CN102524307A - 防治根结线虫的复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治根结线虫的复合微生物菌剂及其制备方法。本发明复合微生物菌剂包括以下组分：淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus(Thom)Samson）发酵液，厚垣轮枝菌（Verticilliumchlamydosporium）发酵液。田间防治根结线虫试验结果表明，将淡紫拟青霉菌剂和厚垣轮枝菌菌剂复配在一起后，相比于单独的淡紫拟青霉菌剂或厚垣轮枝菌菌剂，二者呈现出非常显著的协同增效的防治根结线虫功效，对于根结线虫的防效有了显著改善。此外，本发明复合微生物菌剂对于根结线虫的整体防效也更趋稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治土壤中植物寄生线虫的生物制剂，尤其涉及一种用于防治根结线虫的复合微生物菌剂，本发明还涉及该复合微生物菌剂的制备方法及其应用，属于根结线虫的生物防治领域。
背景技术
植物寄生线虫为除真菌之外的第二大类作物病原物，其分布广泛，可寄生并危害多种农作物。根结线虫是一类在经济上极为重要的植物专性寄生病原物，而目前生产上使用的杀线剂大都为高毒化学农药，毒性高，既影响人类身体健康，又对环境造成潜在威胁。近年来，一些土壤杀线虫化学药物被禁用，因此，进行植物线虫的生物防治便成为研究的前沿和热点(裴正非，潘沧桑.杀线虫真菌节丛孢属(Arthrobotrys)研究进展[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2003，31(增刊)：173-178.)。与传统的用化学药剂杀灭病虫害相比，生物防治无环境污染，无药物残留，对人畜安全，有利于保护物种的多样性和生态环境的可持续发展(Thomason I.J.Challenges facing nematology：Environmental risks withnematicides and the need for new approaches.Veech，J.A.and Dickson，D.W.Vistas on Nematology.Hyattsville：Society of Nematologists.1987.469-476.
花椒(Zanthoxylum bunfeanum)属芸香科花椒属(Zanthoxylum)植物，属于重要的经济植物，种植花椒是中国很多地方农民增收致富的主要途径之一。近年来，花椒根结线虫成为严重危害花椒生长的新病害，严重时，导致花椒死亡，给该地区花椒种植业带来极大威胁，造成了较大的经济损失。然而，目前还没有关于花椒上根结线虫种类及发生情况的研究报道。
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson)和厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporium)是两种优秀的生物杀线虫剂的菌种，在防止线虫方面具有低毒、无污染等优点。
线虫生防真菌制剂在土壤中普遍受到土壤抑真菌作用的影响，生防菌的萌发率较低，很难在土壤中建立为控制线虫生长所需要的种群密度，导致淡紫拟青霉或厚垣轮枝菌在防治根结线虫上存在防效低且防效不稳定，难以在生产中大规模应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的生防制剂在防治根结线虫所存在的防效低及防效不够稳定等问题，提供一种防效高且防效稳定的防治根结线虫的复合微生物菌剂。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种防治根结线虫的复合微生物菌剂，包括以下组分：淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson)发酵液，厚垣轮枝菌(Verticilliumchlamydosporium)发酵液。
本发明通过大量的实验发现，将淡紫拟青霉和厚垣轮枝菌组合在一起得到的复合微生物菌剂，相比于单独的淡紫拟青霉菌剂或厚垣轮枝菌菌剂，复合微生物菌剂对于根结线虫的防治呈现出显著的协同增效作用。本发明通过进一步的实验发现，将淡紫拟青霉发酵液和厚垣轮枝菌发酵液按照不同的孢子浓度组合得到的不同的复合微生物菌剂，它们之间对于根结线虫的防效也存在较为显著的差异；其中，按孢子数计，当每毫升(或每克)菌剂中含有1.0×107-1.0×109个的淡紫拟青霉孢子以及1.0×107-1.0×108个的厚垣轮枝菌孢子，相比于其它孢子浓度的组合，该复合微生物菌剂对于根结线虫的防效有了进一步的显著改善；更进一步的实验发现，每毫升(或每克菌剂)产品中含有1.0×108个的淡紫拟青霉孢子和5.0×107个的厚垣轮枝菌孢子时，该复合微生物菌剂不仅防效最高且防效也更加稳定。
本发明所用到的淡紫拟青霉菌种或厚垣轮枝菌菌种均可通过商业途径购买得到；本领域技术人员可按照本领域的常规方法，例如，采用三级培养方法，分别制备得到淡紫拟青霉菌发酵液或厚垣轮枝菌发酵液，将两种发酵液混合在一起后，按生防菌剂的常规制备方法制备成液体生防制剂(原菌剂)或固体生防菌剂；例如，可向混合后的发酵液中加入辅料(蟹壳粉、几丁质)、吸附载体(硅藻土、高岭土、木屑、活性碳或草炭、农作物秸秆、干燥的农家肥等)等，制备得到相应的微生物固体制剂，可以是颗粒制剂、可湿性粉剂或拌种剂等。
施用方法：作为参考，对于液体生防制剂，可以将液体原菌剂用清水稀释10-100倍后与花椒育苗混合基质施用，可在花椒移栽时或对发病花椒进行穴施或灌根。
田间防治根结线虫试验结果表明，将淡紫拟青霉和厚垣轮枝菌复配在一起后，二者呈现出显著的协同增效的生防功效，相比于单独的淡紫拟青霉或厚垣轮枝菌，复合微生物菌剂对于花椒根结线虫的防效有非常显著的改善，并且从总体效果来看，复合微生物菌剂对于花椒根结线虫的防效也更加稳定。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
淡紫拟青霉(Paecilomyces.lilacinus(Thom)Samson)菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌种商业购买编号为：cfcc 86080。
厚垣轮枝菌(Verticillium.chlamydosporium)菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌种商业购买编号为：cfcc 81926。
预备实施例1厚垣轮枝菌发酵液的制备
1、将厚垣轮枝菌菌种活化后，进行摇瓶种子培养；
摇瓶种子培养培养基的组成(按重量百分比计)：
葡萄糖3-5％
黄豆粉1.5-2.5％
磷酸氢二钾0.05-0.1％
硫酸镁0.05-0.1％
水92.3％-95.4％
液体发酵条件：500ml三角瓶中装入种子培养基200ml，高压灭菌后接种孢子悬浮液，接种量为1.5-3％，置于24-28℃摇床150-200r/min培养36-72h。
2、二级液体扩大培养(按重量百分比计)：
葡萄糖2-3％
黄豆粉1-2％
玉米粉1-2％
磷酸氢二钾0.1-0.2％
硫酸镁0.1-0.2％
水92.6％-95.8％
将上述液体培养基高压灭菌后备用；
液体发酵条件：发酵温度24-28℃，罐压0.5-0.7bar，通气量3.2-3.8vvm，转速300-350rpm，开始pH 5.5-6.0。
3、液体发酵培养：
液体发酵培养基的组成(按重量百分比计)：
高粱浸汁10-20％
硝酸钾1-2％
磷酸二氢钾0.2-5％
硫酸镁0.2-0.3％
三氯化镁0.01-0.03％
蔗糖5-7％
水 65-84％
将上述液体培养基高压灭菌后备用；
液体发酵条件：发酵温度为从开始到第48小时为28-30℃，48到第96小时为28-30℃，第96小时到第7天为16-22℃。
预备实施例2淡紫拟青霉(P.lilacinus)发酵液的制备
1、将淡紫拟青霉菌种活化后，进行摇瓶种子培养；
摇瓶种子培养培养基的组成(按重量百分比计)：
葡萄糖1.5-2％
硝酸钠0.4-0.6％
硫酸铵0.2-0.3％
黄豆粉0.2-0.3％
磷酸氢二钾0.1-0.2％
硫酸镁0.1-0.2％
水 96.4％-97.5％
液体发酵条件：500ml三角瓶中装入种子培养基200ml，高压灭菌后接种孢子悬浮液，接种量为1.5-3％，置于24-28℃摇床150-200r/min培养18-36h。
2、二级液体扩大培养(按重量百分比计)：
葡萄糖3-5％
硝酸钠0.4-0.6％
硫酸铵0.2-0.3％
黄豆粉0.2-0.3％
磷酸氢二钾0.1-0.2％
硫酸镁0.1-0.2％
水 93.4％-96％
将上述液体培养基高压灭菌后备用；
液体发酵条件：发酵温度24-28℃，罐压0.5-0.7bar，通气量3.2-3.8vvm，转速300-350rpm，开始pH 5.5-6.0。
3、液体发酵培养：
液体发酵培养基的组成(按重量百分比计)：
高粱浸汁10-20％
硝酸钾1-2％
磷酸二氢钾0.2-5％
硫酸镁0.2-0.3％
三氯化镁0.01-0.03％
蔗糖 5-7％
水 65-84％
将上述液体培养基高压灭菌后备用；
液体发酵条件：发酵温度为从开始到第48小时为28-30℃，48到第96小时为28-30℃，第96小时到第7天为16-22℃。
实施例1复合微生物菌剂的制备(供试菌剂1)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为5.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个/ml。
实施例2复合微生物菌剂的制备(供试菌剂2)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例3复合微生物菌剂的制备(供试菌剂3)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例4复合微生物菌剂的制备(供试菌剂4)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例5复合微生物菌剂的制备(供试菌剂5)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例6复合微生物菌剂的制备(供试菌剂6)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个/ml。
实施例7复合微生物菌剂的制备(供试菌剂7)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个/ml。
实施例8复合微生物菌剂的制备(供试菌剂8)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例9复合微生物菌剂的制备(供试菌剂9)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个/ml。
实施例10复合微生物菌剂的制备(供试菌剂10)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例11复合微生物菌剂的制备(供试菌剂11)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1011个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例12复合微生物菌剂的制备(供试菌剂12)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例13复合微生物菌剂的制备(供试菌剂13)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例14复合微生物菌剂的制备(供试菌剂14)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例15复合微生物菌剂的制备(供试菌剂15)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例16复合微生物菌剂的制备(供试菌剂16)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例17复合微生物菌剂的制备(供试菌剂17)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例18复合微生物菌剂的制备(供试菌剂18)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×106个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例19复合微生物菌剂的制备(供试菌剂19)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例20复合微生物菌剂的制备(供试菌剂20)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×106个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例21复合微生物菌剂的制备(供试菌剂21)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×109个/ml。
实施例22复合微生物菌剂的制备(供试菌剂22)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×106个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例23复合微生物菌剂的制备(供试菌剂23)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×106个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1011个/ml。
实施例24复合微生物菌剂的制备(供试菌剂24)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例25复合微生物菌剂的制备(供试菌剂25)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个/ml。
实施例26复合微生物菌剂的制备(供试菌剂26)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×104个/ml。
实施例27复合微生物菌剂的制备(供试菌剂27)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1010个/ml。
实施例28复合微生物菌剂的制备(供试菌剂28)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1011个/ml。
实施例29复合微生物菌剂的制备(供试菌剂29)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×105个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1012个/ml。
实施例30复合微生物菌剂的制备(供试菌剂30)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例31复合微生物菌剂的制备(供试菌剂31)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例32复合微生物菌剂的制备(供试菌剂32)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例33复合微生物菌剂的制备(供试菌剂33)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例34复合微生物菌剂的制备(供试菌剂34)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1011个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×105个/ml。
实施例35复合微生物菌剂的制备(供试菌剂35)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×107个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例36复合微生物菌剂的制备(供试菌剂36)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例37复合微生物菌剂的制备(供试菌剂37)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107个/ml。
实施例38复合微生物菌剂的制备(供试菌剂38)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例39复合微生物菌剂的制备(供试菌剂39)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1011个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×106个/ml。
实施例40复合微生物菌剂的制备(供试菌剂40)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为0.55×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.55×108个/ml。
实施例41复合微生物菌剂的制备(供试菌剂41)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1012个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1012个/ml。
实施例42复合微生物菌剂的制备(供试菌剂42)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为0.505×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.505×109个/ml。
实施例43复合微生物菌剂的制备(供试菌剂43)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为0.55×1010个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.55×1010个/ml。
实施例44复合微生物菌剂的制备(供试菌剂44)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为0.55×108个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.55×108个/ml。
实施例45复合微生物菌剂的制备(供试菌剂45)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×104个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×104个/ml。
实施例46复合微生物菌剂的制备(供试菌剂46)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为0.515×109个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为0.515×109个/ml。
实施例47复合微生物菌剂的制备(供试菌剂47)
将预备实施例1所制备的厚垣轮枝菌发酵液与预备实施例2所制备的淡紫拟青霉发酵液混合在一起，得到混合菌剂；其中，混合菌剂中两种菌剂的孢子浓度分别控制为：厚垣轮枝菌孢子个数为1.0×1011个/ml，淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×1011个/ml。
试验例1本发明复合微生物菌剂防治花椒根结线虫的田间试验
1.1根结线虫的分离和收集
2007年至2008年间，在四川省茂县叠溪镇花椒种植区采集花椒土样，使用随机采样法，采集长有根结的根及其周围的病土，病土采至土壤表层5-30cm处，每个地块随机采5个点，混匀后放入同一个采集袋内，做好标记。将采集的标样带回实验室，在温室以单卵块接种于易感病番茄上。
雌虫的分离和收集：单卵块繁殖60d后，取被侵染的番茄根，在体视显微镜下将根结表皮用镊子或针尖轻轻拨开，剖面上乳白色的光滑球状物即为根结线虫的雌虫，用解剖针轻轻拨出，放入水中待用。
二龄幼虫的分离和收集：单卵块繁殖60d后，采集被侵染的番茄根清水洗净，剪成3cm小段，装入500ml三角瓶中，配制1％(v/v)次氯酸钠溶液，在上述三角瓶中倒入200-300ml次氯酸钠溶液，封口后猛摇3min，立即用蒸馏水冲洗数次，先后过200目和500目筛，用蒸馏水反复冲洗留在500目筛子上的卵，最后用无菌水冲洗收集于无菌的小烧杯。将上述的卵放于26℃无菌培养箱中孵化3d，得到根结线虫的二龄幼虫。
1.2小区试验
1.2.1供试菌剂
试验菌剂：实施例1-47所制备的复合微生物菌剂，按次序分别编号为供试菌剂1-47；
对照菌剂：
对照菌剂1：厚垣轮枝菌发酵液，孢子浓度为1.5×108个/ml；
对照菌剂2：厚垣轮枝菌发酵液，孢子浓度为2.0×107个/ml；
对照菌剂3：厚垣轮枝菌发酵液，孢子浓度为1.01×109个/ml；
对照菌剂4：厚垣轮枝菌发酵液，孢子浓度为1.1×109个/ml；
对照菌剂5：厚垣轮枝菌发酵液，孢子浓度为1.1×108个/ml；
对照菌剂6：厚垣轮枝菌发酵液，孢子浓度为2.0×108个/ml；
对照菌剂7：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.5×108个/ml；
对照菌剂8：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为2.0×107个/ml；
对照菌剂9：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.01×109个/ml；
对照菌剂10：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.1×109个/ml；
对照菌剂11：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为1.1×108个/ml；
对照菌剂12：淡紫拟青霉发酵液，孢子浓度为2.0×108个/ml；
1.2.2试验作物
四川省茂县叠溪镇花椒种植区种植的花椒树。
1.2.3试验设计
实验地点设在线虫虫量大且均匀的四川省茂县叠溪镇花椒种植区种植，药前调查根结线虫二龄幼虫虫口在每100g土壤20-30头。
实验分为64组，其中47组为试验组，12组为对照组，1组为清水对照组，具体实验设计如下：
试验1-47组分别采用供试菌剂1-47；
对照1-12组分别采用对照菌剂1-12进行处理。
清水对照：采用清水进行处理(不施加任何防治线虫的药剂)；
每个处理30个重复(分三列，每列10株花椒树)，各处理随机排列。
4月中旬至5月初进行菌剂小区试验，在花椒树四周扒开根表面10cm厚、半径为50cm的土层，将1毫升的原菌剂(供试菌剂1-39以及对照菌剂的用量均相同，均为1毫升原菌剂/株)用水稀释后采用喷雾方式将稀释后的菌剂均匀喷洒在挖好的坑中，使菌剂分布在根围，再使扒开土壤复位。施药90d后调查花椒树根结指数(病情指数)和土壤中二龄幼虫数，评价防治效果。
清水对照组用清水代理稀释的菌剂，不作防线虫处理。
根结指数(病情指数)计算方法：挖出每处理花椒根，按照根结线虫分级调查指标进行调查，根结严重度分0-10级，分级标准参照Benjamin等(Benjamin D，Grover C B J.Comparison of compatible and incompatibleresponse of potato to Meloidogyne incognita.Journal of Nematology，1987，19：218-221)。根结指数计算公式如下：
幼虫减少百分率(相对减退率)计算方法：每小区用取土钻(2cm×H20cm)从作物根围(0-20cm深)采集5个点的土样，充分混匀后，取100g用离心漂浮分离法(Karssen G.The Plant Parasitic Nematode GenusMeloidogyne Goldi，(Tylenchida)in Europe[M].Gent：Drukkeru Modern，1982：5-24.)分离土样中的二龄幼虫，热杀死后用4％福尔马林固定，在倒置显微镜下计数，计算100g土样内根结线虫二龄幼虫数及幼虫减少百分率(相对减退率)。计算公式如下：
相对防治效果计算公式如下：
2试验结果
表1复合微生物菌剂对花椒根结线虫的防治效果
从表1的试验数据可见，相比于12个对照组，47个试验组对于花椒根结线虫的防效呈显著提升，这表明将淡紫拟青霉和厚垣轮枝菌复配在一起对于花椒根结线虫呈现出协同增效的生防功效。其中，在47个试验组中，试验1-7组对于花椒根结线虫的生物防治功效又明显优于其它40个组的生物防治效果，这表明当每毫升(或每克)复合菌剂产品中含有1.0×107-1.0×109个的淡紫拟青霉孢子以及1.0×107-1.0×108个的厚垣轮枝菌孢子，所得到的复合微生物菌剂产品对于根结线虫的防效更为显著，防效也更加稳定，尤其是当每毫升(或每克菌剂)产品中含有1.0×108个的淡紫拟青霉孢子和5.0×107个的厚垣轮枝菌孢子时，该复合微生物菌剂不仅防效最高且防效最稳定。
Claims (9)
1.一种防治根结线虫的复合微生物菌剂，其特征在于，包括以下组分：淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson)发酵液，厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporium)发酵液。
2.按照权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：每毫升菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×107-1.0×109个，厚垣轮枝菌的孢子个数为1.0×107-1.0×108个。
3.按照权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：每毫升菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0×108个，厚垣轮枝菌的孢子个数为5.0×107个。
4.按照权利要求1-3任何一项所述的复合微生物菌剂，其特征在于：还含有吸附载体或辅料。
5.按照权利要求4所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述的吸附载体包括硅藻土、高岭土、木屑、活性碳、草炭、农作物秸秆或干燥的农家肥；所述的辅料包括蟹壳粉或几丁质。
6.按照权利要求1-3任何一项所述的复合微生物菌剂，其特征在于：将其制备成液体生防制剂或固体生防制剂。
7.按照权利要求6所述的复合微生物菌剂，其特征在于，其特征在于：所述的固体生防制剂包括颗粒制剂、可湿性粉剂或拌种剂。
8.权利要求1-3任何一项所述的复合微生物菌剂在防治根结线虫中的应用。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的根结线虫是花椒根结线虫。
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