CN110819611A

CN110819611A - 壳聚糖酶突变体及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110819611A
Application number: CN202010024623.8A
Authority: CN
Inventors: 关菲菲; 田�健; 伍宁丰; 刘晓青; 初晓宇; 韩焱硕
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2040-01-10
Also published as: CN110819611B

Abstract

本发明公开了壳聚糖酶突变体及其编码基因和应用。针对壳聚糖酶CHIS1754存在催化效率和热稳定性不高，将其应用于壳寡糖的酶法生产会导致生产效率不高的问题，为了提高壳聚糖酶CHIS1754的催化效率和热稳定性，本发明将壳聚糖酶CHIS1754进了多位点突变得到壳聚糖酶突变体，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。试验证实，通过多位点突变得到的壳聚糖酶突变体的催化效率和热稳定性有显著提高。本发明进一步将所述的壳聚糖酶突变体应用于壳寡糖的酶法生产。

Description

壳聚糖酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及壳聚糖酶突变体，进一步涉及该壳聚糖酶突变体在酶法生产壳寡糖中的应用，属于壳聚糖酶突变体及其应用领域。

背景技术

壳聚糖是一种具有独特功能特性的天然阳离子聚合物，是由自然界中广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到的，主要由Ｄ-氨基葡萄糖通过β-１，４-糖苷键连接而成。大量研究表明壳聚糖在食品、化工、医药及农业等领域都有广泛的应用前景。其中，壳聚糖最为重要的用途是生产壳寡糖。壳寡糖又名壳聚寡糖或几丁寡糖，作为壳聚糖的下一级产物，具有壳聚糖无法比拟的特性，它具有较高的溶解度和较低的分子量，更容易被生物体吸收，近年来的研究发现，低分子量壳寡糖（如五糖、六糖）还具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特性。

壳聚糖酶水解产生的壳寡糖分子量更易控制且条件温和，壳聚糖酶水解获得的壳寡糖分子量一般低于１０ｋＤａ，且更易溶于水，优于天然的壳寡糖。壳寡糖比壳聚糖有更好的生物功能，例如在生物医学领域对人体的免疫调节、抗肿瘤、降血脂、调节血糖、改善肝脏和心肺功能等。此外，壳寡糖在食品行业还具有重要的应用价值，有助于改善肠道，从而促进人体吸收营养物质；可用于生产调味品，代替市场上一些如苯甲酸钠等化学添加剂；可用于生产饮料，具有减肥、美容养颜、调节免疫功能等作用，可用于蔬菜、水果的保鲜，且具有抗菌防腐的功效。

制备壳寡糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法等。化学降解法产生的衍生物较多，低聚糖得率低且环境污染严重；物理降解法生产成本较高，难以实现工业化；酶法因条件温和、选择性高，对环境污染小，产物安全性好，受到了越来越多的重视与关注。如今，酶法水解壳聚糖制备壳寡糖已成为甲壳素领域的一个研究热点。

壳聚糖酶(chitosanase)是一种能分解壳聚糖的专一性酶，它是由Monaghan于1973年在研究细菌和真菌过程中首先提出来的，并于1992年在国际酶学命名会议上被系统命名。壳聚糖酶不同于几丁质酶，它能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖，生成壳寡糖（Monaghan R L, Eveleigh D E, Tewari F P, et al. Chitosanase, a novel enzyme[J]. Nature New Biol, 1973, 245(142):78-80.）。壳聚糖酶在细菌、真菌和病毒等类群的微生物中均有存在，但大多数微生物产壳聚糖酶存在活性较低，催化效率和热稳定性等问题，从而影响壳寡糖的酶法生产的生产效率。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种催化效率和热稳定性得到显著改善的壳聚糖酶突变体；

本发明的目的之二是将所述的壳聚糖酶突变体应用于壳寡糖的酶法生产；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先在海洋基因组数据库中使用隐马尔可夫模型（Pfam ID：PF01374）筛选了2376个壳聚糖酶基因，对这些壳聚糖酶基因进行序列比对，并基于K-means算法构建序列相似矩阵，K-Means的最佳聚类数为五个聚类，这是通过Elbow方法计算得出的，相似的基质被聚为五个簇，每个簇分别包含828、971、387、115、75个壳聚糖酶基因。本发明由此选择每个簇中的中心基因（chis794，chis1754，chis3501，chis9258和chis9857）作为目标壳聚糖酶基因，对五个壳聚糖酶基因进行了优化，合成，克隆到表达载体pET28a（+）中并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。表达结果发现，只有CHIS794，CHIS 1754和CHIS9258在大肠杆菌表达菌株中表达良好，而其它两种酶蛋白（CHIS3501和CHIS9857）则作为不溶性包涵体表达；此外，CHIS794和CHIS9258对水解壳聚糖没有任何活性。因此，本发明在接下来的试验中主要关注CHIS1754并研究该酶蛋白的功能。

chis1754基因（GenBank登录号：MK629639）大小为837 bp，其核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示，其翻译的壳聚糖酶蛋白的理论大小为30.2 KDa，CHIS1754属于Gly_hydro_46家族，具有该家族保守的底物结合位点和催化残基。

为了进一步研究CHIS1754的功能，首先将chis1754连接到pET28a载体中，转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行异源表达和纯化。SDS-PAGE分析显示，CHIS1754蛋白约为30.2 KD，与理论大小一致。接下来，检测了CHIS1754对具有不同脱乙酰度（DA75，DA80，DA92； DA，脱乙酰度）的壳聚糖的水解活性；水解活性结果表明，随底物脱乙酰化程度的增加，酶活性增加，在实验室摇瓶水平中，CHIS1754对脱乙酰度为92%的壳聚糖的最大水解活性可达209U / mL。随后，测定了CHIS1754在55°C和pH 5.5下，与脱乙酰度为92％的壳聚糖反应的动力学参数。实验结果表明，CHIS1754的K_m，k_cat和V_max值分别为5.28 mg mL^-1、41.06min^-1和90.33μM min^-1 mg^-1，效率常数k_cat / K_m值为7.78 mL mg-1 min^-1。

为了进一步研究CHIS1754的功能，检测了CHIS1754在pH 5.5下水解壳聚糖（DA92）的最适温度和温度稳定性。结果表明，在30-55°C范围内，CHIS1754的活性随温度的升高而逐渐增加，在55°C时达到最大值，然后在温度超过60°C时迅速降低，在70°C时活性完全丧失。此外，将CHIS1754在60°C下孵育20分钟后，酶活性迅速降低至原始酶活的40％，此后缓慢降低，当CHIS1754在60°C下孵育60分钟时，酶活降低至原始活性的30％。当检测最适pH值时，CHIS1754在酸性条件下表现出较高的活性，即从pH 4.0开始，其活性随pH值的升高而逐渐增加，并在pH 5.5时达到最大值，随后该酶的活性急剧下降。当pH达到7.0时，活性接近于0。CHIS1754在酸性条件下活性较好，而大多数微生物来源的壳聚糖酶的最佳pH值在4到8之间。在pH稳定性方面，CHIS1754在酸性条件下具有更好的性能。将CHIS1754分别在0℃，pH=4.0-6.0范围内维持1h，经检测，其酶活随着pH增加而缓慢增加，当pH=6.0时达到最高（是原始酶活的70％至90％）。当pH大于6.0时，酶活缓慢降低。当pH为8.0时，酶的活性仍可达到原始酶的50％。

综合上述试验结果，本发明发现壳聚糖酶 CHIS1754存在催化效率和热稳定性不高等问题，将其应用于壳寡糖的酶法生产会导致生产效率不高。

为了提高壳聚糖酶 CHIS1754的催化效率和热稳定性，本发明基于CHIS1754序列进化信息设计了CHIS1754的多点突变体（CHIS1754T）：使用软件BLAST在NCBI非冗余数据库中搜索蛋白质CHIS1754，收集了1577种壳聚糖酶，并使用多序列比对软件MUSCLE进行比对，计算了CHIS1754每个位置的特异性氨基酸的可能性（PSAP）。该位点突变的最大概率至少为0.2，且高于该位置的野生型的残基被选为突变氨基酸，最后，组装了15个突变体作为突变体（CHIS1754T），该突变体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示。将chis1754t在大肠杆菌BL21（ED3）中异源表达，在获得单一的高纯度酶蛋白后，检测了其催化效率和热稳定性。根据检测结果可见，CHIS1754T的K_m，k_cat和V_max值为2.74 mg mL^-1、102.00 min^-1和244.90 μM min^-1mg^-1，与CHIS1754相比，突变体的K_m值降低，表明酶分子与底物的亲和力增加。突变体的k_cat/ K _m值是野生型的4.8倍，因此，本发明通过多点突变策略得到的壳聚糖酶突变体CHIS1754T的催化效率有显著提高。

通过差式扫描量热仪（DSC）的试验结果发现，通过多点突变策略得到的壳聚糖酶突变体CHIS1754T的T_m值增加了7.63℃。此外，与CHIS1754相比，壳聚糖酶突变体CHIS1754T的反应最适温度提高了约5°C。在60°C保温条件下，随着时间的增长，CHIS1754和CHIS1754T的相对酶活性逐渐下降，但CHIS1754T的下降更为缓慢，特别是在持续时间为20min时，CHIS1754T的残余酶活约为CHIS1754的四倍，显示CHIS1754T的热稳定性大大提高。

本发明进一步提供了一种制备所述壳聚糖酶突变体CHIS1754T的方法，包括：将所述壳聚糖酶突变体CHIS1754T的编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在原核细胞或真核细胞中表达该编码基因的重组表达载体；将所述的重组表达载体转化到宿主细胞中进行诱导表达，收集并纯化所表达的重组蛋白，即得。

其中，所述重组表达载体可以原核表达载体或真核表达载体，可以由5′端非编码区、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是诱导型启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。

此外，本发明的另外一个目的是将催化效率以及热稳定性显著提高的壳聚糖酶突变体CHIS1754T应用于壳寡糖的酶法生产，包括：以壳聚糖为底物，以壳聚糖酶突变体CHIS1754T为水解酶，将壳聚糖水解为壳寡糖。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992); Rossolini等人, Mol Cell. Probes8:91-98 (1994)）。

术语“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码基因”：转录成RNA的核酸序列。

附图说明

图1来自海洋基因组的壳聚糖酶基因的聚类；A.通过平方和误差（SSE）选择集群编号k。x和y轴表示k和SSE的数量；B.壳聚糖酶的聚类矩阵。每列和每行代表一个壳聚糖酶。颜色反映了由软件针头在EMBOSS中计算出的归一化序列比对得分。

图2壳聚糖酶的筛选；壳聚糖酶的上清液（A）和沉淀（B）的SDS-PAGE图；（C）菌体破碎上清的活性检测。

图3 CHIS1754与其他壳聚糖酶的多序列比对结果；三角形：保守的结合位点；倒置三角形：催化残基。

图4 CHIS1754的表达和纯化及其活性的测定；（A）纯化的CHIS1754的SDS-PAGE图，M：蛋白marker；（B）CHIS1754的活性检测，DA75：脱乙酰度为75％的壳聚糖； DA80：脱乙酰度为80％的壳聚糖； DA92：脱乙酰度为92％的壳聚糖。

图5 CHIS1754的生化特性；CHIS1754的（A）最佳温度，（B）热稳定性，（C）最佳pH和（D）pH稳定性的影响。

图6二价金属离子对CHIS1754的活性的影响。

图7 CHIS1754水解壳聚糖的产物分析；（A）通过TLC分析降解产物；ST1，壳寡糖标准为50 mg / ml；（B）通过LC-QTQF分析降解产物； DP，聚合度，ST2，2 mg / ml壳寡糖标准品;（C）壳聚糖降解途径分析。

图8 CHIS1754的特定位置的氨基酸概率（PSAP）。

图9 CHIS1754T与CHIS1754的多序列比对结果。

图10 CHIS1754T的表达和纯化及其活性的测定；（A）纯化的CHIS1754T的SDS-PAGE图，M：蛋白marker。（B）CHIS1754T的活性检测。

图11 CHIS1754T的生化特性；（A）CHIS1754T的最适温度；（B）CHIS1754T的热稳定性。

图12 CHIS1754T的生化特性；CHIS1754T的（A）反应最佳pH和（B）pH稳定性。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 聚糖酶基因的筛选、酶活性分析和酶学性质检测

1从海洋基因组中筛选壳聚糖酶基因

在海洋基因组数据库中，使用隐马尔可夫模型（Pfam ID：PF01374）筛选了2376个壳聚糖酶基因。对这些壳聚糖酶基因进行序列比对，并基于K-means算法构建序列相似矩阵。如图1A所示，K-Means的最佳聚类数为五个聚类，这是通过Elbow方法计算得出的。因此，相似的基质被聚为五个簇（图1B），每个簇分别包含828、971、387、115、75个壳聚糖酶基因。选择每个簇中的中心基因（chis794，chis1754，chis3501，chis9258和chis9857）作为目标壳聚糖酶基因。对五个壳聚糖酶基因进行了优化，合成，克隆到表达载体pET28a（+）中并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。但是，只有CHIS794，CHIS 1754和CHIS9258在大肠杆菌表达菌株中表达良好，而其他两种酶蛋白（CHIS3501和CHIS9857）则作为不溶性包涵体表达（图2A，B）。此外，CHIS794和CHIS9258对水解壳聚糖没有任何活性（图2C）。因此，在接下来的研究中主要关注CHIS1754，并研究该酶蛋白的功能。

chis1754基因（GenBank登录号：MK629639）大小为837 bp，其翻译的壳聚糖酶蛋白的理论大小为30.2 KDa。CHIS1754属于Gly_hydro_46家族，具有该家族保守的底物结合位点和催化残基（图3）。

2.壳聚糖酶CHIS1754的酶活性测定

为了进一步研究CHIS1754的功能，首先将chis1754连接到pET28a载体中，转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行异源表达和纯化。SDS-PAGE分析显示，CHIS1754蛋白约为30.2 KD，与理论大小一致（图4A）。接下来，检测了CHIS1754对具有不同脱乙酰度（DA75，DA80，DA92； DA，脱乙酰度）的壳聚糖的水解活性。结果表明，随底物脱乙酰化程度的增加，酶活性增加，在实验室摇瓶水平中，CHIS1754对脱乙酰度为92%的壳聚糖的最大水解活性可达209U / mL（图4B）。原因可能是壳聚糖底物的脱乙酰度越高，其溶解度越好，β-1,4糖苷键暴露的越明显，从而导致CHIS1754的效果更好。随后，测定了CHIS1754在55°C和pH 5.5下，与脱乙酰度为92％的壳聚糖反应的动力学参数。

实验结果表明，CHIS1754的K_m，k_cat和V_max值分别为5.28 mg mL^-1、41.06 min^-1和90.33μM min^-1 mg^-1，效率常数k_cat / K_m值为7.78 mL mg^-1 min^-1（表1）。

3. CHIS1754的酶学性质检测

为了进一步研究CHIS1754的功能，检测了CHIS1754在pH 5.5下水解壳聚糖（DA92）的最适温度和温度稳定性。结果表明，在30-55°C范围内，CHIS1754的活性随温度的升高而逐渐增加，在55°C时达到最大值，然后在温度超过60°C时迅速降低，在70°C时活性完全丧失（图5A）。此外，将CHIS1754在60°C下孵育20分钟后，酶活性迅速降低至原始酶活的40％，此后缓慢降低，当CHIS1754在60°C下孵育60分钟时，酶活降低至原始活性的30％（图5B）。

当检测最适pH值时，CHIS1754在酸性条件下表现出较高的活性，即从pH 4.0开始，其活性随pH值的升高而逐渐增加，并在pH5.5时达到最大值，随后该酶的活性急剧下降。当pH达到7.0时，活性接近于0（图5C）。 CHIS1754在酸性条件下活性较好，而大多数微生物来源的壳聚糖酶的最佳pH值在4到8之间。在pH稳定性方面，CHIS1754在酸性条件下具有更好的性能。将CHIS1754分别在0℃，pH=4.0-6.0范围内维持1h，经检测，其酶活随着pH增加而缓慢增加，当pH=6.0时达到最高（是原始酶活的70％至90％）。当pH大于6.0时，酶活缓慢降低。当pH为8.0时，酶的活性仍可达到原始酶的50％（图5D）。

大多数二价金属离子对CHIS1754没有明显影响。但是，Fe²⁺，Zn²⁺和Ca²⁺会抑制CHIS1754的活性。 Fe²⁺的作用最明显，能使CHIS1754的活性几乎降低到原来的40％。在Zn²⁺和Ca²⁺的条件下，活性分别降低至原来的65％和85％（图6）。然而，Liu，G.L.等研究发现Mn²⁺可以增强从假单胞菌属（Pseudomonas sp.）纯化的壳聚糖酶的活性，这表明不同金属离子对不同壳聚糖酶的作用差异很大。

4. CHIS1754的水解机理研究

为了进一步研究CHIS1754水解壳聚糖的机理，采用了薄层色谱（TLC）和液质联用技术（LC-QTQF）。从薄层色谱的结果可以看出，过量的CHIS1754在55℃，pH5.5的条件下，1小时内可以将壳聚糖降解为二糖和三糖（图7A）。较灵敏的LC-QTQF结果表明，CHIS1754降解壳聚糖的主要产物是二糖（Dp2），三糖（Dp3）和四糖（Dp4）（图7B）。综上所述，CHIS1754可以将脱乙酰度为92%的壳聚糖有效降解为寡糖，聚合度分别为2、3和4，其中四糖含量较低，表明CHIS1754是一种典型的内切型壳聚糖酶（图7C）。

试验例2 CHIS1754突变体的构建以及酶学性质检测试验

为了进一步提高CHIS1754的催化效率和热稳定性，基于其序列进化信息设计了CHIS1754的多点突变体（CHIS1754T）。使用软件BLAST在NCBI非冗余数据库中搜索蛋白质CHIS1754，收集了1577种壳聚糖酶，并使用多序列比对软件MUSCLE进行比对。比对的结果如图8所示，计算了CHIS1754每个位置的特异性氨基酸的可能性（PSAP）。该位点突变的最大概率至少为0.2，且高于该位置的野生型的残基被选为突变氨基酸。最后，组装了15个突变体作为突变体（CHIS1754T），该突变体的序列比对如图9所示。同样，将chis1754t在大肠杆菌BL21（ED3）中异源表达，在获得单一的高纯度酶蛋白（图10A）后，检测了其催化效率和热稳定性。 CHIS1754T的K_m，k_cat和V_max值为2.74 mg mL^-1、102.00 min^-1和244.90 μM min^-1 mg^-1（表1）。

表1壳聚糖酶的动力学参数

与CHIS1754相比，突变体的K_m值降低，表明酶分子与底物的亲和力增加。突变体的k_cat/ K _m值是野生型的4.8倍。因此，通过多点突变策略提高了壳聚糖酶的催化效率。蛋白质的热稳定性通过差式扫描量热仪（DSC）确定。结果表明，该突变体的T_m值增加了7.63℃（表1）。此外，与CHIS1754相比，CHIS1754T的反应最适温度提高了约5°C（图11A）。在60°C保温条件下，随着时间的增长，CHIS1754和CHIS1754T的相对酶活性逐渐下降，但CHIS1754T的下降更为缓慢，特别是在持续时间为20min时，CHIS1754T的残余酶活约为CHIS1754的四倍（图11B），显示其热稳定性大大提高。

此外，确定了突变体的反应最佳pH和pH稳定性（图12），与野生型酶相似，因此，这些突变不影响其与pH相关的特性。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 壳聚糖酶突变体及其编码基因和应用

<130> BJ-2002-191007A

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 837

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

atgacgaaga agccgggtac tcgtctcgcc gcggtcgtcc tcggcgccgc ccttgccgcg 60

ggcctgcctc tcggcacggc gagcgccgca cccgagacag tgcacagcgc cacacagcgg 120

gccggggcgg atctcaccga accgcacaag aaagagatcg cgatggaact cgtgtccagc 180

gcggagaatt cctcgctgga ctggaaagca cagtaccggt acatcaagga catcggcgat 240

gggcgtggtt ataccggcgg catcatcggt ttcacctcgg gaaccgggga catgctcgaa 300

ctcgtcgagc agtacacgaa agccaagccg gacaacgttc tcgcgaaata cctggacgca 360

ctgcacaagg tgaacgggag cgattcgcac gatgggctcg atcccgattt caccgcggac 420

tggcacaaag ccgcgaaaga tccggccttc cagaaggcgc agaatgatct ccgcgattca 480

atgtacttcg atcccgcggt ggaccaggcg aaaaaggacg ggctgcgcgc gctcggccag 540

ttcatctact acgacgccat ggtgatgcac gggccgggag acggcgacac cagcttcggc 600

ggcatccggc acaccgcact cgagcacgcc aaaccgtccg cgcagggcgg agacgaacgc 660

gaatacctgg acgcgtttct cgacgcccgc aaggcggcca tgctcaccga agaagcacac 720

tcggacacca gcagggtgga caccgagcag cgcgtgttcc tcgacaaggg caacttcgac 780

ctgaacccgc cactgcactg gaagacctac ggggacagtt acacgatccc cgagtga 837

<210> 2

<211> 834

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

atgaccaaga aaccgggtac ccgtctggcg gcggtggttc tgggtgcggc gctggcggcg 60

ggtctgccgc tgggtaccgc gagcgcggcg ccggaaaccg ttcacagcgc gacccagcgt 120

gcgggtgcgg atctggacga accgcacaag aaagagatcg cgatggaact ggtgagcagc 180

gcggagaaca gcagcctgga ctggaaggcg caataccgtt atatcgaaga tattggtgac 240

ggccgtggtt acaccgcggg catcattggt tttaccagcg gcaccggtga tatgctggag 300

ctggttgagt actataccaa ggcgaaaccg gacaacgtgc tggcgaagta tctgccggcg 360

ctgcgtaaag tgaacggcag cgatagccac gacggtctgg acccggactt caccgcggat 420

tggcacaagg cggcgaaaga cccggcgttt cagaaagcgc aaaacgatga gcgtgaccgt 480

gtttacttcg atccggcggt tgaccaggcg aagaaagatg gcctgcgtgc gctgggtcaa 540

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gaatatctgg atgcgttcct ggacgcgcgt aaggcggcga tgaaaaccga ggaagcgcac 720

agcgatacca gccgtgtgga caccgagcaa cgtgttttcc tggataaggg caactttgac 780

ctgaacccgc cgctgcactg gaaagtgtac ggtgacagct ataccattcc ggaa 834

<210> 3

<211> 278

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 3

Met Thr Lys Lys Pro Gly Thr Arg Leu Ala Ala Val Val Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Gly Leu Pro Leu Gly Thr Ala Ser Ala Ala Pro Glu

20 25 30

Thr Val His Ser Ala Thr Gln Arg Ala Gly Ala Asp Leu Asp Glu Pro

35 40 45

His Lys Lys Glu Ile Ala Met Glu Leu Val Ser Ser Ala Glu Asn Ser

50 55 60

Ser Leu Asp Trp Lys Ala Gln Tyr Arg Tyr Ile Glu Asp Ile Gly Asp

65 70 75 80

Gly Arg Gly Tyr Thr Ala Gly Ile Ile Gly Phe Thr Ser Gly Thr Gly

85 90 95

Asp Met Leu Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr Lys Ala Lys Pro Asp Asn

100 105 110

Val Leu Ala Lys Tyr Leu Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Gly Ser Asp

115 120 125

Ser His Asp Gly Leu Asp Pro Asp Phe Thr Ala Asp Trp His Lys Ala

130 135 140

Ala Lys Asp Pro Ala Phe Gln Lys Ala Gln Asn Asp Glu Arg Asp Arg

145 150 155 160

Val Tyr Phe Asp Pro Ala Val Asp Gln Ala Lys Lys Asp Gly Leu Arg

165 170 175

Ala Leu Gly Gln Phe Ile Tyr Tyr Asp Ala Met Val Met His Gly Pro

180 185 190

Gly Asp Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Ile Arg His Arg Ala Leu Glu

195 200 205

Lys Ala Lys Pro Pro Ala Gln Gly Gly Asp Glu Arg Glu Tyr Leu Asp

210 215 220

Ala Phe Leu Asp Ala Arg Lys Ala Ala Met Lys Thr Glu Glu Ala His

225 230 235 240

Ser Asp Thr Ser Arg Val Asp Thr Glu Gln Arg Val Phe Leu Asp Lys

245 250 255

Gly Asn Phe Asp Leu Asn Pro Pro Leu His Trp Lys Val Tyr Gly Asp

260 265 270

Ser Tyr Thr Ile Pro Glu

275

Claims

1.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的壳聚糖酶突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示。

3.含有权利要求2所述的壳聚糖酶突变体的编码基因的重组表达载体。

4.按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是重组原核表达载体或重组真核表达载体。

5.含有权利要求3所述重组表达载体的宿主细胞。

6.一种制备权利要求1所述壳聚糖酶突变体的方法，其特征在于，将所述壳聚糖酶突变体的编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在原核细胞或真核细胞中表达该编码基因的重组表达载体；将所述的重组表达载体转化到宿主细胞中进行诱导表达，收集并纯化所表达的重组蛋白，即得。

7.权利要求1所述的壳聚糖酶突变体在酶法生产壳寡糖中的应用。

8.权利要求2所述的壳聚糖酶突变体的编码基因在酶法生产壳寡糖中的应用。

9.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，以壳聚糖为底物，以所述壳聚糖酶突变体为水解酶，将壳聚糖水解为壳寡糖。

10.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，（1）将所述壳聚糖酶突变体的编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在原核细胞或真核细胞中表达该编码基因的重组表达载体；将所述的重组表达载体转化到宿主细胞中进行诱导表达，收集并纯化所表达的重组蛋白得到壳聚糖酶突变体；（2）以壳聚糖为底物，以壳聚糖酶突变体为水解酶，将壳聚糖水解为壳寡糖。