CN1951197B

CN1951197B - 一种采用根瘤菌防治大豆根部病害的新方法

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Publication number: CN1951197B
Application number: CN2006101378003A
Authority: CN
Inventors: 段玉玺; 王媛媛; 陈立杰
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2006-11-01
Filing date: 2006-11-01
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2026-11-01
Also published as: CN1951197A

Abstract

本发明中采用的方法是利用大豆根瘤和根内生细菌防治以大豆胞囊线虫和大豆根腐病菌为主要病原微生物的大豆根部病害，属于微生物农药技术领域。本发明中具体涉及的细菌菌株已于2006年10月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号如下：中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)菌株L396保藏号为CGMCC No.1851；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Snb2保藏号为CGMCC No.1850；通过常规液体发酵培养制备，以其本身或其代谢物作为有效活性成分，将发酵原液按照不同配比浓度混合，对大豆胞囊线虫和大豆根部病原真菌的具有明显的抑制作用，Snb2和L396发酵液浓度配比为8∶3时，使二龄幼虫的死亡率达到98.92％，对胞囊孵化的相对抑制率达到99.66％，且防效稳定持久，将8∶3比例混合的代谢物制备为水剂，田间对大豆胞囊线虫的防效达到78.6％。同时根瘤菌具有固氮促生的作用，使该制剂具有固氮防病的协同功能，用于防治大豆根部病害，具有良好的开发应用前景。

Description

一种采用根瘤菌防治大豆根部病害的新方法

技术领域：

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及到用两种内生细菌协同作用控制植物寄生线虫和病原真菌引起的根部病害的方法和应用。

背景技术：

大豆胞囊线虫病(soybean cyst nematode，SCN)，又称大豆黄萎病、火龙秧子，长期以来是制约大豆生产的重要病害。该病害一般使大豆减产10％～30％，严重地块可达70％～90％，甚至造成绝产，比任何一种单一病害所造成的危害都大。此病害在我国东北三省、内蒙古和黄淮海大豆主产区严重发生，是一种极难防治的土传病害。从世界范围来看，SCN的为害和蔓延有日益加重的趋势。

大豆根腐病是一种世界性病害，分布范围广，在世界各大豆产区均有发生，我国主要分布在东北和黄淮海大豆主要产区。大豆根腐病造成严重的产量损失，仅在黑龙江垦区发病率达到75％-90％，减产10％-20％左右。而且大豆根腐病的病原菌种类包括以镰刀菌为主的多种病原菌，这个特点使这种病害的防治显得尤为困难。

大豆根部的这两种主要病害都是是典型的土传病害，土壤条件的复杂性使得各种防治措施均有其局限性，不能很有效的控制该病的发生。目前在我国的各大豆主产区的大豆生产不仅不能重茬，迎茬的大豆根病更重。

大豆根病的生物防治越来越受到人们的重视。利用内生细菌防治植物病害已成为国内外在生物防治研究中的一个热点。植物内生细菌存在于植物体内，具有其他微生物不可比拟的优点，如占据有利的生态位、能经受住植物的防御反应、与病原微生物直接作用及促生作用等。大量研究表明，内生细菌在生长发育和代谢过程中产生多种具有拮抗性、竞争性的次级代谢产物或酶类物质，通过直接或间接作用，抑制或杀死病原菌。同时由于内生细菌与植物之间建立了一种和谐的关系，接种后易于在植物体上定殖，生防效果比较稳定。同时由于是两种细菌共同活体接种大豆根系，在土壤中和根系内能够定殖、繁殖，长期缓慢释放防治效力，克服化学药剂短效期的问题。同时根瘤菌作为生物菌肥，可以大量固定土壤和空气中的氮素，为作物的生长发育提供必须的营养物质，减少氮肥的施用量，为农业的可持续发展奠定基础。

本研究正是基于上述情况和理论，以大豆胞囊线虫和大豆镰刀根腐病菌为靶标，从大豆根瘤和根内筛选能够控制两种病原微生物的细菌菌株，旨在建立控制大豆根部病害的新方法，为研究开发控制大豆根部病害的新型生物药剂奠定基础。

发明内容：

本发明的主要是采用组织分离法从大豆根瘤和根系内分离大量内生细菌，以大豆胞囊线虫和大豆镰刀根腐病菌为靶标，筛选对两种病原微生物有拮抗作用的根瘤菌和芽孢杆菌。

本发明中所涉及的细菌菌株分别是枯草芽孢杆菌Snb2(Bacillus subtilis)和L396中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)根瘤菌，它们对大豆胞囊线虫胞囊的孵化和二龄幼虫均具有不同程度的抑制和毒性作用，同时对大豆根部病原真菌的拮抗作用也较为明显。鉴于此，将这两株细菌Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)进行了更为深入的研究。

本发明还涉及用于防治大豆胞囊线虫和大豆根腐病菌的一种新方法，方法中利用的是在本发明中提到的细菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)复配而形成的。

本发明的细菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)是通过试管种培养后，再经扩大发酵培养来制备获得。

其具体方法如下：

1.两株细菌的分离均采用组织分离法从大豆根瘤和根内分离获得。根瘤和根系消毒、清洗后，分别用YMA和NA培养基培养其内生细菌。

2.试管种培养：

培养基配方为牛肉膏蛋白胨(NA)培养基，即牛肉膏5g；蛋白胨5g；琼脂17g；水1000mL，pH7.0-7.2。

3.液体发酵培养：两株细菌的液体发酵液分别采用以下配方

L396的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有甘露醇0.5％-1.0％，酵母浸出汁0.02％-0.06％，K₂HPO₄ 0.02％-0.07％，MgSO₄.7H₂O 0.007％-0.03％，Nacl 0.01％-0.03％，pH 7.0-7.2。

Snb2使用的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有蔗糖1.5％-2％、K₂HPO₄ 0.05％-0.15％、MgSO₄·7H₂O 0.1％-0.5％、KCl 0.03％-4.5％、FeCl₃ 0.002-0.04％，CaCO₃ 0.1％-0.6％，pH为7.2。

将两株菌株的试管种分别接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵240h。

本发明还涉及一种杀大豆胞囊线虫制剂，其包含有效量的本发明所述的枯草芽孢杆菌Snb2(Bacillus subtilis)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)根瘤菌L396本身或其代谢物作为有效活性成分。

本发明的枯草芽孢杆菌Snb2(Bacillus subtilis)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)根瘤菌L396或其代谢物具有杀线虫及抗菌活性物质，可用于植物寄生线虫和作物根部病害的生物防治，特别是大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)和大豆根腐病的防治。

具体实施方式：

为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。

实施例1

根瘤菌的分离纯化

保存的根瘤在95％酒精中浸泡15min，再置于0.1％HgCl₂中处理3～5min，具体时间视根瘤大小的不同有变化，用无菌水清洗3次，取0.2ml最后一次无菌水冲洗液涂布接种于分离培养基上，观察有无菌落产生，以此方法验证消毒方法是否能全部杀死供试样品表面微生物。用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀在无菌滤纸上切开，放在YMA培养基上，2-3天后，从根瘤周围取少量菌体在培养基上接种，28℃培养48h，取单个菌落在YMA培养基上划线培养，直至得到纯培养，挑取单菌落编号，用15％的甘油-牛肉蛋白胨培养液于4℃冰箱中保存。

实施例2

大豆根瘤内生芽孢杆菌的分离

取大豆根瘤5g，无菌纱布包裹，浸入0.1％的Hgcl₂中表面消毒10min，再用无菌水冲洗3-5次。验证消毒是否彻底方法同上。供试材料转入无菌研钵中研磨成匀浆，加入5ml无菌水搅匀。将1mL组织匀浆液置于80℃条件下水浴20min后，取0.2ml与NA分离培养基混和均匀，进行内生细菌的分离。将培养皿倒置于28℃恒温培养中培养1～2d，待平板长出菌落后，挑取菌落形态相异的单个菌落，经2～3次纯化，挑取单菌落编号，用15％的甘油-牛肉蛋白胨培养液于4℃冰箱中保存。

实施例3：细菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的培养

将两株细菌采用划线法接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为NA培养基，28℃培养3d，获得试管种。

再将试管种分别接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵168h-200h。将发酵液按照不同的配比关系复配，测定杀线虫及抗菌药效试验。

实施例4：细菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的培养

基本同实施例3，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

L396的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有甘露醇0.7％，酵母浸出汁0.5％，K₂HPO₄ 0.4％，MgSO₄.7H₂O 0.024％，Nacl 0.3％，pH 7.0。

Snb2使用的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有蔗糖1.6％、K₂HPO₄ 0.12％、MgSO₄·7H₂O 0.36％、KCl 2.7％、FeCl₃ 0.028％，CaCO₃ 0.45％，pH为7.2。

实施例5：细菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的培养

基本同实施例3，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：蔗糖(6％)、硫酸铵(3％)、K₂HPO₄(2％)、MgSO₄·7H₂O(0.5％)、KCl(5.2％)、FeSO₄(0.04％)，pH 6。

实施例6：细菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的培养

基本同实施例3，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：蔗糖(5％)、硫酸铵(7％)、K₂HPO₄(1.5％)、MgSO₄·7H₂O(0.3％)、KCl(4.5％)、FeSO₄(0.01％)，pH 6.8。

实施例5：细菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的杀线虫及抗菌活性：

将两株细菌Snb2和L396的发酵原液以5-9∶2-4的浓度混合，作为生防药剂，分别测定对大豆胞囊线虫和大豆根腐病菌的作用效果。

实施例6：

基本同实施例5，不同之处在于两株细菌发酵液使用配比，其浓度配比为：

将细菌Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的发酵原液以5∶2、5∶4、7∶2；7∶3和8∶3的浓度混合，测定对大豆胞囊线虫的毒杀作用和对大豆根腐病菌的拮抗效果。

实施例7：

以不同浓度比例混合的两细菌菌株代谢物制备为水剂、粉剂或胶悬剂，可以采用拌种、种子包衣、灌根和土壤处理等各种方法施用到田间，以便更好的发挥防病控病的作用。

1供试材料

1.1大豆胞囊线虫胞囊3号生理小种的获得：分离自沈阳农业大学线虫学研究室试验田土样。采用改良的淘洗过筛法从土壤中收集大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)，将土壤放入适量水中，搅拌均匀，静置2-3min后，上层悬液过筛(40目和60目)，重复三次。弃去上层40目筛上的残余物，收集60目网筛上的剩余物于烧杯中。用漏斗过滤烧杯中的液体，过滤的杂质和胞囊一并转移到表面皿里，在解剖镜下用挑针挑出新鲜饱满的胞囊，4℃冰箱中保存备用。

1.2大豆胞囊线虫二龄幼虫(J2)的准备：将大豆胞囊线虫3号生理小种的胞囊在0.5％NaC10中消毒5min，无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿里，在25℃的恒温箱中培养，5d后收集孵化出的J2。

1.3大豆根腐病病原菌：以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为主要代表，包括茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、腐霉菌(Pythium sp.)，均由本研究室分离、保存。

2试验方法：

2.1细菌Snb2和L396的代谢物混合物对线虫的作用：用移液枪吸取按照一定配比关系的细菌发酵液1mL菌悬液加入到已灭菌的小皿中，再加入约含40条大豆胞囊线虫二龄幼虫悬液0.1mL，置于28℃恒温箱中，以无菌水作为对照，分别在48h、96h观察线虫的死亡情况(以身体僵直，触而不动者为死虫态)，记算线虫的死亡率，。每个处理设置3次重复。

2.2细菌Snb2和L396的代谢物混合物对对胞囊孵化的影响：取新鲜、成熟度一致的胞囊，用1.2描述的消毒方法消毒后，放入由夹无菌滤纸的双层套管制成的孵化池中。孵化池放在无菌的培养皿中，培养皿内盛以7∶3浓度混合的细菌代谢物混合物，无菌水处理为对照，，28℃下孵化每个处理设置3次重复。7d后镜检计算孵化出的二龄幼虫数量。

2.3细菌Snb2和L396的代谢物混合物对大豆根腐病病原菌的拮抗活性测定

采用对峙培养方法。先将供试的4种病原菌先活化7d，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘处制成菌碟，将菌碟转移至PDA平板中央，在距菌碟25mm、靠近平板边缘均匀放置牛津杯，内盛以7∶3浓度混合的细菌代谢物，放置在25℃恒温箱中培养7d。为观察病原菌生长的变化、病菌菌落的半径、抑菌圈直径。

2.4细菌Snb2和L396的代谢物制剂对大豆胞囊线虫病防效

按Snb2和L396代谢物以8∶3比例混合的发酵液制备成水剂，大豆种子用该水剂包衣后播种在大豆胞囊线虫严重发生的地块，以空白为对照，大豆出苗后常规管理，不施用任何肥料和其它农药，在30～35天期间，每天监测对照中白色雌虫发育情况，到达最适宜时期，将苗从营养钵中扣出，检测根系胞囊数量。

3试验结果

3.1细菌Snb2和L396的混合发酵液对大豆胞囊线虫2龄幼虫的毒杀效果(见表1)

结果表明，两株细菌的各配比发酵液和无菌水对照之间差异显著，8∶3、7∶2、7∶3对线虫的相对致死率都达到了85％以上，其中8∶3、7∶2之间差异不显著。

3.2细菌Snb2和L396的混合发酵液对大豆胞囊线虫胞囊孵化的影响(见表2)

结果表明，两株细菌的各配比发酵液和无菌水对照处理的卵囊之间，对线虫孵化影响差异显著，特别是配比为8∶3和7∶2的混合发酵液几乎不能使胞囊孵化，其相对抑制率都达到95％以上。

表1 细菌Snb2和L396的混合发酵液对大豆胞囊线虫2龄幼虫的影响

表2 细菌Snb2和L396的混合发酵液对大豆胞囊线虫胞囊孵化的影响

3.3细菌Snb2和L396的混合发酵液对大豆根腐病病原菌的拮抗活性测定(见表3)

通过对峙培养法测定对根部病原菌的拮抗作用表明，两株细菌的各配比发酵液和对照之间差异显著，8∶3、7∶2、7∶3对抑菌圈半径均在10mm以上，三者之间差异不显著。

表3 细菌Snb2和L396的混合发酵液对尖孢镰刀菌的抑菌效果

3.4细菌Snb2和L396的代谢物制剂对大豆胞囊线虫病防效

通过用代谢物制剂对大豆种子进行包衣处理后发现，该制剂对大豆种子萌发率影响不大，出苗比较整齐。与对照相比较，处理的大豆根部胞囊数量明显减少，对胞囊有明显的抑制作用，对照根部平均胞囊量为63个，最多达89个，而经过混合代谢物包衣处理的大豆根部平均胞囊量为13.5个，防治效果达到78.6％。

两株菌株保藏于中国.北京.中关村，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2006年10月27日，保藏编号CGMCC No.1850(分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis)，CGMCC No.1851(分类命名：中华根瘤菌属Sinorhizobium sp.)。

通过采用不同的方法测定了根瘤菌L396和枯草芽孢杆菌Snb2不同配比浓度的混合代谢物对大豆根部主要病原微生物的致死、拮抗作用，结果显示根瘤菌L396和枯草芽孢杆菌Snb2的代谢物混合液能够明显表现出对大豆根部病原微生物的防治效果，表明两株来自于大豆根系的根瘤菌和芽孢杆菌，能够协同防治大豆根部病害，具有良好的开发应用前景。

Claims

1.一种利用根瘤菌和芽孢杆菌的活菌剂、代谢物混合物或代谢物混合物的制剂来控制大豆根部病原物所引起的大豆根病的方法，该方法采用两株具有拮抗大豆根部病原真菌和杀线虫活性的细菌菌株，其特征在于，根瘤菌和芽孢杆菌分别为中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)菌株L396和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Snb2，其特征为具有拮抗大豆根部病原真菌和杀线虫活性，来自大豆根瘤中，这两株细菌已于2006年10月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号如下：中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)菌株L396保藏号为CGMCC No.1851；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Snb2保藏号为CGMCC No.1850。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的大豆根病是指由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、腐霉菌(Pythium sp.)和大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)所引起的病害。

3.两种用于防治大豆胞囊线虫和大豆根腐病的细菌菌体本身及其两株细菌代谢物的组合，其特征在于，是由权利要求1所述的两株细菌经过常规的液体发酵制备的，液体发酵培养基配方分别为：

L396的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有甘露醇0.5％-1.0％，酵母浸出汁0.02％-0.06％，K₂HPO₄ 0.02％-0.07％，MgSO₄·7H₂O 0.007％-0.03％，NaCl 0.01％-0.03％，pH 7.0-7.2

Snb2使用的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有蔗糖1.5％-2％、K₂HPO₄0.05％-0.15％、MgSO₄·7H₂O 0.1％-0.5％、KCl 0.03％-4.5％、FeCl₃ 0.002-0.04％，CaCO₃0.1％-0.6％，pH为7.2。

4.一种杀线虫、抗真菌制剂，其特征在于，包含有效量的权利要求1所述的细菌或权利要求3所述的细菌代谢物作为活性成分。

5.一种杀线虫、抗真菌的制剂，其特征在于，包含权利要求3所述的细菌液体代谢物以不同配比关系混合的发酵液。

6.权利要求1所述的细菌或权利要求3所述的细菌代谢物或权利要求4或权利要求5所述的杀线虫、抗真菌制剂在植物寄生线虫和病原真菌生物防治中的应用。