土样，记录采集位置、土壤含水量、含油量等，进行编号；
(2)富集培养：各土样按质量体积比5％加入含有原油的矿质盐培养基(MSM，加入原油作为唯一碳源后称烃降解培养基)中，原油含量分别0.5％、1.0％和1.5％，每个浓度在30℃条件下培养7天，之后转移至更高浓度原油的烃降解培养基中，直到含油1.5％的培养基培养完成，驯化结束，使能利用原油做单一碳源的微生物得到富集；
(3)血平板分离：取富集后的菌液，稀释至适宜倍数涂布于血平板上，30℃培养1-3天，直到有明显的溶血圈产生(见图1)，平板采用肉胨培养基中加入5-7％的脱纤维羊血获得。肉胨培养基成份为(/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，纯净水或自来水1L，调pH至7.0左右。配制血平板时要加1.5％的琼脂粉，灭菌后取出冷却至50℃左右时，加入5-7％的脱纤维无菌羊血，迅速分配至培养皿中，冷却后即得血平板，血平板不耐贮存，一般随用随配；
(4)油平板分离：挑取血平板上产透明圈的菌株50个左右，肉胨培养基活化后接种于油平板上，用牙签钝头接种于油平板上，每个油平板接种4-5个菌株。30℃条件下培养3天(见图2)；
(5)菌种保存、编号：挑取油平板产噬油斑的菌落接种于斜面中30℃培养1-2天长出菌苔后，置4℃备用；
(6)烃降解能力摇瓶鉴定和筛选：取平板初筛出来的菌株，用液体肉胨培养基(肉汤培养基)做种子培养后接于含原油1％的烃降解培养基中，30℃摇床培养7d，观察原油乳化和降解情况，挑取原油乳化或降解明显的摇瓶(见图3)，测定残余烃的量和发酵液离心后的上清液的表面张力，测定残余烃的量和发酵液离心后的上清液的表面张力。测定残余烃的量采用重量法，测定表面张力采用表面张力仪进行(见图4)；
(7)产表面活性剂能力摇瓶鉴定：取上述原油降解率较高且发酵液上清液表面张力明显降低的菌株接种于产表面活性剂培养基(碳源可以是葡萄糖、废弃植物油脂等)，30℃培养3d后测定表面张力和发酵液排油圈大小。测定表面张力采用表面张力仪，排油圈测定大小的方法是：在90mm培养皿小盖中，加入15mL去离子水，滴加200mL柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取样器加入10uL的发酵液。如果排油圈直径超过培养皿小盖的直径，则将发酵液稀释10倍后再加入。产表面活性剂培养基成份为：NaNO32.5g，K2HPO44.0g，KH2PO44.0g，CaCl2·2H2O0.1g，MgSO40.2g，NaCl1.0g，KCl1.0g，酵母粉1.0g，甘油30g，去离子水1000mL，pH值最后调整为6.5，分装摇瓶后加入碳源，121℃灭菌后备用；
(8)菌种保存：既可在烃降解培养基中降解石油，降低表面张力并可以在产表活培养基中明显降低表面张力、排油圈直径大于3的菌株接种于肉胨培养基斜面中，30℃培养1-2天长出菌苔后，置4℃备用；
(9)摇瓶发酵验证：取上述入选菌株按上述(6)～(7)的方法进行1-2轮摇瓶发酵验证，最终获得产表面活性剂的石油烃降解菌；
(10)摇瓶鉴定：既可在烃降解培养基中降解石油，降低表面张力并可以在产表活培养基中明显降低表面张力、排油圈直径大于3的菌株保留，再进行1-2轮摇瓶发酵验证，最终获得产表面活性剂的石油烃降解菌。
2.根据权利要求1所述的一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，其特征是：矿质盐培养基按以下方法配制(/L)：MgSO40.2g，KH2PO4l.0g，(NH4)2SO41.0g，CaCl20.02g，K2HPO41.0g，FeCl30.05g，蒸馏水1L，pH值最后调整为7.0-7.2，做发酵培养基时，事先在250mL三角瓶中加入一定量的原油，再加入50mL MSM，121℃灭菌20min备用。
3.根据权利要求1所述的一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，其特征是：油平板配制方法如下：将原油溶于浓度10％的石油醚中，滤纸剪成直径85mm，置90mm培养皿中，加2mL10％石油溶液，待石油醚挥发后，121℃蒸汽高压灭菌20min，取出烘干备用。MSM中事先加入1.5％的琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即成油平板。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130619 |