CN114350642B - 一种提高木聚糖酶的木二糖产量的方法及突变体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高木聚糖酶的木二糖产量的方法及突变体和应用。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。以山毛榉木木聚糖为底物，在pH6.5，37℃条件下反应2h，突变体木二糖终产量为6869nm，比野生型（5990nM）高出15%，同时该突变体的木糖产量也比野生型高12%（4355nm vs.3894nm）。

Description

一种提高木聚糖酶的木二糖产量的方法及突变体和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高木聚糖酶的木二糖产量的方法及突变体和应用。

背景技术

木二糖（Xylobiose）是低聚木糖的主要组成部分，具有能量低、耐酸性和热稳定性好等特性。因木二糖存在独特的β-1,4糖苷键，故不易被人体各种消化酶所分解，降低了糖分的有效吸收，食用后不会增加血糖浓度及胰岛素水平，是肥胖症患者或糖尿病人极佳的甜味剂，同时作为超强双歧因子，木二糖比其他低聚糖的双歧因子功能高1倍以上，在人体肠道内可选择性促进双歧杆菌的增殖活性，并可抑制有害菌的生长，改善肠道微生物菌群平衡，使人体肠道的内环境更加健康。随着生活水平的提高，膳食结构的改善，木二糖因其优越的营养保健功能而备受人们关注。此外，木二糖还被广泛地应用于医药、饲料、农业以及化妆品等领域。

木二糖可以通过木聚糖酶酶解法而制备。酶法具有反应选择性和专一性强，酶水解速率及程度易于控制，且分离得到的产物纯度较高以及副产物少等优点，是目前生产木二糖的理想方法。

β-1,4-内切木聚糖酶，其特异的作用于木聚糖主链内部的木糖苷键，将木聚糖彻底降解为低聚木糖，降低主链的聚合度，因此在木二糖实际生产当中被广泛应用。但是不同木聚糖酶由于结合亚位点与底物亲和力的不同而具有不同的水解特性，生产木二糖的能力也有差异。

发明内容

本发明提供了一种木二糖产量提高的木聚糖酶突变体。

本发明的另一目的是提供编码上述木二糖产量提高的木聚糖酶突变体的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种提高木聚糖酶的木二糖产量的方法。

本发明的再一目的是提供制备木二糖产量提高的木聚糖酶的方法。

根据本发明具体实施方式，对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型木聚糖酶进行突变。

野生型木聚糖酶的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明的木二糖产量提高的木聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

根据本发明的编码上述木二糖产量提高的木聚糖酶突变体的基因序列如SEQ IDNO：4所示。

根据本发明的提高木聚糖酶的木二糖产量的方法，所述方法包括对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型木聚糖酶实施N209H和M245W突变的步骤。

根据本发明的制备木二糖产量提高的木聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1）用上述包含上述木聚糖酶突变体基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达；

3）回收并纯化所表达提高木二糖产量的木聚糖酶突变体XynA-N209H/M245。

本发明通过对野生木聚糖酶实施N209H和M245W定点突变获得XynA-N209H/M245W突变体，将含突变体编码基因的重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3），获得重组表达菌株，将重组菌株进行发酵培养，收集菌体破壁后的上清液即为木聚糖酶突变体的粗酶液，将蛋白纯化后进行了酶学性质的测定和产物的鉴定，结果表明，突变体的最适温度和最适pH与野生型一致，此外，突变体在45℃条件下的热稳定性显著高于野生型；以山毛榉木木聚糖为底物，在pH6.5，37℃条件下反应2h，突变体木二糖终产量为6869nm，比野生型（5990nM）高出15%，同时该突变体的木糖产量也比野生型高12%（4355nm vs. 3894nm）。对于研究材料XynA的水解产物改造提供了重要的线索，同时对于提高该家族的其他木聚糖酶的木二糖产量提供了参考。

附图说明

图1显示木聚糖酶突变体和野生型的SDS-PAGE分析；

图2显示木聚糖酶突变体与野生型的最适反应温度对比；

图3显示木聚糖酶突变体与野生型的最适反应pH对比；

图4显示45℃条件下木聚糖酶突变体与野生型的热稳定性对比；

图5显示木聚糖酶突变体与野生型在pH 3-9下处理的pH稳定性对比；

图6显示木聚糖酶突变体与野生型生产木二糖的产量；

图7显示木聚糖酶突变体与野生型生产木糖的产量。

具体实施方式

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：表达宿主E.coli BL21(DE3),表达质粒载体pET-28a(+)；

2、酶类及其它生化试剂：内切酶、连接酶、底物山毛榉木木聚糖购自Sigma公司购自试剂公司；

3、培养基：大肠杆菌培养基LB（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH值自然）；

4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1木二糖产量提高的木聚糖酶突变体重组载体pET-28a(+)-xyna-N209H/M245W的制备。

将木聚糖酶野生型（突变前）序列片段克隆到表达载体pET-28a(+)上，重组载体命名pET-28a(+)-xyna；以重组载体pET-28a(+)-xyna为模板，通过携带突变位点的引物对其进行扩增，获得携带突变体序列的重组载体。首先使用引物N209H-F和N209H-R构建突变质粒pET-28a(+)-xyna-N209H，待测序正确后以此为模板，利用引物M245W-F和M245W-R构建突变质粒pET-28a(+)-xyna-N209H/M245W。

提高木二糖产量的木聚糖酶突变体pET-28a(+)-xyna-N209H/M245W特异性引物为：

N209H-F：（SEQ ID NO:5），

N209H-R：（SEQ ID NO:6）；

M245W-F：（SEQ ID NO:7），

M245W-R：（SEQ ID NO:8）。

实施例2木二糖产量提高的木聚糖酶突变体的制备

（1）提高木二糖产量的木聚糖酶突变体xyna-N209H/M245W摇瓶水平的表达

将得到的重组表达菌株BL21(pET-28a(+)-xyna-N209H/M245W)接种至50ml LB培养基中进行种子培养，200rpm，37℃培养16 h后，以1%接种量转接至400mL LB培养基中，200rpm，37℃培养2-3h后，测定菌体浓度，用酶标仪读取在波长600 nm下的吸光值，达到0.6-0.8时加入IPTG至终浓度为lmM，200rpm，16℃进行诱导表达。

（2）重组木聚糖酶的纯化

将诱导表达后的菌液12000 rpm，10 min离心，收集菌体，再用10 mM Tris-HCl溶液（pH 7.6）进行重悬,然后超声破碎，离心收集上清。用镍亲和层析法纯化蛋白,洗脱液为1M咪唑，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，收集洗脱液，进行SDS-PAGE，XynA及XynA-N209H/M245W蛋白纯化结果见图1。

实施例3 酶学性质测定

（1）木聚糖酶突变体和野生型最适温度测定

所述突变体XynA-N209H/M245W和XynA的最适温度测定为在100mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 6.5）缓冲液体系不同的温度（15、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃）下进行剩余酶活测定。定义最高酶活力为100%，计算各个温度下的相对酶活，以确定酶的最适温度，如图2所示，木聚糖酶突变体和野生型的最适温度都为40℃。

（2）木聚糖酶突变体和野生型最适pH测定

用100mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH2.5-7.0）及50mM Tris-HCl （pH8.0-9.0）的缓冲液配制底物溶液，在40℃条件下，pH2.5-9.0范围内每间隔0.5 个pH测定木聚糖酶突变体和野生型的酶活，定义最高酶活力为100%，计算其它各pH条件下木聚糖酶突变体和野生型的相对酶活，以确定最适pH，结果如图3所示，木聚糖酶突变体和野生型的最适pH都为6.5。

（3）木聚糖酶突变体和野生型的热稳定性测定

所述木聚糖酶突变体和野生型的热稳定性测定为在100mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 6.5）缓冲液体系45℃下处理不同时间（10、20、30、40、50、60min），再在40℃下进行剩余酶活性测定。如图4所示，野生型XynA在45℃下处理20min后，剩余酶活相当于处理前的65%，处理60min后剩余酶活相当于处理前的55%，而突变体在45℃下处理20min后，剩余酶活为100%，处理60min后，剩余酶活相当于处理前的90%，突变后酶在45℃的热稳定性大幅提高。

（4）木聚糖酶突变体和野生型的pH稳定性测定

所述木聚糖酶突变体和野生型的pH稳定性测定为在室温下和不同100mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 3-9）体系下处理60 min，再在pH 6.5 和40℃下进行剩余酶活性测定。如图5所示，木聚糖酶突变体和野生型在pH5-7范围内的相对酶活均在90%以上。

实施例4 HPAEC-PAD检测木二糖的产量

在2mLEP管中加入1%山毛榉木木聚糖900µL和从实施例2中获得的纯化后野生型或突变体酶液100µL（均按50U/mL的酶量添加），反应温度37℃，pH6.5，150rpm的水浴摇床中反应2小时，待反应结束后，煮沸10min使酶失活，12000rpm离心10min，收集上清，用0.22um的滤器过滤，所得滤液作为样品通过HPAEC-PAD来测定产物的含量。

HPAEC-PAD色谱分析检测的条件:色谱柱Dionex CarboPac PA-100 (4 ×250-mm)，流动相为1M的NaOH溶液。

检测结果如图6、图7所示，双点突变体木二糖产量为6869nm，与野生型相比，XynA-N209H/M245W的木二糖产量提高了15%，同时，木糖的产量也比野生型高12%。

以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种提高木聚糖酶的木二糖产量的方法及突变体和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Gly Leu Lys Asp Ile Tyr Lys Asp Tyr Phe Leu Ile Gly Val Ala

1 5 10 15

Val Asn Gln Arg Asn Val Ser Asn Ala Glu Gln Ala Ala Leu Val Lys

20 25 30

Gln Glu Phe Asn Ser Ile Thr Cys Glu Asn Asp Met Lys Pro Glu Pro

35 40 45

Thr Glu Pro Gln Glu Gly Lys Phe Asn Trp Glu Ala Ala Asp Arg Ile

50 55 60

Ala Asn Phe Cys Arg Thr Asn Gly Ile Lys Leu Arg Gly His Cys Leu

65 70 75 80

Met Trp His Ser Gln Ile Gly Arg Trp Met Tyr Ser Asp Asn Pro Thr

85 90 95

Lys Glu Val Phe Phe Gln Arg Met Lys Asn His Ile Gln Ala Val Val

100 105 110

Ser Arg Tyr Lys Asp Val Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala

115 120 125

Met Thr Asp Asp Pro Lys Ala Glu Asp Pro Phe Arg Gln Ser Pro Leu

130 135 140

Tyr Lys Ile Ala Gly Asp Glu Phe Ile Ala Lys Ala Phe Gln Tyr Ala

145 150 155 160

Arg Glu Ala Asp Pro Asn Ala Leu Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Glu

165 170 175

Cys Asp Pro Val Lys Ser Gln Arg Ile Tyr Glu Met Val Lys Arg Met

180 185 190

Lys Glu Asn Gly Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Met Gln Gly His Tyr

195 200 205

Asn Ile Tyr Gly Pro Thr Glu Ala Glu Ile Asp Ala Ala Ile Thr Lys

210 215 220

Tyr Lys Ser Ile Val Lys His Ile His Val Thr Glu Leu Asp Ile Arg

225 230 235 240

Val Asn Ala Glu Met Gly Gly Gln Leu Gln Phe Ser Arg Glu Gly Val

245 250 255

Ala Val Ser Asp Ser Val Lys Gln His Leu Ala Asp Gln Tyr Ala Arg

260 265 270

Val Phe Asn Val Leu Arg Lys His Arg Asp Val Ile Asp Cys Val Thr

275 280 285

Phe Trp Asn Leu Ser Asp Arg Asp Ser Trp Leu Gly Gln Asn Asn Tyr

290 295 300

Pro Leu Pro Phe Asp Ala Asn Tyr Lys Pro Lys Met Ala Tyr Asp Tyr

305 310 315 320

Ile Lys Gln Met Lys Ala Pro Ala Trp Pro Ile Pro Glu Lys Pro Lys

325 330 335

Pro Asn Pro Asn Gln Gln Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Phe Gly Gly

340 345 350

Pro Gln Arg Pro Pro Phe Asn Pro Ala Leu Ala Phe Ala Glu Gln Pro

355 360 365

Gly Val Lys Glu Asp Phe Val Pro Ser Glu Leu Asn Gln Pro Gly

370 375 380

<210> 2

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaggcctga aagacatcta caaggactac ttccttatcg gtgtggccgt gaaccagcgc 60

aacgtctcca atgctgagca ggccgctctc gtgaagcaag agttcaacag catcacttgc 120

gagaacgaca tgaagcccga gcccactgaa ccccaggaag gaaaattcaa ctgggaagct 180

gccgaccgca tcgccaactt ctgccgcacc aatggcatca agctccgtgg ccactgcctg 240

atgtggcaca gccagatcgg acgctggatg tacagcgaca accccacgaa ggaagtgttc 300

ttccagcgca tgaaaaacca catccaggct gtcgtcagcc gctacaagga cgtggtctac 360

gcttgggacg tggtgaacga ggccatgacc gatgacccga aggccgagga tcccttccgc 420

cagtcgcctc tctacaagat tgccggcgac gagttcatcg ccaaggcttt ccagtatgcc 480

cgcgaggccg accccaacgc cctcttgttc tacaacgact acaatgagtg cgaccccgtg 540

aagagccagc gcatctacga gatggtgaag cgcatgaagg agaacggtgt gcccatcgac 600

ggtatcggca tgcagggtca ctacaacatc tacggaccga cagaggccga gatcgatgct 660

gccatcacca aatacaagag catcgtgaag cacatccatg tgaccgagct cgacatccgt 720

gtcaacgccg agatgggtgg acagctgcag ttcagccgcg agggtgtggc agtgagcgac 780

agtgtgaagc agcacctcgc cgaccagtat gcccgtgtgt tcaacgtgct gcgcaagcac 840

cgcgatgtca tcgactgtgt gaccttctgg aacctctccg accgcgactc ctggctcggg 900

cagaacaact acccgctgcc tttcgacgcc aactacaaac ccaagatggc ctacgactat 960

atcaagcaga tgaaagctcc ggcatggccc atccccgaga aaccgaaacc caaccccaac 1020

cagcagcgtc agcgccgtcg tggcggattt ggcggtccac agcgtcctcc tttcaatccc 1080

gcactggctt tcgccgagca acctggcgtg aaagaggatt tcgtgccctc tgagctcaac 1140

cagcctgga 1149

<210> 3

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Gly Leu Lys Asp Ile Tyr Lys Asp Tyr Phe Leu Ile Gly Val Ala

1 5 10 15

Val Asn Gln Arg Asn Val Ser Asn Ala Glu Gln Ala Ala Leu Val Lys

20 25 30

Gln Glu Phe Asn Ser Ile Thr Cys Glu Asn Asp Met Lys Pro Glu Pro

35 40 45

Thr Glu Pro Gln Glu Gly Lys Phe Asn Trp Glu Ala Ala Asp Arg Ile

50 55 60

Ala Asn Phe Cys Arg Thr Asn Gly Ile Lys Leu Arg Gly His Cys Leu

65 70 75 80

Met Trp His Ser Gln Ile Gly Arg Trp Met Tyr Ser Asp Asn Pro Thr

85 90 95

Lys Glu Val Phe Phe Gln Arg Met Lys Asn His Ile Gln Ala Val Val

100 105 110

Ser Arg Tyr Lys Asp Val Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala

115 120 125

Met Thr Asp Asp Pro Lys Ala Glu Asp Pro Phe Arg Gln Ser Pro Leu

130 135 140

Tyr Lys Ile Ala Gly Asp Glu Phe Ile Ala Lys Ala Phe Gln Tyr Ala

145 150 155 160

Arg Glu Ala Asp Pro Asn Ala Leu Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Glu

165 170 175

Cys Asp Pro Val Lys Ser Gln Arg Ile Tyr Glu Met Val Lys Arg Met

180 185 190

Lys Glu Asn Gly Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Met Gln Gly His Tyr

195 200 205

His Ile Tyr Gly Pro Thr Glu Ala Glu Ile Asp Ala Ala Ile Thr Lys

210 215 220

Tyr Lys Ser Ile Val Lys His Ile His Val Thr Glu Leu Asp Ile Arg

225 230 235 240

Val Asn Ala Glu Trp Gly Gly Gln Leu Gln Phe Ser Arg Glu Gly Val

245 250 255

Ala Val Ser Asp Ser Val Lys Gln His Leu Ala Asp Gln Tyr Ala Arg

260 265 270

Val Phe Asn Val Leu Arg Lys His Arg Asp Val Ile Asp Cys Val Thr

275 280 285

Phe Trp Asn Leu Ser Asp Arg Asp Ser Trp Leu Gly Gln Asn Asn Tyr

290 295 300

Pro Leu Pro Phe Asp Ala Asn Tyr Lys Pro Lys Met Ala Tyr Asp Tyr

305 310 315 320

Ile Lys Gln Met Lys Ala Pro Ala Trp Pro Ile Pro Glu Lys Pro Lys

325 330 335

Pro Asn Pro Asn Gln Gln Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Phe Gly Gly

340 345 350

Pro Gln Arg Pro Pro Phe Asn Pro Ala Leu Ala Phe Ala Glu Gln Pro

355 360 365

Gly Val Lys Glu Asp Phe Val Pro Ser Glu Leu Asn Gln Pro Gly

370 375 380

<210> 4

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caaggcctga aagacatcta caaggactac ttccttatcg gtgtggccgt gaaccagcgc 60

aacgtctcca atgctgagca ggccgctctc gtgaagcaag agttcaacag catcacttgc 120

gagaacgaca tgaagcccga gcccactgaa ccccaggaag gaaaattcaa ctgggaagct 180

gccgaccgca tcgccaactt ctgccgcacc aatggcatca agctccgtgg ccactgcctg 240

atgtggcaca gccagatcgg acgctggatg tacagcgaca accccacgaa ggaagtgttc 300

ttccagcgca tgaaaaacca catccaggct gtcgtcagcc gctacaagga cgtggtctac 360

gcttgggacg tggtgaacga ggccatgacc gatgacccga aggccgagga tcccttccgc 420

cagtcgcctc tctacaagat tgccggcgac gagttcatcg ccaaggcttt ccagtatgcc 480

cgcgaggccg accccaacgc cctcttgttc tacaacgact acaatgagtg cgaccccgtg 540

aagagccagc gcatctacga gatggtgaag cgcatgaagg agaacggtgt gcccatcgac 600

ggtatcggca tgcagggtca ctaccatatc tacggaccga cagaggccga gatcgatgct 660

gccatcacca aatacaagag catcgtgaag cacatccatg tgaccgagct cgacatccgt 720

gtcaacgccg agtggggtgg acagctgcag ttcagccgcg agggtgtggc agtgagcgac 780

agtgtgaagc agcacctcgc cgaccagtat gcccgtgtgt tcaacgtgct gcgcaagcac 840

cgcgatgtca tcgactgtgt gaccttctgg aacctctccg accgcgactc ctggctcggg 900

cagaacaact acccgctgcc tttcgacgcc aactacaaac ccaagatggc ctacgactat 960

atcaagcaga tgaaagctcc ggcatggccc atccccgaga aaccgaaacc caaccccaac 1020

cagcagcgtc agcgccgtcg tggcggattt ggcggtccac agcgtcctcc tttcaatccc 1080

gcactggctt tcgccgagca acctggcgtg aaagaggatt tcgtgccctc tgagctcaac 1140

cagcctgga 1149

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcagggtcac taccatatct acggaccgac agag 34

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtagatatg gtagtgaccc tgcatgccga taccgtc 37

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtcaacgcc gagtggggtg gacagctgca gttc 34

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagctgtcc accccactcg gcgttgacac ggatg 35

Claims (9)

1.一种木二糖产量提高的木聚糖酶XynA突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

2.一种木聚糖酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的木二糖产量提高的木聚糖酶XynA突变体。

3.根据权利要求2所述的木聚糖酶基因，其特征在于，所述木聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

4.包含权利要求2所述木聚糖酶基因的重组载体。

5.包含权利要求2所述木聚糖酶基因的重组菌株。

6.一种提高木聚糖酶的木二糖产量的方法，其特征在于，所述方法包括对氨基酸序列如SEQ ID NO：1木聚糖酶进行N209H和M245W突变的步骤。

7.权利要求1所述木二糖产量提高的木聚糖酶XynA突变体的应用。

8.权利要求1所述木二糖产量提高的木聚糖酶XynA突变体用于水解木聚糖生产木二糖的应用。

9.一种制备木二糖产量提高的木聚糖酶XynA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

用包含权利要求2所述木聚糖酶基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达；

回收并纯化所表达提高木二糖产量的木聚糖酶。

Images