CN105316268A - 一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用 - Google Patents
一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105316268A CN105316268A CN201510902825.7A CN201510902825A CN105316268A CN 105316268 A CN105316268 A CN 105316268A CN 201510902825 A CN201510902825 A CN 201510902825A CN 105316268 A CN105316268 A CN 105316268A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus pumilus
- gibberellins
- oil
- hormones regulators
- plant hormones
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一株产赤霉素的短小芽孢杆菌，所述菌株命名为短小芽孢杆菌(Bacillus？pumilus)Yc2-1，该菌株已于2015年9月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC？NO.11428。本发明还公开了所述菌株在降解石油中的应用或在利用以原油为主要营养物的发酵培养基发酵生产赤霉素类植物生长调节剂中的应用，有望为综合修复和改良石油污染土壤、促进植物的生长和调节开辟了一条途径，具有较大的商业价值和良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株短小芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用或在利用以原油为主要营养物的发酵培养基发酵生产赤霉素类植物生长调节剂中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
随着经济和社会的高速发展，石油及其制品在国民经济的各个领域中被广泛地应用，并且使用量与日俱增。但是，在原油的开发、存储、运输和加工环节中，越来越多的石油烃类污染物进入到土壤，造成了严重的环境和生态问题(2002年，Rahman等)。石油烃类污染物可阻塞土壤空隙，降低土壤透水和透气性能，破坏土壤物理结构；改变土壤中有机质的比例(例如碳氮比和碳磷比)，导致土壤中有效氮、磷的含量减少；引起土壤微生物群落结构和区系的改变，破坏土壤微生态环境；影响植物的生长，甚至导致植物的死亡；同时，被污染植物中的有害物质能够通过食物链危害到人类的健康。因此，石油污染土壤的治理和修复是目前环境保护领域中的研究热点。
污染物的生物处理法是指利用特定的微生物、植物或动物吸收、转化、消除被污染环境中的污染物，从而对被污染环境进行修复的一种生物处理过程(2002年，RonandRosenberg)。其中，微生物是污染降解的主要完成者，已有大量报道从自然环境中分离、筛选、纯化出具有降解石油烃类和多环芳烃类化合物能力的微生物菌株。例如分离自油田采出水的食鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriummultivorum)经过诱变处理后可以有效降解石油烃类化合物(2015年，杜茂林等)；分离自胜利油田油井附近土壤中的Pseudomonassp.DH-5、Citrobactersp.DH-8以及Klebsiellasp.DH-9可以降解石油中的烷烃类和芳香烃类化合物，其降解率均在40％以上(2013年，姚瑶等)。除了微生物，植物在修复石油污染土壤的应用中也取得了一定的研究进展。植物除了可以直接吸收与转化有机污染物之外，还能够向外界释放分泌物与酶，为根际微生物生长提供基质，同时刺激根际微生物的活性与转化功能(2012年，杨斌等)。目前，通过植物-土壤-微生物的联合作用实现土壤石油污染的治理是最具应用前景的方法，与传统的物理法和化学法相比，该方法在成本和应用效果方面具备无可比拟的优势(2011年，滕应等；2011年，MukherjeeandBordoloi)。同时，土壤中还存在着大量的益生微生物，能够产生各种植物生长调节剂促进植物生长。赤霉素作为一类天然的植物生长调节剂，具有多种生物功能和活性，可以调节植物生根、发芽和结果等多个过程。该类化合物不仅可在植物中分离得到(1995年，Palavan-)，也可以由微生物发酵产生(1988年，Martinez-Toledo等；1989年，Bottini等)。分离同时具备降解石油和产生赤霉素类化合物能力的微生物菌株，并将其应用于含油土壤的生物处理过程，可以显著强化微生物-植物联合修复系统，实现高效的石油污染物降解和全面的土壤修复。但目前此工作报道不多，有关短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用或在利用以原油为主要营养物的发酵培养基发酵生产赤霉素类植物生长调节剂中的应用未见报道。
参考文献
1.RahmanK.S.M.,Thahira-RahmanJ.,LakshmanaperumalsamyP.,etal.J.Bioresourcetechnology,2002,85(3):257-261.
2.RonE.Z.,andRosenbergE.J.Curr.Opin.Biotechnol,2002,249:252
3.杜茂林,付瑞敏,谷亚楠,等.J.微生物学通报,2015,42(6):1001-1009.
4.姚瑶,刘兆普,郑青松,等.J.南京农业大学学报,2013,36(1):65-71.
5.杨斌,侯新村,范希峰,等.J.环境工程,2012(S2):406-411.
6.滕应,李秀芬,潘澄,等.J.2011,23(3):43-46.
7.MukherjeeA.K.,andBordoloiN.K.J.EnvironmentalScienceandPollutionResearch,2011,18(3):471-478.
8.Palavan-N.,J.Bulg.J.PlantPhysiol,1995,21(2-3):3-14.
9.Martinez-ToledoM.V.,DeLaRubiaT.,MorenoJ.,etal.J.Plantandsoil,1988,110(1):149-152.
10.BottiniR,FulchieriM,PearceD,etal.J.PlantPhysiology,1989,90(1):45-47.
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用或在利用以原油为主要营养物的发酵培养基发酵生产赤霉素类植物生长调节剂中的应用。
本发明所述产赤霉素的短小芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1，该菌株已于2015年9月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCCNO.11428。
上述产赤霉素的短小芽孢杆菌，其生物学特征是：细胞呈现短杆状(见图1)，单个，细胞大小为(0.6μm～0.8μm)×(2.5μm～3.0μm)；在生孢培养基上培养24小时后形成短杆状内生芽孢(见图2)；固体培养时菌落初期呈圆形，随着培养时间的延长逐渐呈不规则状，菌落扁平，边缘呈放射状；可在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上生长并产生降解圈(见图3)。生理生化特征是：革兰氏染色阳性，兼性厌氧，化能异养菌，最适生长温度为30～37℃，最适合生长pH值为6.5～7.5。生理生化实验结果详见表1，与短小芽孢杆菌模式菌株相比完全一致。
表1：Yc2-1菌株(CGMCCNO.11428)与短小芽孢杆菌标准菌株的生理生化特征比较
注：“+”表示菌株阳性；“-”表示菌株阴性。
*：东秀珠蔡妙英等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001，第一版。
上述用于菌体形态观察的液体培养基组成：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，pH7.0。
上述用于菌体形态观察的固体培养基组成：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉15g，NaCl10g，pH7.0。
上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
上述生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。
对本发明所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1CGMCCNO.11428测定16SrRNA的基因序列的结果显示，其基因序列长度为1410bp，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
通过使用美国生物工程信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)BLASTN程序比对，发现本发明的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1菌株16SrRNA的基因序列与NCBI注册的多株短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)16SrRNA的基因序列具有高度同源性(>97％)，个别菌株的相似性甚至更高，可以确定Yc2-1菌株是一株短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。选取同源性比较高的典型B.pumilus的16SrRNA基因序列作为参比对象；采用邻近法(Neighbour-Joining)运用Mega5软件构建Yc2-1菌株与参比菌株之间的系统进化树，选用Pseudomonasaeruginosa作为外群分支，结果见图4。
本发明所述产赤霉素的短小芽孢杆菌Yc2-1菌种的选育方法是：
将采集到的石油污染的土壤样品用无菌生理盐水溶解，振荡混匀制成土壤悬液，梯度稀释后涂布到以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基平板上，37℃条件下静置培养，至有明显的石油降解圈出现，挑取石油降解圈较大的菌落，划线转接到固体培养基上，37℃条件下静置培养，至有明显的单菌落产生，经两次纯化后，得到短小芽孢杆菌菌种，编号Yc2-1，甘油冻藏保菌。该菌株已于2015年9月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCCNO.11428。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述产赤霉素的短小芽孢杆菌在发酵生产赤霉素类植物生长调节剂中的应用。
本发明所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1菌株可以发酵产生赤霉素类植物生长调节剂，具体应用及测定方法是：
(1)菌种选择：选用本发明所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1CGMCCNO.11428；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，30～40℃条件下，静置培养20～30小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于40～50mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，30～40℃培养18～28小时，得种子液；
(4)以1～5％的体积比的接种量，将该种子液接入50mL液体发酵培养基(250mL三角瓶)，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，30～40℃培养2～3天，获得含有赤霉素类植物生长调节剂的发酵液。
上述斜面培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉15g，NaCl10g，pH7.0。
上述液体种子培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，pH7.0。
上述液体发酵培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨8g，酵母膏2g，牛肉膏1g，D-甘露醇6～8g，玉米浆1～3g，NaCl10g，pH7.0。
上述方法中，步骤(2)、(3)所述培养温度优选35℃。
上述方法中，步骤(4)所述培养温度优选37℃。
上述方法中，步骤(2)、(3)所述培养时间优选24小时。
上述方法中，步骤(4)所述接种量优选体积比1％。
上述方法中，步骤(4)所述液体发酵培养基中D-甘露醇含量优选7g/L，玉米浆含量优选2g/L。
上述方法中，步骤(4)所述培养转速优选为200转/分钟。
上述方法中，步骤(4)所述培养时间优选2.5天。
过滤去除发酵液中的菌体，并用乙酸乙酯萃取，萃取液用旋转蒸发仪浓缩至干，再用甲醇溶解，采用HPLC检测赤霉素产生。色谱柱为Asahipak9μmES-502N(7.5mm×100mm)；流动相A为乙酸，流动相B为水，流动相C为甲醇；流速1.5ml/min；进样量10μL；柱温25℃。采用等度洗脱的方法，流动相A；B：C为0.1％：0.5％：99.5％。使用紫外检测器，检测波长设定为210nm。标准品用甲醇溶解后，经HPLC二次纯化，收集并浓缩制成100ug/ml的溶液。相关赤霉素类化合物峰的指认，除了与标准品滞留时间进行比对外，还使用HPLC串联质谱进行确证。在多反应检测模式下，采用ESI源负离子模式，采集相关化合物的质谱图并与标准品的谱图进行比对。实验结果显示：发酵液中可检测到赤霉素类植物生长调节剂，其基本成分与发酵产量为：赤霉素GA3(51.2±3.7mg/L)，赤霉素GA4(6.9±1.3mg/L)和赤霉素GA7(8.7±2.9mg/L)。
本发明所述产赤霉素的短小芽孢杆菌在降解石油中的应用。
其中：所述产赤霉素的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1在营养培养基(配方是：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，pH7.0)上能实现细胞的快速繁殖和扩增，在含石油无机盐培养基上能实现对石油的降解。
上述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1菌株降解石油污染能力测定的方法是：
(1)菌种选择：选用本发明所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1CGMCCNO.11428；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，30～40℃条件下，静置培养20～30小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，30～40℃培养18～28小时，得种子液；
(4)石油分解率检测：以1～5％的体积比的接种量，将该种子液接入含有石油的50mL无机盐培养基中(250mL三角瓶)，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，30～40℃培养6～8天，实现对培养基中石油的降解。
上述斜面培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉15g，NaCl10g，pH7.0。
上述液体种子培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，pH7.0。
上述含石油无机盐培养基组成为：NaNO31.5g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，KCl0.5g/L，FeSO40.01g/L，CaCl20.002g/L，石油2～5g/L，pH7.0，去离子水配制。
上述的方法中，步骤(2)、(3)、(4)所述培养温度优选35℃。
上述的方法中，步骤(2)、(3)所述培养时间优选24小时。
上述的方法中，步骤(4)所述接种量优选体积比2％。
上述的方法中，步骤(4)所述培养转速优选为200转/分钟。
上述的方法中，步骤(4)所述含油无机盐培养基中石油的浓度优选3.5g/L。
上述的方法中，步骤(4)所述培养时间优选7天。
取发酵后的培养基，用四氯化碳进行萃取，去除水分保留有机相，以四氯化碳作参比溶液，采用红外分光光度计于2930cm-1、2960cm-1、3030cm-1处测量其吸光度值。将不接入CGMCCNO.11428菌株的培养基在相同条件下进行处理，作为空白对照，按照中华人民共和国国家环境保护标准(HJ637-2012水质石油类和动植物油类的测定红外分光光度法)中列出的公式计算样品中总石油烃的含量。
结果显示，在上述优选培养条件下，接入CGMCCNO.11428菌株后，培养基中总石油烃的含量从最初的175mg下降至102±11mg，石油的去除率在41.7％左右。
本发明所述产赤霉素的短小芽孢杆菌在利用以原油为主要营养物的发酵培养基发酵生产赤霉素类植物生长调节剂中的应用。
本发明的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1菌株可以利用原油为主要营养物发酵产生赤霉素类植物生长调节剂，具体应用及测定方法是：
(1)菌种选择：选用本发明所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1CGMCCNO.11428；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，30～40℃条件下，静置培养20～30小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于40～50mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，30～40℃培养18～28小时，得种子液；
(4)以1～5％的体积比的接种量，将该种子液接入含有原油的50mL液体发酵培养基(即为以原油为主要营养物的发酵培养基，250mL三角瓶)，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，30～40℃培养6～9天，获得含赤霉素类植物生长调节剂的发酵液。
上述斜面培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉15g，NaCl10g，pH7.0。
上述液体种子培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，pH7.0。
上述含原油液体发酵培养基(即以原油为主要营养物的发酵培养基)组成为：NaNO31.5g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，KCl0.5g/L，FeSO40.01g/L，CaCl20.002g/L，胰蛋白胨0.5g/L，原油1.5～3.5g/L，溶剂为去离子水，并调节pH至7.0。
上述方法中，步骤(2)、(3)、(4)所述培养温度优选35℃。
上述方法中，步骤(2)、(3)所述培养时间优选24小时。
上述方法中，步骤(4)所述接种量优选体积比2％。
上述方法中，步骤(4)所述培养转速优选为200转/分钟。
上述方法中，步骤(4)所述含原油液体发酵培养基原石油的浓度优选2.0g/L。
上述方法中，步骤(4)所述培养时间优选7天。
过滤去除发酵液中的菌体，并用乙酸乙酯萃取，萃取液用旋转蒸发仪浓缩至干，再用甲醇溶解，采用HPLC检测赤霉素产生。色谱柱为Asahipak9μmES-502N(7.5mm×100mm)；流动相A为乙酸，流动相B为水，流动相C为甲醇；流速1.5ml/min；进样量10μL；柱温25℃。采用等度洗脱的方法，流动相A；B：C为0.1％：0.5％：99.5％。使用紫外检测器，检测波长设定为210nm。
在上述优选培养条件下，接入CGMCCNO.11428菌株后，发酵液中可检测到赤霉素类化合物(见图5)，其基本成分与发酵产量为：赤霉素GA3(1.3±0.7mg/L)，赤霉素GA4(1.9±0.3mg/L)和赤霉素GA7(1.6±0.5mg/L)。结果表明，本发明所述的短小芽孢杆菌CGMCCNO.11428菌株可以利用原油为主要营养物发酵产生赤霉素类植物生长调节剂。
上述实验证实：本发明公开的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1菌株(CGMCCNO.11428)具备较好的石油降解能力，并且能够利用原油为主要营养物发酵产生赤霉素类植物生长调节剂，有望为促进植物的生长和调节，或在石油污染土壤的修复和改良中具有较大的商业价值和良好的应用前景。
综上，本发明所具有的有益效果是：
(1)本发明的优点在于所述短小芽孢杆菌Yc2-1菌株(CGMCCNO.11428)在以原油为唯一碳源的无机盐发酵培养基中可以正常生长并高效降解石油或原油，原油的去除率在41.7％左右。
(2)本发明所述短小芽孢杆菌Yc2-1菌株(CGMCCNO.11428)在特定的液体发酵培养基中可大量产生赤霉素类植物生长调节剂，在促进植物的生长和调节中具有良好的应用前景。
(3)本发明所述短小芽孢杆菌Yc2-1菌株(CGMCCNO.11428)可以利用原油为主要营养物发酵产生赤霉素类植物生长调节剂，为综合修复和改良石油污染土壤、促进植物的生长和调节开辟了一条途径。
附图说明
本发明提供的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1，该菌株已于2015年9月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCCNO.11428。
图1为短小芽孢杆菌Yc2-1菌株在显微镜下的细胞形态。
图2为短小芽孢杆菌Yc2-1菌株内生芽孢在显微镜下的形态。
图3为短小芽孢杆菌Yc2-1菌株在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上菌落形态。
图4为短小芽孢杆菌Yc2-1菌株进化树分析。
图5为短小芽孢杆菌Yc2-1菌株在以原油为主要营养物液体发酵液中赤霉素类化合物的检测色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一株短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1菌株(CGMCCNO.11428)，下面对本发明内容做详细说明，但所述内容是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：可降解石油菌株的筛选
取1g采集到的石油污染的土壤样品，放入250ml三角瓶中，向其中加入9ml无菌生理盐水，振荡混匀制成土壤悬液，按10倍的浓度梯度进行倍比稀释。分别取100μl稀释度为10-3、10-4、10-5和10-6的土壤悬液，滴加到以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上，用涂布棒均匀涂抹均匀，在37℃条件下静置培养9天。
待有明显的石油降解圈出现，用接种环挑取石油降解圈较大的菌落，在固体营养培养基上进行划线，在37℃条件下静置培养，至有明显的单菌落产生。转接划线两次。
用接种环挑取单菌落，转接到装有8ml液体培养基的试管中，在37℃、200转/分钟条件下振荡培养过夜。向冻藏管中分别加入200μl甘油和800μl的菌液，混合均匀后放置-80℃超低温冰箱中保存，菌株编号为Yc2-1。同时该菌株已于2015年9月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCCNO.11428。
上述无菌生理盐水组成为：0.85％NaCl溶液。
上述以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基组成为：NaNO31.5g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，KCl0.5g/L，FeSO40.01g/L，CaCl20.002g/L，琼脂粉15g/L，原油3g/L，pH7.0，蒸馏水配置。
上述固体营养培养基组成为：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉15g，NaCl10g，pH7.0。
实施例2：Yc2-1菌株的形态观察及生理生化特征鉴定
采用尼康倒置显微镜的油镜对Yc2-1菌株的形态进行观察。菌株生理生化特征鉴定方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》(科学出版社，2001，第一版)，鉴定试验培养温度均设为37℃。同时还观察分析了Yc2-1菌株在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上的生长情况。
上述产赤霉素的短小芽孢杆菌Yc2-1菌株的生物学特征是：细胞呈现短杆状(见图1)，单个，细胞大小为(0.6μm～0.8μm)×(2.5μm～3.0μm)；在生孢培养基上培养24小时后形成短杆状内生芽孢(见图2)；固体培养时菌落初期呈圆形，随着培养时间的延长逐渐呈不规则状，菌落扁平，边缘呈放射状；可在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上生长并产生降解圈(见图3)。生理生化特征是：革兰氏染色阳性，兼性厌氧，化能异养菌，最适生长温度为30～37℃，最适合生长pH值为6.5～7.5。生理生化实验结果详见表1，与短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)标准菌株相比生理生化特征完全一致。
实施例3：Yc2-1菌株的16SrRNA基因鉴定
根据TIANGEN细菌基因组提取试剂盒(TianGen公司，货号DP302-02)的操作说明，提取分离纯化的Yc2-1菌株的总基因组DNA。提取的总基因组DNA采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，取3.0μl总基因组DNA样品与0.6μl6×上样缓冲液充分混合均匀后注入点样孔中，分子量标记选用λ-HindIIIDNAMarker，电泳电压120V，电泳时间35分钟。选用上游引物27F(5’-3’：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和下游引物1492R(5’-3’：GGTTACCTTGTTACGACTT)扩增分离菌株的16SrRNA基因，PCR反应体系和条件如下表所示：
PCR产物采用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，取3.0μlPCR产物与0.6μl6×LoadingBuffer充分混合均匀后注入点样孔中，Marker选用DL2000DNAMarker，电泳电压120V，电泳时间30分钟。根据TIANGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒(TianGen公司，货号DP209-02)的操作说明，对PCR产物进行纯化回收，回收后的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳方法同上。纯化回收后的PCR产物送往测序公司进行测序。结果显示，其基因序列长度为1410bp，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
将测序所得的16SrRNA基因序列递交到美国生物工程信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)BLASTN程序比对，发现本发明的Yc2-1菌株16SrRNA的基因序列与NCBI注册的多株短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)16SrRNA的基因序列具有高度同源性(>97％)，个别菌株的相似性甚至更高，可以确定Yc2-1菌株是一株短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。
选取同源性比较高的典型B.pumilus的16SrRNA基因序列作为参比对象；采用邻近法(Neighbour-Joining)运用Mega5软件构建Yc2-1菌株与参比菌株之间的系统进化树，选用Pseudomonasaeruginosa作为外群分支(见图4)。
实施例4：Yc2-1菌株在生物降解石油污染中的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用本发明所述短小芽孢杆菌Yc2-1；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基(每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉15g，NaCl10g，pH7.0)，35℃条件下，静置培养24小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于50mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中(每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，pH7.0。)，置旋转转速为200转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35℃培养24小时，得种子液；
(4)石油分解率检测：以2％体积比的接种量，将该种子液接入含有取自胜利油田的含油废水中(50mL)，在35℃、200转/分钟条件下摇床培养7天。
(5)将培养基转移至分液漏斗中，加入10ml四氯化碳振荡3min，期间经常开启旋塞排气。静置分层后，将下层有机相转移至事先已加入3g无水硫酸钠的锥形瓶中，摇动数次除去残留的水分。如果无水硫酸钠结晶成块，需要补加无水硫酸钠，静置。用四氯化碳作参比溶液，采用红外分光光度计于2930cm-1、2960cm-1、3030cm-1处测量其吸光度值。将不接入Yc2-1菌株的废水在相同条件下进行处理，作为对照。按照中华人民共和国国家环境保护标准(HJ637-2012水质石油类和动植物油类的测定红外分光光度法)中列出的公式计算样品中总石油烃的含量。
结果显示，接入Yc2-1菌株后，废水中总石油烃的含量从最初的7.65g/L下降至5.02g/L，石油的去除率接近34.4％。
实施例5：Yc2-1菌株发酵产生赤霉素类植物生长调节剂的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用本发明所述短小芽孢杆菌Yc2-1；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基(每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉15g，NaCl10g，pH7.0)，35℃条件下，静置培养24小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于50mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中(每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，pH7.0)，置旋转转速为200转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35℃培养24小时，得种子液；
(4)以1％的体积比的接种量，将该种子液接入250mL三角瓶中的50mL液体发酵培养基(每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨8g，酵母膏2g，牛肉膏1g，D-甘露醇7g，玉米浆2g，NaCl10g，pH7.0。)中，置旋转转速为200转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养2天。
(5)过滤去除发酵液中的菌体，并用乙酸乙酯萃取，萃取液用旋转蒸发仪浓缩至干，再用甲醇溶解，采用HPLC检测赤霉素产生。色谱柱为Asahipak9μmES-502N(7.5mm×100mm)；流动相A为乙酸，流动相B为水，流动相C为甲醇；流速1.5ml/min；进样量10μL；柱温25℃。采用等度洗脱的方法，流动相A；B：C为0.1％：0.5％：99.5％。使用紫外检测器，检测波长设定为210nm。
结果显示，接入Yc2-1菌株后，培养基中可检测到赤霉素类植物生长调节剂，其基本成分与发酵产量为：赤霉素GA3(53.5mg/L)，赤霉素GA4(6.3mg/L)和赤霉素GA7(9.1mg/L)。
实施例6：Yc2-1菌株利用原油为主要营养物发酵产生赤霉素类植物生长调节剂的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用本发明所述短小芽孢杆菌Yc2-1；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基(每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉15g，NaCl10g，pH7.0)，35℃条件下，静置培养24小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于50mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中(每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，pH7.0)，置旋转转速为200转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35℃培养24小时，得种子液；
(4)2％体积比的接种量，将该种子液接入含有取自胜利油田的含原油废水中(50mL，石油烃含量7.65g/L，添加胰蛋白胨0.5g/L)，在35℃、200转/分钟条件下摇床培养7天。
(5)过滤去除发酵液中的菌体，并用乙酸乙酯萃取，萃取液用旋转蒸发仪浓缩至干，再用甲醇溶解，采用HPLC检测赤霉素产生。色谱柱为Asahipak9μmES-502N(7.5mm×100mm)；流动相A为乙酸，流动相B为水，流动相C为甲醇；流速1.5ml/min；进样量10μL；柱温25℃。采用等度洗脱的方法，流动相A；B：C为0.1％：0.5％：99.5％。使用紫外检测器，检测波长设定为210nm。
结果显示，接入Yc2-1菌株后，含原油废水中可检测到赤霉素类植物生长调节剂，其基本成分与发酵产量为：赤霉素GA3(1.5mg/L)，赤霉素GA4(1.7mg/L)和赤霉素GA7(1.3mg/L)。
序列表
<110>山东宝源生物有限公司
<120>一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用
<141>2015-12-2
<160>1
<170>PatentInVersion3.5
<210>1
<211>1410
<212>DNA
<213>短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）
<221>短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）Yc2-1CGMCCNO.1142816SrDNA
<222>（1）…（1410）
<400>1
tccataaaggttacctcaccgacttcgggtgttgcaaactctcgtggtgtgacgggcggt60
gtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattc120
cagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttatgggattc180
gctaaaccttgcggtctcgcagccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccag240
gtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcag300
tcaccttagagtgcccaactaaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgg360
gacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctg420
tccccgaagggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggtt480
cttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattc540
ctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgca600
gcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactacca660
gggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccaga720
gagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtgga780
attccactctcctcttctgcactcaagtttcccagtttccaatgaccctccccggttgag840
ccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattc900
cggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctt960
tctggttaggtaccgtcaaggtgcgagcagttactctcgcacttgttcttccctaacaac1020
agagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgt1080
ccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtccc1140
agtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccattaccc1200
caccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcat1260
ccttgaaccatgcggttcaaggaactatccggtattagctccggtttcccggagttatcc1320
cagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatccgggagc1380
aagctcccttctgtccgctcgactgcatgt1410
Claims (10)
1.一株产赤霉素的短小芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Yc2-1，该菌株已于2015年9月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCCNO.11428。
2.权利要求1所述产赤霉素的短小芽孢杆菌在发酵生产赤霉素类植物生长调节剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产赤霉素的短小芽孢杆菌利用液体发酵培养基在培养温度为36～37℃，摇床培养转速为200±5转/分钟的条件下发酵生产赤霉素类植物生长调节剂，其中所述液体发酵培养基的配方是：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨8g，酵母膏2g，牛肉膏1g，D-甘露醇6～8g，玉米浆1～3g，NaCl10g，pH7.0。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述液体发酵培养基中D-甘露醇含量为7g/L，玉米浆含量为2g/L。
5.权利要求1所述产赤霉素的短小芽孢杆菌在降解石油中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述产赤霉素的短小芽孢杆菌在营养培养基上能实现细胞的快速繁殖和扩增，在含石油无机盐培养基上能实现对石油的降解；其中所述产赤霉素的短小芽孢杆菌的培养温度为35±1℃，摇床培养转速为200±5rpm；所述营养培养基的配方是：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，pH7.0；所述含石油无机盐培养基的配方是：NaNO31.5g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，KCl0.5g/L，FeSO40.01g/L，CaCl20.002g/L，石油2～5g/L，溶剂为去离子水，并调节pH至7.0。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述含石油无机盐培养基的配方中石油的浓度为3.5g/L。
8.权利要求1所述产赤霉素的短小芽孢杆菌在利用以原油为主要营养物的发酵培养基发酵生产赤霉素类植物生长调节剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述产赤霉素的短小芽孢杆菌利用以原油为主要营养物的发酵培养基在培养温度为35±1℃，摇床培养转速为200±5rpm的条件下发酵生产赤霉素类植物生长调节剂，其中所述以原油为主要营养物的发酵培养基的配方是：NaNO31.5g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，KCl0.5g/L，FeSO40.01g/L，CaCl20.002g/L，胰蛋白胨0.5g/L，原油1.5～3.5g/L，溶剂为去离子水，并调节pH至7.0。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述以原油为主要营养物的发酵培养基的配方中原油的浓度为2.0g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510902825.7A CN105316268B (zh) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | 一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510902825.7A CN105316268B (zh) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | 一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105316268A true CN105316268A (zh) | 2016-02-10 |
| CN105316268B CN105316268B (zh) | 2018-11-13 |
Family
ID=55244591
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510902825.7A Active CN105316268B (zh) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | 一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105316268B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106754485A (zh) * | 2016-11-29 | 2017-05-31 | 山东大学 | 一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其应用 |
| CN106957809A (zh) * | 2017-05-15 | 2017-07-18 | 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 | 土壤有机污染的生物协同修复方法 |
| CN109536401A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-03-29 | 齐齐哈尔大学 | 一种复合微生物菌肥及其制备方法以及在促进水稻生长中的应用 |
| CN109652339A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-04-19 | 南京工业大学 | 一株原油降解菌株及其应用 |
| CN114703110A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-07-05 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基及方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102757920A (zh) * | 2012-07-27 | 2012-10-31 | 长安大学 | 一种短小芽孢杆菌及其应用 |
| CN103205378A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-07-17 | 天津科技大学 | 一种降解石油的耐油耐盐菌株及其筛选方法和应用 |
| CN103667120A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-26 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一株短小芽孢杆菌、该菌株的获取方法及该菌株在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用 |
| CN104877930A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-09-02 | 南开大学 | 一种耐盐碱石油烃降解菌的分离筛选方法 |
-
2015
- 2015-12-08 CN CN201510902825.7A patent/CN105316268B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102757920A (zh) * | 2012-07-27 | 2012-10-31 | 长安大学 | 一种短小芽孢杆菌及其应用 |
| CN103205378A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-07-17 | 天津科技大学 | 一种降解石油的耐油耐盐菌株及其筛选方法和应用 |
| CN103667120A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-26 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一株短小芽孢杆菌、该菌株的获取方法及该菌株在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用 |
| CN104877930A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-09-02 | 南开大学 | 一种耐盐碱石油烃降解菌的分离筛选方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 孔高飞: "一种短小芽孢杆菌分离鉴定及培养条件研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
| 朱忠彬: "短短芽孢杆菌DZQ3对烟草的促生及系统抗性诱导作用", 《中国烟草科学》 * |
| 黄学等: "短短芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌降解原油烃机制研究", 《石油学报》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106754485A (zh) * | 2016-11-29 | 2017-05-31 | 山东大学 | 一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其应用 |
| CN106754485B (zh) * | 2016-11-29 | 2020-08-04 | 山东大学 | 一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其应用 |
| CN106957809A (zh) * | 2017-05-15 | 2017-07-18 | 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 | 土壤有机污染的生物协同修复方法 |
| CN106957809B (zh) * | 2017-05-15 | 2020-05-22 | 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 | 土壤有机污染的生物协同修复方法 |
| CN109536401A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-03-29 | 齐齐哈尔大学 | 一种复合微生物菌肥及其制备方法以及在促进水稻生长中的应用 |
| CN109652339A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-04-19 | 南京工业大学 | 一株原油降解菌株及其应用 |
| CN114703110A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-07-05 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基及方法 |
| CN114703110B (zh) * | 2022-05-10 | 2024-01-26 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基及方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105316268B (zh) | 2018-11-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105316268A (zh) | 一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用 | |
| CN104031870A (zh) | 一种微生物复合菌剂及由其制备的土壤联合修复剂及二者的应用 | |
| CN102277312A (zh) | 一株低温降解多环芳烃菌株及其在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用 | |
| CN114107092B (zh) | 一株降解邻苯二甲酸酯的植物内生菌戈登氏菌l191及其应用 | |
| US20240093142A1 (en) | Strain for degrading deoxynivalenol and use thereof | |
| CN111154673A (zh) | 一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用 | |
| CN100475950C (zh) | 一株巨大芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114854626B (zh) | 一种降解多环芳烃类污染物的假单胞菌菌株及其应用 | |
| CN111117909B (zh) | 一种耐多重重金属促植物生长的菌株及其应用 | |
| CN105316269A (zh) | 一株耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌及其在降解石油中的应用 | |
| CN110734877A (zh) | 一株多环芳烃高效降解菌及其应用 | |
| CN101531974A (zh) | 一株高效降解原油的北极细菌菌株及其应用 | |
| CN104046580B (zh) | 用于降解多环芳烃类有机污染物的鞘氨醇杆菌菌株及其应用 | |
| CN108034613B (zh) | 一株2，4-二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株Sphingomonas sp.X4及其应用 | |
| CN114214235B (zh) | 一种高效絮凝菌及其在污水处理中的应用 | |
| CN102864086B (zh) | 一株降解多环芳烃的菌株及其在土壤修复中的应用 | |
| CN100439491C (zh) | 一株球形芽孢杆菌及其应用 | |
| CN103834599A (zh) | 一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途和使用方法 | |
| CN114891668B (zh) | 一种降解多环芳烃类污染物的粘质沙雷氏菌菌株及其应用 | |
| CN114134079B (zh) | 一株四环素类抗生素降解菌、方法及应用 | |
| CN103849589A (zh) | 一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途和使用方法 | |
| CN103820372A (zh) | 一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途和使用方法 | |
| CN116836897B (zh) | 一株鞘氨醇单胞菌和一种修复菌剂及其制备方法与应用 | |
| CN104099266B (zh) | 用于降解多环芳烃类有机污染物的无色杆菌菌株及其应用 | |
| CN102911898B (zh) | 一株降解高分子多环芳烃的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 264006 8 Chengdu Avenue, Yantai economic and Technological Development Zone, Shandong Applicant after: SHANDONG BAOYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 264006 8 Chengdu Avenue, Yantai economic and Technological Development Zone, Shandong Applicant before: Baoyuan Bio-Agri (Shandong) Ltd. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |