CN112662601A - 修复石油污染土壤微生物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了修复石油污染土壤微生物的筛选方法，属于环境保护技术领域，其特征在于包括：石油污染土壤样品的采集；降解石油烃微生物的富集培养；降解石油烃微生物的筛选纯化，降解石油烃微生物的富集培养基：还包括菌剂和助剂，菌剂为生脂固氮螺杆菌，助剂为十二烷基硫酸钠，本发明的有益效果是：在富集培养过程中添加了石油醚，石油醚改变了原油在培养基中的状态，利于菌体的吸收利用，提高菌种的富集率；十二烷基硫酸钠不仅利用乳化效果将石油‑石油醚乳化物形成乳糜，进一步地促进了反应进行，十二烷基硫酸钠还起到了激活的效果，解除了环境导致生脂固氮螺杆菌产生酶受到的抑制，促进解原油的菌体生长的营养物质的产生，保证原油降解率。
Description
技术领域：
本发明属于环境保护技术领域，更具体地涉及修复石油污染土壤微生物的筛选方法。
背景技术：
石油开采、炼制、加工、运输及使用过程中出现的原油泄漏与溢油事故，会严重污染当地的土壤和水体。石油污染会破坏土壤结构和功能，影响透气性和渗水性，造成土壤肥力下降、土壤板结等问题。但石油烃降解率慢，传统方法筛选降解石油烃的微生物，菌种获得率少，种类单一，所需时间长，难以获得大规模应用。
发明内容：
为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种修复石油污染土壤微生物的筛选方法，能够有效的解决上述问题。
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于包括：
(1)石油污染土壤样品的采集；
(2)降解石油烃微生物的富集培养：包括配制富集培养基，将配制好的富集培养基加入好氧发生器，然后将步骤(1)中采集的石油土壤样品添加至反应器中，控制反应器温度28-32℃，pH值为6.8-7.4，富集培养3-4d；
(3)降解石油烃微生物的筛选纯化：
将步骤(2)中富集得到的菌液，逐级稀释后涂布在筛选纯化培养基平板，30℃培养2-3d，挑取单个纯菌落转接到新的筛选纯化培养基平板；
重复纯化步骤3-4次，即得到纯化的石油污染土壤修复微生物菌种。
步骤(2)中降解石油烃微生物的富集培养基：按如下对应重量份的物质配制：2-3份硝酸铵、0.05-0.15份磷酸氢二钠、0.03-0.07份七水硫酸镁、0.04-0.06份磷酸二氢钾、0.02-0.04份氯化镁、0.1-0.3份氯化钠、0.005-0.015份氯化钙、0.005-0.015份硫酸亚铁、0.005-0.015份氯化锌、4-5份原油、6-8份石油醚、100份水。
所述步骤(2)中降解石油烃微生物的富集培养基：还包括0.01-0.02份菌剂和0.03-0.05份助剂。
所述菌剂为生脂固氮螺杆菌，所述助剂为十二烷基硫酸钠。
所述的富集培养基的配置方法，包括将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，并将富集培养基中对应重量份的物质溶于水中，再将原油-石油醚混合溶液加入水中充分搅拌混合，待用。
所述的纯化培养基0.01-0.03份硫酸镁、0.05-0.15份磷酸氢二钾、6-8份硝酸铵、0.4-0.6份硫乙醇酸钠、4-5份原油、6-8份石油醚、1.8-2份琼脂。
所述配制筛选纯化培养基，将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，
滤纸剪成直径85mm，置90mm培养皿中，加2mL原油-石油醚混合溶液，待石油醚挥发后，121℃蒸汽高压灭菌20min，取出烘干备用，
并将筛选纯化培养基中对应重量份的物质溶于水中，加入琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即到筛选纯化培养基平板。
本发明的有益效果是：
(1)本发明能够有效富集筛选得到降解石油烃微生物菌种，对石油污染土壤修复提供技术支持，增加石油污染土壤修复的菌种资源，
(2)本发明创造性地在富集培养过程中添加了石油醚，石油醚改变了原油在培养基中的状态，利于菌体的吸收利用，提高菌种的富集率；
(3)使用好氧反应器富集石油污染土壤中的微生物，所需时间少，富集得到的菌种种类多；
(4)在富集培养基中添加了菌剂和助剂，生脂固氮螺杆菌为降解石油的菌种前期生长提供营养基础，十二烷基硫酸钠不仅利用乳化效果将石油-石油醚乳化物形成乳糜，进一步地促进了反应进行，十二烷基硫酸钠还起到了激活的效果，解除了环境导致生脂固氮螺杆菌产生酶受到的抑制，促进解原油的菌体生长的营养物质的产生，保证原油降解率。
具体实施方式：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的具体实施方式：
实施例一：
修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于包括：
(1)石油污染土壤样品的采集；
(2)降解石油烃微生物的富集培养：包括配制富集培养基，将配制好的富集培养基加入好氧发生器，然后将步骤(1)中采集的石油土壤样品添加至反应器中，控制反应器温度28℃，pH值为6.8，富集培养3d；
(3)降解石油烃微生物的筛选纯化：
将步骤(2)中富集得到的菌液，逐级稀释后涂布在筛选纯化培养基平板，30℃培养2d，挑取单个纯菌落转接到新的筛选纯化培养基平板；
重复纯化步骤3次，即得到纯化的石油污染土壤修复微生物菌种。
步骤(2)中降解石油烃微生物的富集培养基：按如下对应重量份的物质配制：2份硝酸铵、0.05份磷酸氢二钠、0.03份七水硫酸镁、0.04份磷酸二氢钾、0.02份氯化镁、0.1份氯化钠、0.005份氯化钙、0.005份硫酸亚铁、0.005份氯化锌、4份原油、6份石油醚、100份水。
所述步骤(2)中降解石油烃微生物的富集培养基：还包括0.01份菌剂和0.03份助剂。
所述菌剂为生脂固氮螺杆菌，所述助剂为十二烷基硫酸钠。
所述的富集培养基的配置方法，包括将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，并将富集培养基中对应重量份的物质溶于水中，再将原油-石油醚混合溶液加入水中充分搅拌混合，待用。
所述的纯化培养基0.01份硫酸镁、0.05份磷酸氢二钾、6份硝酸铵、0.4份硫乙醇酸钠、4份原油、6份石油醚、1.8份琼脂。
所述配制筛选纯化培养基，将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，
滤纸剪成直径85mm，置90mm培养皿中，加2mL原油-石油醚混合溶液，待石油醚挥发后，121℃蒸汽高压灭菌20min，取出烘干备用，
并将筛选纯化培养基中对应重量份的物质溶于水中，加入琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即到筛选纯化培养基平板。
实施例二：
修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于包括：
(1)石油污染土壤样品的采集；
(2)降解石油烃微生物的富集培养：包括配制富集培养基，将配制好的富集培养基加入好氧发生器，然后将步骤(1)中采集的石油土壤样品添加至反应器中，控制反应器温度32℃，pH值为7.4，富集培养4d；
(3)降解石油烃微生物的筛选纯化：
将步骤(2)中富集得到的菌液，逐级稀释后涂布在筛选纯化培养基平板，30℃培养3d，挑取单个纯菌落转接到新的筛选纯化培养基平板；
重复纯化步骤4次，即得到纯化的石油污染土壤修复微生物菌种。
步骤(2)中降解石油烃微生物的富集培养基：按如下对应重量份的物质配制：3份硝酸铵、0.15份磷酸氢二钠、0.07份七水硫酸镁、0.06份磷酸二氢钾、0.04份氯化镁、0.3份氯化钠、0.015份氯化钙、0.015份硫酸亚铁、0.015份氯化锌、5份原油、8份石油醚、0.02份菌剂、0.05份助剂、100份水。
所述菌剂为生脂固氮螺杆菌，所述助剂为十二烷基硫酸钠。
所述的富集培养基的配置方法，包括将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，并将富集培养基中对应重量份的物质溶于水中，再将原油-石油醚混合溶液加入水中充分搅拌混合，待用。
所述的纯化培养基0.03份硫酸镁、0.15份磷酸氢二钾、8份硝酸铵、0.6份硫乙醇酸钠、5份原油、8份石油醚、2份琼脂。
所述配制筛选纯化培养基，将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，
滤纸剪成直径85mm，置90mm培养皿中，加2mL原油-石油醚混合溶液，待石油醚挥发后，121℃蒸汽高压灭菌20min，取出烘干备用，
并将筛选纯化培养基中对应重量份的物质溶于水中，加入琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即到筛选纯化培养基平板。
实施例三：
修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于包括：
(1)石油污染土壤样品的采集；
(2)降解石油烃微生物的富集培养：包括配制富集培养基，将配制好的富集培养基加入好氧发生器，然后将步骤(1)中采集的石油土壤样品添加至反应器中，控制反应器温度30℃，pH值为7.0，富集培养3.5d；
(3)降解石油烃微生物的筛选纯化：
将步骤(2)中富集得到的菌液，逐级稀释后涂布在筛选纯化培养基平板，30℃培养2.5d，挑取单个纯菌落转接到新的筛选纯化培养基平板；
重复纯化步骤3-4次，即得到纯化的石油污染土壤修复微生物菌种。
步骤(2)中降解石油烃微生物的富集培养基：按如下对应重量份的物质配制：2.5份硝酸铵、0.1份磷酸氢二钠、0.05份七水硫酸镁、0.05份磷酸二氢钾、0.03份氯化镁、0.2份氯化钠、0.01份氯化钙、0.01份硫酸亚铁、0.01份氯化锌、4.5份原油、7份石油醚、0.015份菌剂、0.04份助剂、100份水；
所述菌剂为生脂固氮螺杆菌，所述助剂为十二烷基硫酸钠。
所述的富集培养基的配置方法，包括将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，并将富集培养基中对应重量份的物质溶于水中，再将原油-石油醚混合溶液加入水中充分搅拌混合，待用。
所述的纯化培养基0.02份硫酸镁、0.1份磷酸氢二钾、7份硝酸铵、0.5份硫乙醇酸钠、4.5份原油、7份石油醚、1.9份琼脂。
所述配制筛选纯化培养基，将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，
滤纸剪成直径85mm，置90mm培养皿中，加2mL原油-石油醚混合溶液，待石油醚挥发后，121℃蒸汽高压灭菌20min，取出烘干备用，
并将筛选纯化培养基中对应重量份的物质溶于水中，加入琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即到筛选纯化培养基平板。
为了更加直观的展现本发明的富集培养工艺优势，特以本发明和相同工艺采用等效替换的方法进行对比，
对比例一：
制备方法同实施例三，所不同的是：本对比例的制备过程中，未添加石油醚；
对比例二：
制备方法同实施例三，所不同的是：本对比例的制备过程中，未添加菌剂；
对比例三：
制备方法同实施例三，所不同的是：本对比例的制备过程中，未添加助剂；
对比例四：
制备方法同实施例三，所不同的是：本对比例的制备过程中，将助剂中的十二烷基硫酸钠替换成常规表面活性剂单硬脂酸甘油酯；
将上述对比例进行在同一检测水平和检测方法下，对原油的降解率和菌体的个数进行测定，其中原油的降解率通过发酵过滤菌液后，并利用一倍体积的石油醚漂洗菌体，将漂洗液混合后，进行测量原油的含量，最后折算成最终的原油降解率；其中菌体的个数采用测定细菌菌体光密度；
表1：不同工艺对于原油降解率和菌体生长的影响
| 石油醚 | 生脂固氮螺杆菌 | SDS | 原油降解率 | OD | |
| 实施例三 | + | + | + | 99％ | 0.64 |
| 对比例一 | - | + | - | 52％ | 0.31 |
| 对比例二 | + | - | + | 64％ | 0.42 |
| 对比例三 | + | + | - | 68％ | 0.45 |
| 对比例四 | + | + | 单硬脂酸甘油酯 | 77％ | 0.48 |
根据上述试验数据分析可知：
(1)实施例三与对比例一对比可知：对比例一中原油降解率较低，菌体个数稍低，经过镜检对比例一的菌体为复合菌种，多数为生脂固氮螺杆菌，
这可能是由于对比例一没有添加石油醚和十二烷基硫酸钠，原油在培养基中以分层状态存在，非常不利于土壤中的微生物生长利用，原油降解率最低，
而实施例三通过添加石油醚和十二烷基硫酸钠，石油醚能将石油溶解，并在十二烷基硫酸钠作用下与水介质形成个体较小的乳糜状态，利于土壤中的微生物利用；
(2)实施例三与对比例二对比可知：
对比例二在富集培养过程中，培养基乳糜化效果较好，菌体前期生长缓慢，原油降解率为64％，优于对比例一且低于实施例三；
这可能是由于石油醚生长环境不利于降解原油的菌体生长的原因导致的；菌种前期生长较为缓慢，影响了原油降解率；
(3)实施例三与对比例三对比可知：
对比例三在富集培养过程中，培养基乳化效果较好，但没形成颗粒较小的乳糜物，菌体生长较好，原油降解率较低，且与对比例二差异性不大；
经过镜检：生脂固氮螺杆菌生长正常，降解原油的菌体依旧前期生长缓慢，降解原油的菌体生长受到抑制；
这可能是由于生脂固氮螺杆菌在该环境下产生的酶受到抑制，无法生成利于土壤内能够降解原油的菌体生长的营养物质，虽然添加了生脂固氮螺杆菌但是效果不明显；
(4)对比例二和对比例三对比可知：
对比例三形成了原油和石油醚的混合乳浊物，但是没形成颗粒较小的乳糜物，虽然添加了生脂固氮螺杆菌，菌体生长较好，经过镜检菌体多数为生脂固氮螺杆菌，降解率差异性不大；
(5)实施例三、对比例三与对比例四对比可知：通过等效替换乳化剂和表面活性剂-单硬脂酸甘油酯，此时对比例四形成了原油和石油醚的混合乳浊物，也形成颗粒较小的乳糜物，但是原油降解率仍较低；
其中：
Ⅰ：对比例四的原油降解率较对比例三有了一定的提高，说明了：乳糜物的产生利于土壤内能够降解原油的菌体的利用；
Ⅱ：对比例四的原油降解率较对实施例三又存在一定的差距；这说明了：区别于单硬脂酸甘油酯，十二烷基硫酸钠不仅能够对原油和石油醚的混合乳浊物，实现乳化效果，形成颗粒较小的乳糜物，利于土壤内能够降解原油的菌体的利用，还具有激活的效果，解除生脂固氮螺杆菌产生酶受到的抑制，从而生成利于土壤内能够降解原油的菌体生长的营养物质。
综上所述：
(1)本发明能够有效富集筛选得到降解石油烃微生物菌种，对石油污染土壤修复提供技术支持，增加石油污染土壤修复的菌种资源，
(2)本发明创造性地在富集培养过程中添加了石油醚，石油醚改变了原油在培养基中的状态，利于菌体的吸收利用，提高菌种的富集率；
(3)使用好氧反应器富集石油污染土壤中的微生物，所需时间少，富集得到的菌种种类多；
(4)在富集培养基中添加了菌剂和助剂，生脂固氮螺杆菌为降解石油的菌种前期生长提供营养基础，十二烷基硫酸钠不仅利用乳化效果将石油-石油醚乳化物形成乳糜，进一步地促进了反应进行，十二烷基硫酸钠还起到了激活的效果，解除了环境导致生脂固氮螺杆菌产生酶受到的抑制，促进解原油的菌体生长的营养物质的产生，保证原油降解率。
Claims (7)
1.修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于包括：
(1)石油污染土壤样品的采集；
(2)降解石油烃微生物的富集培养：包括配制富集培养基，将配制好的富集培养基加入好氧发生器，然后将步骤(1)中采集的石油土壤样品添加至反应器中，控制反应器温度28-32℃，pH值为6.8-7.4，富集培养3-4d；
(3)降解石油烃微生物的筛选纯化：
将步骤(2)中富集得到的菌液，逐级稀释后涂布在筛选纯化培养基平板，30℃培养2-3d，挑取单个纯菌落转接到新的筛选纯化培养基平板；
重复纯化步骤3-4次，即得到纯化的石油污染土壤修复微生物菌种。
2.根据权利要求1所述的修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于步骤(2)中降解石油烃微生物的富集培养基：按如下对应重量份的物质配制：2-3份硝酸铵、0.05-0.15份磷酸氢二钠、0.03-0.07份七水硫酸镁、0.04-0.06份磷酸二氢钾、0.02-0.04份氯化镁、0.1-0.3份氯化钠、0.005-0.015份氯化钙、0.005-0.015份硫酸亚铁、0.005-0.015份氯化锌、4-5份原油、6-8份石油醚、100份水。
3.根据权利要求2所述的修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中降解石油烃微生物的富集培养基：还包括0.01-0.02份菌剂和0.03-0.05份助剂。
4.根据权利要求3所述的修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于所述菌剂为生脂固氮螺杆菌，所述助剂为十二烷基硫酸钠。
5.根据权利要求4所述的修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于所述的富集培养基的配置方法，包括将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，并将富集培养基中对应重量份的物质溶于水中，再将原油-石油醚混合溶液加入水中充分搅拌混合，待用。
6.根据权利要求1所述的修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于所述的筛选纯化培养基0.01-0.03份硫酸镁、0.05-0.15份磷酸氢二钾、6-8份硝酸铵、0.4-0.6份硫乙醇酸钠、4-5份原油、6-8份石油醚、1.8-2份琼脂。
7.根据权利要求6所述的修复石油污染土壤微生物的筛选方法，其特征在于配制所述筛选纯化培养基:将原油溶于石油醚中得到原油-石油醚混合溶液，将滤纸置培养皿中，加原油-石油醚混合溶液，待石油醚挥发后，121℃蒸汽高压灭菌20min，取出烘干备用，并将筛选纯化培养基中对应重量份的物质溶于水中，加入琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即到筛选纯化培养基平板。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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