CN103461389B - 一种防治根结线虫的复合微生物菌剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物防治领域，涉及一种可防止土壤中的有害生物线虫的生物菌剂，具体为一种防治根结线虫的复合微生物菌剂及制备方法。该复合微生物菌剂包括淡紫拟青霉(Penicilliumlilacinum)发酵液和短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）发酵液。每毫升复合微生物菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108-1.0×1010个，短小芽孢杆菌的孢子个数为1.0×108-1.0×1010个。将淡紫拟青霉菌剂和短小芽孢杆菌菌剂复配在一起后，相比于单独的淡紫拟青霉菌剂或短小芽孢杆菌菌剂，二者呈现出非常显著的协同增效的防治根结线虫功效，对于根结线虫的防效有了显著改善。
Description
技术领域
本发明属于生物防治领域，涉及一种可防止土壤中的有害生物线虫的生物菌剂，具体为一种防治根结线虫的复合微生物菌剂及制备方法。
背景技术
根结线虫主要为害各种蔬菜的根部，表现为侧根和须根较正常增多，并在幼根的须根上形成球形或圆锥形大小不等的白色根瘤，有的呈念珠状。被害株地上部生长矮小、缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。目前已知为害蔬菜的线虫主要有高弓根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫及南方根结线虫。线虫寄主范围广泛，常为害瓜类、茄果类、豆类及萝卜、葫萝卜、莴苣、白菜等30多种蔬菜，还能传播一些真菌和细菌性病害。
目前对线虫的防治主要以化学药剂为主，化学药剂具有速效性好的优点。但是，长期使用化学农药不，仅对害虫有杀伤毒害作用，同时对害虫的“天敌”及传粉昆虫等益虫益鸟也有杀伤作用，因而破坏了自然界的生态平衡。大量使用化学农药，使农药在环境中逐渐积累，尤其是在土壤中，产生了农药污染环境问题。防止农药污染已成为当前世界上很多国家关切的环境问题。农药的使用与农业、林业、牧业等关系密切，因而，农药对土壤的污染是重要的环境问题之一。
发明内容
本发明针对以上技术问题，提供一种可以克服现有的生防制剂在防治根结线虫所存在的菌种和生防机理单一、对环境的适应性差、效果不稳定的问题的一种防治根结线虫的复合微生物菌剂。
本发明的第二个目的是提供一种防治根结线虫的复合微生物菌剂的制备方法。
本发明的具体技术方案如下：
一种防治根结线虫的复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂包括淡紫拟青霉(Penicillium lilacinum)发酵液和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）发酵液。其中每毫升复合微生物菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108-1.0×1010个，短小芽孢杆菌的孢子个数为1.0×108-1.0×1010个。
作为优选，每毫升复合微生物菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个，短小芽孢杆菌的孢子个数为1.0×109个。
可以将复合微生物菌剂制备成液体生防制剂或固体生防制剂。所述的生防制剂包括颗粒制剂、粉剂或液体制剂。
该复合微生物菌剂应用于防治根结线虫。效果较好的可用于防止根结线虫中的花生根结线虫。
本发明通过大量的实验发现，将淡紫拟青霉和短小芽孢杆菌组合在一起得到的复合微生物菌剂，相比于单独的淡紫拟青霉菌剂或短小芽孢杆菌菌剂，复合微生物菌剂具有不同的作用机理，对于根结线虫的防治呈现出显著的协同增效作用。
淡紫拟青霉（Penicillium lilacinum），是南方根结线虫与白色胞囊线虫卵的有效寄生菌，对南方根结线虫的卵寄生率高达60％～70％。对多种线虫都有防治效果，是防治根结线虫最有前途的生防制剂。
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，1.2～1.5×2.0～4.0微米。能运动，革兰氏阳性，芽孢1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生或次端生。短小芽孢杆菌被广泛应用于防治各种植物病害。近年来，国内外对应用短小芽孢杆菌防治植物根结线虫进行了大量的研究，并取得了重要进展，认为短小芽孢杆菌是用于植物根结线虫病生物防治的一种有希望的研究对象。
本发明通过进一步的实验发现，将淡紫拟青霉发酵液和厚短小芽孢杆菌发酵液按照不同的孢子浓度组合得到的不同的复合微生物菌剂，它们之间对于根结线虫的防效也存在较为显著的差异；其中，按孢子数计，当每毫升(或每克)菌剂中含有1.0×108-1.0×1010个的淡紫拟青霉孢子以及1.0×108-1.0×1010个的短小芽孢杆菌孢子，相比于其它孢子浓度的组合，该复合微生物菌剂对于根结线虫的防效有了进一步的显著改善；更进一步的实验发现，每毫升(或每克菌剂)产品中含有1.0×109个的淡紫拟青霉孢子和1.0×109个的短小芽孢杆菌孢子时，该复合微生物菌剂不仅防效最高且防效也更加稳定。
本发明所用到的淡紫拟青霉菌种或短小芽孢杆菌菌种均可通过商业途径购买得到；本领域技术人员可按照本领域的常规方法，例如，采用二级培养方法，分别制备得到淡紫拟青霉菌发酵液或短小芽孢杆菌发酵液，将两种发酵液混合在一起后，按生防菌剂的常规制备方法制备成液体生防制剂(原菌剂)或固体生防菌剂；例如，可向混合后的发酵液中加入载体（如硅藻土、草炭、轻质碳酸钙、高岭土等），制备得到相应的微生物固体制剂，可以是颗粒剂、粉剂等。
施用方法：作为参考，对于液体生防制剂，可以将液体原菌剂用清水稀释10-100倍后与花生种子混合基质施用，可在花生移栽时或对发病花生进行穴施或灌根。
利用微生物或其代谢产物来防治危害农作物的病、虫、草、鼠害及促进作物生长，它包括以菌治虫、以菌治菌、以菌除草等。微生物制剂具有选择性强，对人、畜、农作物和自然环境安全，不伤害天敌，不易产生抗性等特点。随着人们对环境保护越来越高的要求，微生物制剂无疑是今后农药的发展方向之一。
本发明的积极效果为：田间防治根结线虫试验结果表明，将淡紫拟青霉和短小芽孢杆菌复配在一起后，二者呈现出显著的协同增效的生防功效，相比于单独的淡紫拟青霉或短小芽孢杆菌，复合微生物菌剂对于花生根结线虫的防效有非常显著的改善，并且从总体效果来看，复合微生物菌剂对于花生根结线虫的防效也更加稳定。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
淡紫拟青霉(Paecilomyces.lilacinus)菌株购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种商业购买编号为：accc32001。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种商业购买编号为：accc11083。
预备实施例1短小芽孢杆菌发酵液的制备
1、将短小芽孢杆菌菌种活化后，进行摇瓶种子培养；
摇瓶种子培养培养基的组成(按重量百分比计)：
可溶性淀粉1-3%
葡萄糖1-3％
黄豆粉1.5-2.5％
磷酸氢二钾0.05-0.1％
碳酸钙0.05-0.1％
水92.3％-95.4％
液体发酵条件：500ml三角瓶中装入种子培养基200ml，高压灭菌后接种孢子悬浮液，接种量为3-5％，置于24-28℃摇床110-150r/min培养36-72h。
2、液体发酵培养：
液体发酵培养基的组成(按重量百分比计)：
高粱浸汁10-20％
磷酸二氢钾0.2-5％
碳酸钙0.2-0.3％
硫酸铵0.01-0.03％
蔗糖5-7％
水66-85％
将上述液体培养基高压灭菌后备用；
液体发酵条件：发酵温度为从开始到第48小时为30-35℃，48到第72小时为30-33℃，第72小时到第5天为20-25℃。
预备实施例2
淡紫拟青霉(P.lilacinus)发酵液的制备
1、将淡紫拟青霉菌种活化后，进行摇瓶种子培养；
摇瓶种子培养培养基的组成(按重量百分比计)：
葡萄糖1.5-2％
硝酸钠0.4-0.6％
硫酸铵0.2-0.3％
可溶性淀粉0.2-0.3％
磷酸氢二钾0.1-0.2％
硫酸镁0.1-0.2％
水96.4％-97.5％
液体发酵条件：500ml三角瓶中装入种子培养基200ml，高压灭菌后接种孢子悬浮液，接种量为1.5-3％，置于26-29℃摇床150-190r/min培养18-36h。
2、液体发酵培养：
液体发酵培养基的组成(按重量百分比计)：
高粱浸汁10-20％
硝酸钾1-2％
磷酸二氢钾0.2-5％
硫酸镁0.2-0.3％
三氯化镁0.01-0.03％
蔗糖5-7％
水65-84％
将上述液体培养基高压灭菌后备用；
液体发酵条件：发酵温度为从开始到第48小时为28-30℃，48到第72小时为28-30℃，第96小时到第7天为22-25℃。
实施例1：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂1)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例2：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂2)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例3：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂3)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例4：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂4)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例5：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂5)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个/ml。
实施例6：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂6)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个/ml。
实施例7：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂7)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例8：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂8)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个/ml。
实施例9：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂9)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例10：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂10)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1011个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例11：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂11)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例12：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂12)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例13：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂13)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例14：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂14)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例15：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂15)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例16：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂16)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例17：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂17)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×106个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例18：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂18)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例19：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂19)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×106个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例20：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂20)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例21：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂21)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×106个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例22：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂22)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×106个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1011个/ml。
实施例23：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂23)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例24：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂24)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个/ml。
实施例25：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂25)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例26：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂26)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1011个/ml。
实施例27：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂27)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1012个/ml。
实施例28：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂28)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例29：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂29)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例30：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂30)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例31：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂31)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例32：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂32)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1011个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例33：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂33)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例34：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂34)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例35：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂35)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例36：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂36)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例37：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂37)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1011个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例38：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂38)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为0.5×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.5×108个/ml。
实施例39：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂39)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1012个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1012个/ml。
实施例40：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂40)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为0.5×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.5×109个/ml。
实施例41：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂41)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为0.5×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.5×1010个/ml。
实施例42：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂42)
将预备实施例1 所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为0.5×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.5×108个/ml。
实施例43：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂43)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为0.5×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.5×1010个/ml。
实施例44：
复合微生物菌剂的制备(供试菌剂44)
将预备实施例1所制备的短小芽孢杆菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：短小芽孢杆菌孢子个数为1.0×1011个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1011个/ml。
1.1根结线虫的分离和收集
2011年至2012年间，在四川省蒲江县寿安镇花生地采集花生土样，使用随机采样法，采集长有根结的根及其周围的病土，病土采至土壤表层5-20cm处，每个地块随机采5个点，混匀后放入同一个采集袋内，做好标记。将采集的标样带回实验室，在温室以单卵块接种于易感病花生上。
雌虫的分离和收集：单卵块繁殖60d后，取被侵染的花生根，在体视显微镜下将根结表皮用镊子或针尖轻轻拨开，剖面上乳白色的光滑球状物即为根结线虫的雌虫，用解剖针轻轻拨出，放入水中待用。
二龄幼虫的分离和收集：单卵块繁殖60d后，采集被侵染的花生根清水洗净，剪成3cm小段，装入500ml三角瓶中，配制1％(v/v)次氯酸钠溶液，在上述三角瓶中倒入200-300ml次氯酸钠溶液，封口后猛摇3min，立即用蒸馏水冲洗数次，先后过200目和500目筛，用蒸馏水反复冲洗留在500目筛子上的卵，最后用无菌水冲洗收集于无菌的小烧杯。
将上述的卵放于26℃无菌培养箱中孵化3d，得到根结线虫的二龄幼虫。1.2小区试验
1.2.1供试菌剂
试验菌剂：实施例1-47所制备的复合微生物菌剂，按次序分别编号为供试菌剂1-47；
对照菌剂：
对照菌剂1：短小芽孢杆菌发酵液，孢子浓度为1.×108个/ml；
对照菌剂2：短小芽孢杆菌发酵液，孢子浓度为2.0×107个/ml；
对照菌剂3：短小芽孢杆菌发酵液，孢子浓度为1.0×109个/ml；
对照菌剂4：短小芽孢杆菌发酵液，孢子浓度为1.0×1010个/ml；
对照菌剂5：短小芽孢杆菌发酵液，孢子浓度为1.0×1011个/ml；
对照菌剂6：短小芽孢杆菌发酵液，孢子浓度为1.0×1012个/ml；
对照菌剂7：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.0×108个/ml；
对照菌剂8：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.0×107个/ml；
对照菌剂9：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.0×109个/ml；
对照菌剂10：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.0×1010个/ml；
对照菌剂11：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.0×1011个/ml；
对照菌剂12：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.0×1012个/ml；
1.2.2试验作物
四川省蒲江县寿安镇花生地种植的花生。
1.2.3试验设计
实验地点设在线虫虫量大且均匀的四川省蒲江县寿安镇花生种植区种植，药前调查根结线虫二龄幼虫虫口在每100g土壤20-30头。实验分为57组，其中44组为试验组，12组为对照组，1组为清水对照组，具体实验设计如下：
试验1-44组分别采用供试菌剂1-44；
对照1-12组分别采用对照菌剂1-12进行处理。
清水对照：采用清水进行处理(不施加任何防治线虫的药剂)；
每个处理3个重复(分三列，每列100株花生)，各处理随机排列。
8月中旬至9月初进行菌剂小区试验，在花生根部四周扒开根表面10cm厚、半径为50cm的土层，将1毫升的原菌剂用水稀释后采用喷雾方式将稀释后的菌剂均匀喷洒在挖好的坑中，使菌剂分布在根围，再使扒开土壤复位。施药50d后调查花生树根结指数(病情指数)和土壤中二龄幼虫数，评价防治效果。
清水对照组用清水代理稀释的菌剂，不作防线虫处理。
根结指数(病情指数)计算方法：挖出每处理花生根，按照根结线虫分级调查指标进行调查，根结严重度分0-10级，分级标准参照Benjamin等(Benjamin D，Grover C BJ.Comparison of compatible and incompatible response of potatoto Meloidogyneincognita.Journal of Nematology，1987，19218-221)。根结指数计算公式如下：
幼虫减少百分率(相对减退率)计算方法：每小区用取土钻(2cm×H20cm)从作物根围(0-20cm深)采集5个点的土样，充分混匀后，取100g用离心漂浮分离法(Karssen G.The Plant Parasitic Nematode Genus Meloidogyne Goldi，(Tylenchida)in Europe[M].Gent：Drukkeru Modern，1982：5-24.)分离土样中的二龄幼虫，热杀死后用4％福尔马林固定，在倒置显微镜下计数，计算100g土样内根结线虫二龄幼虫数及幼虫减少百分率(相对减退率)。计算公式如下：
相对防治效果计算公式如下：
2 试验结果
表1 复合微生物菌剂对花生根结线虫的防治效果
从表1的试验数据可见，相比于12个对照组，44个试验组对于花生根结线虫的防效呈显著提升，这表明将淡紫拟青霉和短小芽孢杆菌复配在一起对于花生根结线虫呈现出协同增效的生防功效。其中，在44个试验组中，试验3、5、7、8、9、11、14、15、40、41、42、43组对于花生根结线虫的生物防治功效又明显优于其它32个组的生物防治效果，这表明当每毫升(或每克)复合菌剂产品中含有1.0×108-1.0×1010个的淡紫拟青霉孢子以及1.0×108-1.0×1010个的短小芽孢杆菌孢子，所得到的复合微生物菌剂产品对于根结线虫的防效更为显著，防效也更加稳定，尤其是当每毫升(或每克菌剂)产品中含有1.0×109个的淡紫拟青霉孢子和1.0×109个的短小芽孢杆菌孢子时，该复合微生物菌剂不仅防效最高且防效最稳定。
Claims (5)
1.一种防治根结线虫的复合微生物菌剂，其特征在于，该复合微生物菌剂包括淡紫拟青霉发酵液和短小芽孢杆菌发酵液；每毫升复合微生物菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个，短小芽孢杆菌的孢子个数为1.0×109个；或每毫升复合微生物菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个，短小芽孢杆菌的孢子个数为1.0×109个。
2. 按照权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：将复合微生物菌剂制备成液体生防制剂或固体生防制剂。
3. 按照权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述的生防制剂包括颗粒制剂、粉剂或液体制剂。
4. 权利要求1所述的复合微生物菌剂的应用，其特征在于：该复合微生物菌剂应用于防治根结线虫。
5. 按照权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的根结线虫为花生根结线虫。
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