CN113215136A - 一种壳聚糖酶突变体CsnT及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种壳聚糖酶突变体CsnT及其应用。本发明提供的壳聚糖酶突变体CsnT是以壳聚糖酶Csnbm为出发模板，通过增加二硫键获得突变体CsnT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得的壳聚糖酶突变体CsnT，在55℃、60℃以及65℃热处理30分钟后的酶活保留率分别为Csnbm的4.46倍、6.4倍和7.5倍，可用于制备重组载体、重组菌株。本发明获得的壳聚糖酶突变体CsnT具有良好的热稳定性，可用于壳寡糖制备领域，并进一步为其广泛应用奠定基础。

Description

一种壳聚糖酶突变体CsnT及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种壳聚糖酶突变体CsnT及其应用。

背景技术

壳寡糖作为一种生物活性物质，具备抗菌、抗肿瘤、提升免疫力等功效，因此其被广泛应用于农业、畜牧业、食品以及医药等行业。目前壳寡糖的制备主要分为物理法、化学法以及酶法。相对于物理法和化学法，酶法制备壳寡糖具备许多优势如：反应条件温和、产物结构完整、过程易于控制、对环境无污染等优点。

相比化学法和物理法，酶法工艺具有很多优点，同时其缺点也很明显，目前酶法工艺生产成本高，从而限制其大规模应用。在前期的研究中我们通过基因克隆获得了海洋细菌Bacillus mojavensis的壳聚糖酶Csnbm，通过重组表达发现Csnbm酶比活性高且水解速度快，具有产业化的价值。随着研究的深入，我们发现壳聚糖酶Csnbm热稳定性较差，当处理温度大于55℃时，壳聚糖酶Csnbm容易变性失活，限制了壳聚糖酶Csnbm的产业化应用。因此提升壳聚糖酶Csnbm的热稳定性具有重要意义。在本发明中，通过蛋白质理性设计获得了壳聚糖酶Csnbm的突变体CsnT。相比于壳聚糖酶Csnbm，突变体CsnT的热稳定性得到有效提升，此外通过共表达分子伴侣蛋白PDI进一步提升突变体CsnT在毕赤酵母的表达量，为其产业化应用奠定基础。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种壳聚糖酶突变体CsnT及其应用。本发明获得的壳聚糖酶突变体CsnT，在55℃、60℃以及65℃热处理30分钟后的酶活保留率分别为Csnbm的4.46倍、6.4倍和7.5倍，有效提高了壳聚糖酶的热稳定性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种壳聚糖酶突变体CsnT，所述壳聚糖酶突变体CsnT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

AGLNKDQKRRAEQLTSICENGTTEIQYGYVEPLGDGRGYTCGRAGFTTATGDALEVVEVYTKAVPNNKLKKYLPELRRLAEEESDDISNLKGFASVWRSLGNDKDFRAAQDKVNDRLYYQPAMKRSENAGLKCALAKAVMYDTVIQHGDGDDPDSFYALIKRTNKKAGGSPKDGIEEKKWLNKFLDVRYDDLMNPADPDTRDEWRESVACVDVLRSIAKSNNCNLNGPINIHSTEYGDFVIK（SEQ ID NO.1）

优选的，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

GCTGGTTTGAACAAGGACCAAAAGAGAAGGGCTGAGCAGTTGACTTCCATCTGCGAGAACGGTACTACCGAGATCCAGTACGGTTACGTTGAACCACTTGGTGACGGTAGAGGTTACACTTGTGGTAGAGCTGGTTTCACTACTGCTACTGGTGACGCTTTGGAGGTTGTTGAGGTTTACACTAAGGCCGTGCCAAACAACAAGCTGAAGAAGTACTTGCCAGAGCTGAGAAGATTGGCCGAAGAAGAATCTGACGACATCTCCAACTTGAAGGGTTTCGCTTCTGTTTGGAGATCCCTGGGTAACGACAAGGATTTCAGAGCTGCTCAGGACAAGGTTAACGACAGACTGTACTACCAGCCAGCCATGAAGAGATCTGAAAACGCCGGTTTGAAATGCGCTTTGGCCAAGGCTGTTATGTACGACACTGTTATTCAACACGGTGACGGTGATGACCCAGACTCTTTCTACGCTCTGATCAAGAGGACCAACAAGAAAGCTGGTGGTTCTCCAAAGGACGGTATCGAAGAAAAGAAGTGGCTGAACAAGTTCCTGGACGTCAGATACGACGACTTGATGAACCCAGCTGATCCAGACACTAGAGATGAATGGCGTGAATCCGTTGCCTGCGTTGACGTCTTGAGATCCATTGCCAAGTCCAACAACTGCAACCTGAACGGTCCAATCAACATCCACTCCACTGAATACGGTGACTTCGTCATCAAGTAA（SEQ ID NO.2）

本发明的又一个目的是提供一种重组表达载体pPICZαA-csnt，包含所述的壳聚糖酶突变体CsnT。

本发明又一个目的是提供一种重组菌，包含所述的重组表达载体pPICZαA-csnt。

优选的，所述重组菌还包含表达所述壳聚糖酶突变体CsnT的分子伴侣蛋白表达载体pGAPGA-pdi。

本发明的又一个目的是提供一种重组酵母工程菌，包含所述的重组表达载体pPICZαA-csnt和所述的重组菌。

本发明最后一个目的是提供一种所述的壳聚糖酶突变体CsnT在制备壳寡糖中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种壳聚糖酶突变体CsnT及其应用。本发明获得的壳聚糖酶突变体CsnT，在55℃、60℃以及65℃热处理30分钟后的酶活保留率分别为Csnbm的4.46倍、6.4倍和7.5倍，本发明的获得的壳聚糖酶突变体CsnT有效提高了壳聚糖酶的热稳定性。

附图说明

图1为重组工程菌X33-PT55高密度发酵曲线图；

图2为纯化后重组CsnT（A）和去糖基化（B）蛋白电泳图；

图3为壳聚糖突变体CsnT最适反应温度（A）和热稳定性（B）图；

图4为壳聚糖突变体CsnT水解壳聚糖薄层层析图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明中涉及到的实验材料和试剂：

1.菌株与载体

大肠杆菌菌株Top10购自深圳辉诺生物科技有限公司、毕赤酵母X33和表达载体pPICZαA以及pGAPZA均购自美国Invitrogen公司，表达载体pPICZαA-csnbm由前期实验构建，构建过程如下：

将来源于Bacillus mojavensis的壳聚糖酶基因（GenBank:CP051464.1）根据毕赤酵母密码子进行优化，由安徽通用生物公司提供的优化软件进行优化，将优化后的基因csnbm连接至表达载体pPICZαA获得表达载体pPICZαA-csnbm，优化后的基因csnbm序列如SEQ ID NO.3所示：

GCTGGTTTGAACAAGGACCAAAAGAGAAGGGCTGAGCAGTTGACTTCCATCTTCGAGAACGGTACTACCGAGATCCAGTACGGTTACGTTGAACCACTTGGTGACGGTAGAGGTTACACTTGTGGTAGAGCTGGTTTCACTACTGCTACTGGTGACGCTTTGGAGGTTGTTGAGGTTTACACTAAGGCCGTGCCAAACAACAAGCTGAAGAAGTACTTGCCAGAGCTGAGAAGATTGGCCGAAGAAGAATCTGACGACATCTCCAACTTGAAGGGTTTCGCTTCTGTTTGGAGATCCCTGGGTAACGACAAGGATTTCAGAGCTGCTCAGGACAAGGTTAACGACAGACTGTACTACCAGCCAGCCATGAAGAGATCTGAAAACGCCGGTTTGAAAACTGCTTTGGCCAAGGCTGTTATGTACGACACTGTTATTCAACACGGTGACGGTGATGACCCAGACTCTTTCTACGCTCTGATCAAGAGGACCAACAAGAAAGCTGGTGGTTCTCCAAAGGACGGTATCGAAGAAAAGAAGTGGCTGAACAAGTTCCTGGACGTCAGATACGACGACTTGATGAACCCAGCTGATCCAGACACTAGAGATGAATGGCGTGAATCCGTTGCCAGAGTTGACGTCTTGAGATCCATTGCCAAGTCCAACAACTACAACCTGAACGGTCCAATCAACATCCACTCCACTGAATACGGTGACTTCGTCATCAAGTAA（SEQ ID NO.3）

表达载体pGAPGA-pdi前期实验构建，构建过程如下：

以载体pGAPZA为模板，通过PCR去掉其抗性基因Zeocin，获得主框架；以pPIC9K为模板，通过PCR扩增获得抗性基因G418；通过无缝克隆将主框架和G418抗性基因进行融合，获得载体pGAPGA；将PDI编码基因pdi连接至载体pGAPGA，获得表达载体pGAPGA-pdi。其中，载体pGAPZA的基因序列信息可参见网址：

pPIC9K的载体的基因序列信息可参见网址：

抗性G418基因序列信息SEQ ID NO.4所示，PDI编码基因pdi的基因序列信息SEQID NO.5所示，表达载体pGAPGA-pdi的基因序列信息SEQ ID NO.6所示，其中划波浪线部分为pdi的基因序列信息，直线下划线的为抗性G418基因序列信息。

ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA（SEQ ID NO.4）

ATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTGTGGCAAGTATTTTGTCCGCTCTCACACTAGCACAAGCAAGTGATCAGGAGGCTATTGCTCCAGAGGACTCTCATGTCGTCAAATTGACTGAAGCCACTTTTGAGTCTTTCATCACCAGTAATCCTCACGTTTTGGCAGAGTTTTTTGCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAAGTTGGGCCCTGAACTTGTTTCTGCTGCCGAGATCTTAAAGGACAATGAGCAGGTTAAGATTGCTCAAATTGATTGTACGGAGGAGAAGGAATTATGTCAAGGCTACGAAATTAAAGGGTATCCTACTTTGAAGGTGTTCCATGGTGAGGTTGAGGTCCCAAGTGACTATCAAGGTCAAAGACAGAGCCAAAGCATTGTCAGCTATATGCTAAAGCAGAGTTTACCCCCTGTCAGTGAAATCAATGCAACCAAAGATTTAGACGACACAATCGCCGAGGCAAAAGAGCCCGTGATTGTGCAAGTACTACCGGAAGATGCATCCAACTTGGAATCTAACACCACATTTTACGGAGTTGCCGGTACTCTCAGAGAGAAATTCACTTTTGTCTCCACTAAGTCTACTGATTATGCCAAAAAATACACTAGCGACTCGACTCCTGCCTATTTGCTTGTCAGACCTGGCGAGGAACCTAGTGTTTACTCTGGTGAGGAGTTAGATGAGACTCATTTGGTGCACTGGATTGATATTGAGTCCAAACCTCTATTTGGAGACATTGACGGATCCACCTTCAAATCATATGCTGAAGCTAACATCCCTTTAGCCTACTATTTCTATGAGAACGAAGAACAACGTGCTGCTGCTGCCGATATTATTAAACCTTTTGCTAAAGAGCAACGTGGCAAAATTAACTTTGTTGGCTTAGATGCCGTTAAATTCGGTAAGCATGCCAAGAACTTAAACATGGATGAAGAGAAACTCCCTCTATTTGTCATTCATGATTTGGTGAGCAACAAGAAGTTTGGAGTTCCTCAAGACCAAGAATTGACGAACAAAGATGTGACCGAGCTGATTGAGAAATTCATCGCAGGAGAGGCAGAACCAATTGTGAAATCAGAGCCAATTCCAGAAATTCAAGAAGAGAAAGTCTTCAAGCTAGTCGGAAAGGCCCACGATGAAGTTGTCTTCGATGAATCTAAAGATGTTCTAGTCAAGTACTACGCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAGAATGGCTCCTGCTTATGAGGAATTGGCTACTCTTTACGCCAATGATGAGGATGCCTCTTCAAAGGTTGTGATTGCAAAACTTGATCACACTTTGAACGATGTCGACAACGTTGATATTCAAGGTTATCCTACTTTGATCCTTTATCCAGCTGGTGATAAATCCAATCCTCAACTGTATGATGGATCTCGTGACCTAGAATCATTGGCTGAGTTTGTAAAGGAGAGAGGAACCCACAAAGTGGATGCCCTAGCACTCAGACCAGTCGAGGAAGAAAAGGAAGCTGAAGAAGAAGCTGAAAGTGAGGCAGACGCTCACGACGAGCTTTAA（SEQ ID NO.5）

AGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCGTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGTCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAGAGCTTCTTCTACGGCCCCCTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAAAAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAAAGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACTTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAATTGAACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTGTGGCAAGTATTTTGTCCGCTCTCACACTAGCACAAGCAAGTGATCAGGAGGCTATTGCTCCAGAGGACTCTCATGTCGTCAAATTGACTGAAGCCACTTTTGAGTCTTTCATCACCAGTAATCCTCACGTTTTGGCAGAGTTTTTTGCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAAGTTGGGCCCTGAACTTGTTTCTGCTGCCGAGATCTTAAAGGACAATGAGCAGGTTAAGATTGCTCAAATTGATTGTACGGAGGAGAAGGAATTATGTCAAGGCTACGAAATTAAAGGGTATCCTACTTTGAAGGTGTTCCATGGTGAGGTTGAGGTCCCAAGTGACTATCAAGGTCAAAGACAGAGCCAAAGCATTGTCAGCTATATGCTAAAGCAGAGTTTACCCCCTGTCAGTGAAATCAATGCAACCAAAGATTTAGACGACACAATCGCCGAGGCAAAAGAGCCCGTGATTGTGCAAGTACTACCGGAAGATGCATCCAACTTGGAATCTAACACCACATTTTACGGAGTTGCCGGTACTCTCAGAGAGAAATTCACTTTTGTCTCCACTAAGTCTACTGATTATGCCAAAAAATACACTAGCGACTCGACTCCTGCCTATTTGCTTGTCAGACCTGGCGAGGAACCTAGTGTTTACTCTGGTGAGGAGTTAGATGAGACTCATTTGGTGCACTGGATTGATATTGAGTCCAAACCTCTATTTGGAGACATTGACGGATCCACCTTCAAATCATATGCTGAAGCTAACATCCCTTTAGCCTACTATTTCTATGAGAACGAAGAACAACGTGCTGCTGCTGCCGATATTATTAAACCTTTTGCTAAAGAGCAACGTGGCAAAATTAACTTTGTTGGCTTAGATGCCGTTAAATTCGGTAAGCATGCCAAGAACTTAAACATGGATGAAGAGAAACTCCCTCTATTTGTCATTCATGATTTGGTGAGCAACAAGAAGTTTGGAGTTCCTCAAGACCAAGAATTGACGAACAAAGATGTGACCGAGCTGATTGAGAAATTCATCGCAGGAGAGGCAGAACCAATTGTGAAATCAGAGCCAATTCCAGAAATTCAAGAAGAGAAAGTCTTCAAGCTAGTCGGAAAGGCCCACGATGAAGTTGTCTTCGATGAATCTAAAGATGTTCTAGTCAAGTACTACGCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAGAATGGCTCCTGCTTATGAGGAATTGGCTACTCTTTACGCCAATGATGAGGATGCCTCTTCAAAGGTTGTGATTGCAAAACTTGATCACACTTTGAACGATGTCGACAACGTTGATATTCAAGGTTATCCTACTTTGATCCTTTATCCAGCTGGTGATAAATCCAATCCTCAACTGTATGATGGATCTCGTGACCTAGAATCATTGGCTGAGTTTGTAAAGGAGAGAGGAACCCACAAAGTGGATGCCCTAGCACTCAGACCAGTCGAGGAAGAAAAGGAAGCTGAAGAAGAAGCTGAAAGTGAGGCAGACGCTCACGACGAGCTTTAAGCGGCCGCCAGCTTGGGCCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTTCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAATTTTTTTTTTTAGTTTTTTTCTCTTTCAGTGACCTCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGTTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGGGCGGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAACACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTCGGAGATCCGTCCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGGAGACCAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATGAGATC（SEQ ID NO.6）

2.酶与试剂盒

Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司；质粒提取试剂盒（#DP103-03），胶纯化试剂盒（#DP209-02）购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶SacI、Taq酶MIX（EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix）购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Zeocin购自Invitrogen公司；G418购自麦克林试剂公司。

3.培养基

大肠杆菌培养基为LB（1%（w/v）蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物，1%（w/v）NaCl，pH7.0），LBZ为LB培养基加25μg/mL Zeocin（博莱霉素）；

酵母培养基为YPD（1%（w/v）酵母提取物，2%（w/v）蛋白胨，2%（w/v）葡萄糖），酵母筛选培养基为YPDZ（YPD + 300mg/L zeocin）；YPDG（YPD+不同浓度的G418）；

酵母诱导培养基BMGY（1％（w/v）酵母提取物、2％（w/v）蛋白胨、1.34％（w/v）YNB、0.00004％（w/v）Biotin、1％甘油(V/V)），注：YNB为酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)；Biotin为生物素。

4.壳聚糖酶活性测定所用试剂

乙酸乙酸钠（0.2 mol/L pH5.0）；壳聚糖底物：（1%（w/v）壳聚糖溶于pH5.5，0.2mol/L乙酸乙酸钠溶液）；DNS试剂（6.3‰（w/v）3,5-二硝基水杨酸；18.2%（w/v）四水酒石酸钾钠；5‰（w/v）苯酚；5‰（w/v）无水亚硫酸钠）。

5.壳聚糖酶活性测定所用试剂

壳聚糖酶活性的测定方法如下：首先将壳聚糖底物和酶液在50℃进行预热；将预热好的50μL酶液加入1.5mL离心管，然后加入350μL壳聚糖底物，50℃反应10分钟后加入600μL DNS试剂终止反应，于100℃沸水浴5分钟进行显色，冷却后离心取上清在540nm下测定吸光值。酶活单位的定义为：每分钟生成1μmol还原糖所用酶的量定义为一个活力单位。

实施例1 二硫键理性设计提升壳聚糖酶Csnbm热稳定性

通过在线软件SWISS-MODEL同源建模获得壳聚糖酶Csnbm蛋白三维构象。通过分子动力学模拟软件Gromacs对壳聚糖酶Csnbm蛋白三维构象进行分子动力学模拟获得壳聚糖酶Csnbm蛋白柔性区域。通过增加壳聚糖酶Csnbm蛋白柔性区域的刚性从而提升其热稳定性。通过在线软件Disulfide by Design 2.0预测分析壳聚糖酶Csnbm不同氨基酸之间二硫键成键的可能性。根据预测分析结果，从中选取8对二硫键突变体进行实验，这8对二硫键分别为F18C/R210C、F46C/D52C、G51C/A80C、D103C/F106C、A129C/L131C、T133C/Y223C、P171C/E177C和A209C/T234C。

分别设计引物和构建突变体，其中，8对二硫键引物序列信息如下表1所示，引物序列如SEQ ID NO.7~30所示，二硫键突变体的构建过程如下：

（以突变体F18C/R210C为例，其他以此类推）：以构建好的pPICZαA-csnbm为模板，先用上下游引物F18C-fw和F18C-rev进行PCR扩增，所述PCR反应体系如下表2所示，琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物。PCR产物回收过程大致如下：（1）将目标产物进行切胶放入2ml离心管；（2）加入溶胶液，在60℃条件下反应10分钟；（3）将第二步的溶胶液体加入收集管，10000rpm离心1分钟；（4）用75%乙醇洗两次后晾干；（5）加入50μL水，离心3分钟。

表1 二硫键突变体引物序列表

表2 PCR反应体系

PCR反应程序如下：

模板质粒pPICZαA-csnbm的存在会导致转化以及菌液PCR的时候出现假阳性，因此需要去掉模板质粒pPICZαA-csnbm。用限制性内切酶DpnI将pPICZαA-csnbm分解。

将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，具体的菌液PCR验证实验步骤为：用高压灭菌的牙签挑取单个菌落至含有500μL的LBZ培养基中37℃，200rpm培养4小时；吸取2μL菌液作为PCR的模板，PCR反应体系如表3所示；菌液PCR所用引物为5’AOX-fw和3’AOX-rev，其中，引物5’AOX-fw的序列信息如SEQ ID NO.31所示，引物3’AOX-rev的序列信息如SEQ ID NO.32所示，反应体系如下表3所示，PCR扩增条件为95℃ 5min，94℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30循环，电泳后，观察结果，对阳性的结果相对应的平板上的菌落进行测序。

5’AOX-fw：GACTGGTTCCAATTGACAAGC（SEQ ID NO.31）；

3’AOX-rev：GGCACCTGGCATTCTGACATCC（SEQ ID NO.32）。

表3 菌液PCR反应体系

按照相同的方法以F18C突变体质粒为模板，用引物R210C-fw和R210C-rev进行PCR扩增，纯化，转化大肠杆菌Top10，使用天根生化科技(北京)有限公司质粒提取试剂盒（#DP103-03）提取质粒，测序，最终获得突变体F18C/R210C。将测序正确的突变体，用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。电转过程大致如下：（1）将酵母感受态细胞置于冰上放置20分钟；（2）加入80ng线性化后的表达载体，混匀冰上放置5分钟后进行电转化，电转化条件为1.5千伏，400欧姆；（3）电击完后立即加入0.6mL预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；（4）30℃，静止放置2小时后涂布于YPDZ平板，培养2~3天后观察转化子的情况。为了使壳聚糖酶表达框以单拷贝的形式存在，转入的质粒浓度控制在80ng。

实施例2 二硫键突变体筛选

用牙签逐个将二硫键酵母重组转化子（实施例1获得的电转后的产物）挑至每孔含有1.6mL BMGY培养基的24孔板中，30℃，220rpm培养24h左右，再分别加入1%（v/v）的甲醇进行诱导培养。30℃，220rpm培养24小时后，220rpm离心15min，取上清进行酶活测定。每个二硫键突变体挑选一个酶活最高的重组工程菌种进行摇瓶培养。摇瓶培养在250mL三角瓶中进行，首先将相应的重组工程菌种接入含有5mL BMGY培养基的50mL离心管中，30℃，220rpm培养24小时左右，将培养好的重组酵母工程菌种按1%（v/v）的接种量接入含有50mL BMMY培养基的250mL三角瓶中。摇瓶培养条件为30℃，220rpm，每隔24小时加入1%（v/v）的甲醇进行诱导，同时取样进行活性测定和热稳定性测试。

活性测定方法如下：首先将壳聚糖底物和酶液在50℃进行预热；将预热好的50μL酶液加入1.5mL离心管，然后加入350μL壳聚糖底物，50℃反应10分钟后加入600μL DNS试剂终止反应，于100℃沸水浴5分钟进行显色，冷却后离心取上清在540nm下测定吸光值。酶活单位的定义为：每分钟生成1μmol还原糖所用酶的量定义为一个活力单位。

热稳定性测试方法如下：将发酵上清酶液稀释5倍，将稀释好的酶液在55℃水浴保温30分钟后进行残留酶活测定，以没有热处理的样品作为对照。原始Csnbm及二硫键突变体重组菌摇瓶培养72小时酶活及初步热稳定性如表4所示。

由表4可知，8对二硫键突变体中，只有突变体F18C/R210C和T133C/Y223C能够提升Csnbm的热稳定性。

表4 不同二硫键摇瓶酶活及热稳定性

实施例3 二硫键组合突变体构建及高拷贝重组工程菌筛选

将实施列2筛选到的有效二硫键F18C/R210C和T133C/Y223C进行组合，组合突变体的构建以及筛选过程参照实施例2。通过热稳定性分析，组合突变体F18C/R210C-T133C/Y223C（命名为CsnT）在55℃水浴保温30分钟后的残留酶活为56%，相比于Csnbm、F18C/R210C以及T133C/Y223C，热稳定性分别提升366%，166%和101%。组合突变体CsnT虽然有效提升了热稳定性，但是其对应的重组工程菌摇瓶培养72小时，发酵酶活只有32U/mL。因此需要进一步提升组合突变体CsnT在毕赤酵母中的表达酶活。

基因拷贝数和重组酶的表达量具有一定的关联性，在本部分拟通过构建高拷贝来提升突变体CsnT的表达量。电转化时，线性化表达载体的浓度大于33μg/mL，电转后的转化子涂布在不同浓度的YPDZ平板（100mg/L-500mg/L zeocin）。转化子的筛选方法同实施列2一致，通过筛选获得了一个酶活优势菌命名为C12。重组菌C12摇瓶培养72小时，酶活为46U/ml。通过荧光定量PCR分析，发现重组工程菌C12的基因拷贝数为5拷贝。

实施例4 分子伴侣蛋白PDI共表达

分子伴侣蛋白PDI能够提高毕赤酵母对含有二硫键蛋白的加工效率，因此共表达分子伴侣蛋白PDI能够提升含有二硫键重组蛋白在毕赤酵母的表达量。本专利以重组工程菌C12为宿主，转入分子伴侣表达载体pGAPGA-pdi，通过24孔板以及摇瓶筛选最终获得重组酵母工程菌PT55。PT55摇瓶培养72小时，酶活为65U/ml，相比重组工程菌C12提升了41%。

实施例5、高密度发酵

重组酵母工程菌PT55高密度发酵在5L发酵罐进行，具体过程大致如下：将单菌落重组酵母工程菌PT55接入含有50mL YPG培养基的250mL三角瓶中，30℃，200 rpm振荡过夜培养。再将过夜培养的重组酵母工程菌PT55按1 %（v/v）的接种量接入含有100 mL YPG培养基的500 mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养，至OD 600大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌PT55按10%（v/v）的接种量接入含有2L BSM培养基的5L发酵罐。重组酵母工程菌PT55在5L发酵罐的培养条件为：温度为30℃、pH值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40L/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到一定的量（180g/L左右），停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后（溶氧迅速上升）开始用甲醇诱导。甲醇的添加量根据溶氧进行调整。培养过程中，每24小时取样测定菌体湿重、酶活和总蛋白浓度。

由图1可知，随着发酵时间的增加，壳聚糖酶活性也逐渐增加，当诱导培养至192小时，发酵酶活达到3682 U/mL，总蛋白浓度为3.91 g/L，细胞湿重则为495g/L。

实施例6、突变体CsnT纯化

突变体CsnT纯化过程大致如下：

（1）将5L发酵罐的发酵液10000rpm离心5分钟取上清进行纯化回收；

（2）用10kDa超滤管将上清酶液进行超滤浓缩；

（3）用上海生工生物工程有限公司的Ni-IDA蛋白纯化试剂盒进行纯化。

纯化后的重组CsnT的酶比活为985U/mg。纯化后的SDS-PAGE蛋白电泳结果如图2所示，由图2A可知，重组突变体CsnT呈现两条带，大小分别是35kDa和30kDa。通过美国NEB公司去糖基化酶Endo-Hf处理后，重组突变体CsnT只剩下30kDa的条带（如图2B所示），说明重组CsnT在毕赤酵母表达的时存在糖基化修饰。

实施例7、突变体CsnT温度特性

在pH6.0条件下测定突变体CsnT在40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃和70℃的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100%，计算其他温度下的相对酶活；在55℃，60℃以及65℃条件下水浴热处理30分钟后测定剩余酶活，以没有做热处理样品的酶活为100%，计算其他温度下的相对剩余酶活，整个实验过程以重组壳聚糖酶Csnbm作为对照。

实验结果：突变体CsnT的温度特性如图3所示，由图3A可知，重组CsnT和Csnbm最适反应温度分别为55℃和50℃，重组CsnT在高温条件下（55-70℃）的相对酶活要高于Csnbm；热稳定性方面，由图3B可知，突变体CsnT热稳定性得到有效提升，在55-65℃水浴处理30分钟后剩余酶活分别为58%、32%和15%，分别是Csnbm的4.46倍、6.4倍和7.5倍。

实施例8壳聚糖酶突变体CsnT水解产物分析

突变体CsnT水解壳聚糖反应如下：称取1g壳聚糖溶于100ml乙酸乙酸钠缓冲液（pH6.0），加入1000U重组突变体CsnT，50℃，120rpm进行水解反应，选取不同水解时间（10分钟~120分钟）样品进行薄层层析。薄层层析大致如下：取4μL水解反应产物和3μL壳寡糖标准混合物（惠州长龙生物技术有限公司），分别点到硅胶板（Silica gel 60， Merck）上；将点好样的硅胶板放置在扩展缸进行扩展，扩展缓冲液为异丙醇、水和氨水混合物（体积比例为15:1:7.5）；将扩展完的硅胶板从扩展缸取出吹干后喷显示剂（显示剂为茴香醛、乙醇、硫酸和乙酸混合物，体积比为5:90:5:1）；吹干后将硅胶板放置在100℃条件下进行高温显色。

由图4可知，当水解时间在10分钟至40分钟范围内，水解产物主要由壳二糖、壳三糖、壳四糖和壳五糖构成；当水解时间为50分钟和60分钟时，水解产物主要由壳二糖、壳三糖和壳四糖构成；当水解时间为120分钟时，水解产物则主要为壳二糖和壳三糖。壳寡糖在医药、农业、食品等行业具有很好的应用效果。本发明中重组突变体CsnT水解壳聚糖根据反应条件可以制备不同分子量的壳寡糖，表明重组突变体CsnT在壳寡糖的酶解制备领域具有很大的应用潜力。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 深圳润康生态环境股份有限公司

<120> 一种壳聚糖酶突变体CsnT及其应用

<130> 2021.6.28

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> 壳聚糖酶突变体CsnT的氨基酸序列(Amino acid sequence of chitosanasemutant CsnT)

<400> 1

Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ser

1 5 10 15

Ile Cys Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu Pro

20 25 30

Leu Gly Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr

35 40 45

Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys Ala Val

50 55 60

Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala

65 70 75 80

Glu Glu Glu Ser Asp Asp Ile Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala Ser Val

85 90 95

Trp Arg Ser Leu Gly Asn Asp Lys Asp Phe Arg Ala Ala Gln Asp Lys

100 105 110

Val Asn Asp Arg Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Arg Ser Glu Asn

115 120 125

Ala Gly Leu Lys Cys Ala Leu Ala Lys Ala Val Met Tyr Asp Thr Val

130 135 140

Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala Leu Ile

145 150 155 160

Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly Ile Glu

165 170 175

Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu

180 185 190

Met Asn Pro Ala Asp Pro Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val

195 200 205

Ala Cys Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Ser Asn Asn Cys Asn

210 215 220

Leu Asn Gly Pro Ile Asn Ile His Ser Thr Glu Tyr Gly Asp Phe Val

225 230 235 240

Ile Lys

<210> 2

<211> 729

<212> DNA

<213> 多聚核苷酸序列(Polynucleotide sequence)

<400> 2

gctggtttga acaaggacca aaagagaagg gctgagcagt tgacttccat ctgcgagaac 60

ggtactaccg agatccagta cggttacgtt gaaccacttg gtgacggtag aggttacact 120

tgtggtagag ctggtttcac tactgctact ggtgacgctt tggaggttgt tgaggtttac 180

actaaggccg tgccaaacaa caagctgaag aagtacttgc cagagctgag aagattggcc 240

gaagaagaat ctgacgacat ctccaacttg aagggtttcg cttctgtttg gagatccctg 300

ggtaacgaca aggatttcag agctgctcag gacaaggtta acgacagact gtactaccag 360

ccagccatga agagatctga aaacgccggt ttgaaatgcg ctttggccaa ggctgttatg 420

tacgacactg ttattcaaca cggtgacggt gatgacccag actctttcta cgctctgatc 480

aagaggacca acaagaaagc tggtggttct ccaaaggacg gtatcgaaga aaagaagtgg 540

ctgaacaagt tcctggacgt cagatacgac gacttgatga acccagctga tccagacact 600

agagatgaat ggcgtgaatc cgttgcctgc gttgacgtct tgagatccat tgccaagtcc 660

aacaactgca acctgaacgg tccaatcaac atccactcca ctgaatacgg tgacttcgtc 720

atcaagtaa 729

<210> 3

<211> 729

<212> DNA

<213> 优化后的基因csnbm序列(Optimized gene csnbm sequence)

<400> 3

gctggtttga acaaggacca aaagagaagg gctgagcagt tgacttccat cttcgagaac 60

ggtactaccg agatccagta cggttacgtt gaaccacttg gtgacggtag aggttacact 120

tgtggtagag ctggtttcac tactgctact ggtgacgctt tggaggttgt tgaggtttac 180

actaaggccg tgccaaacaa caagctgaag aagtacttgc cagagctgag aagattggcc 240

gaagaagaat ctgacgacat ctccaacttg aagggtttcg cttctgtttg gagatccctg 300

ggtaacgaca aggatttcag agctgctcag gacaaggtta acgacagact gtactaccag 360

ccagccatga agagatctga aaacgccggt ttgaaaactg ctttggccaa ggctgttatg 420

tacgacactg ttattcaaca cggtgacggt gatgacccag actctttcta cgctctgatc 480

aagaggacca acaagaaagc tggtggttct ccaaaggacg gtatcgaaga aaagaagtgg 540

ctgaacaagt tcctggacgt cagatacgac gacttgatga acccagctga tccagacact 600

agagatgaat ggcgtgaatc cgttgccaga gttgacgtct tgagatccat tgccaagtcc 660

aacaactaca acctgaacgg tccaatcaac atccactcca ctgaatacgg tgacttcgtc 720

atcaagtaa 729

<210> 4

<211> 816

<212> DNA

<213> 抗性G418基因序列信息(Resistant G418 gene sequence information)

<400> 4

atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat 60

gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 120

tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 180

gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 240

cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 300

atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 360

gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 420

tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 480

gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 540

gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 600

cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 660

ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 720

ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 780

ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaa 816

<210> 5

<211> 1554

<212> DNA

<213> PDI编码基因pdi的基因序列信息(PDI coding gene pdi gene sequenceinformation)

<400> 5

atgcaattca actggaatat taaaactgtg gcaagtattt tgtccgctct cacactagca 60

caagcaagtg atcaggaggc tattgctcca gaggactctc atgtcgtcaa attgactgaa 120

gccacttttg agtctttcat caccagtaat cctcacgttt tggcagagtt ttttgcccct 180

tggtgtggtc actgtaagaa gttgggccct gaacttgttt ctgctgccga gatcttaaag 240

gacaatgagc aggttaagat tgctcaaatt gattgtacgg aggagaagga attatgtcaa 300

ggctacgaaa ttaaagggta tcctactttg aaggtgttcc atggtgaggt tgaggtccca 360

agtgactatc aaggtcaaag acagagccaa agcattgtca gctatatgct aaagcagagt 420

ttaccccctg tcagtgaaat caatgcaacc aaagatttag acgacacaat cgccgaggca 480

aaagagcccg tgattgtgca agtactaccg gaagatgcat ccaacttgga atctaacacc 540

acattttacg gagttgccgg tactctcaga gagaaattca cttttgtctc cactaagtct 600

actgattatg ccaaaaaata cactagcgac tcgactcctg cctatttgct tgtcagacct 660

ggcgaggaac ctagtgttta ctctggtgag gagttagatg agactcattt ggtgcactgg 720

attgatattg agtccaaacc tctatttgga gacattgacg gatccacctt caaatcatat 780

gctgaagcta acatcccttt agcctactat ttctatgaga acgaagaaca acgtgctgct 840

gctgccgata ttattaaacc ttttgctaaa gagcaacgtg gcaaaattaa ctttgttggc 900

ttagatgccg ttaaattcgg taagcatgcc aagaacttaa acatggatga agagaaactc 960

cctctatttg tcattcatga tttggtgagc aacaagaagt ttggagttcc tcaagaccaa 1020

gaattgacga acaaagatgt gaccgagctg attgagaaat tcatcgcagg agaggcagaa 1080

ccaattgtga aatcagagcc aattccagaa attcaagaag agaaagtctt caagctagtc 1140

ggaaaggccc acgatgaagt tgtcttcgat gaatctaaag atgttctagt caagtactac 1200

gccccttggt gtggtcactg taagagaatg gctcctgctt atgaggaatt ggctactctt 1260

tacgccaatg atgaggatgc ctcttcaaag gttgtgattg caaaacttga tcacactttg 1320

aacgatgtcg acaacgttga tattcaaggt tatcctactt tgatccttta tccagctggt 1380

gataaatcca atcctcaact gtatgatgga tctcgtgacc tagaatcatt ggctgagttt 1440

gtaaaggaga gaggaaccca caaagtggat gccctagcac tcagaccagt cgaggaagaa 1500

aaggaagctg aagaagaagc tgaaagtgag gcagacgctc acgacgagct ttaa 1554

<210> 6

<211> 4836

<212> DNA

<213> 表达载体pGAPGA-pdi的基因序列信息(Gene sequence information ofexpression vector pGAPGA-pdi)

<400> 6

agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60

atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120

cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180

gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240

aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300

ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360

gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420

ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480

tatttcgaaa cgaggaattc atgcaattca actggaatat taaaactgtg gcaagtattt 540

tgtccgctct cacactagca caagcaagtg atcaggaggc tattgctcca gaggactctc 600

atgtcgtcaa attgactgaa gccacttttg agtctttcat caccagtaat cctcacgttt 660

tggcagagtt ttttgcccct tggtgtggtc actgtaagaa gttgggccct gaacttgttt 720

ctgctgccga gatcttaaag gacaatgagc aggttaagat tgctcaaatt gattgtacgg 780

aggagaagga attatgtcaa ggctacgaaa ttaaagggta tcctactttg aaggtgttcc 840

atggtgaggt tgaggtccca agtgactatc aaggtcaaag acagagccaa agcattgtca 900

gctatatgct aaagcagagt ttaccccctg tcagtgaaat caatgcaacc aaagatttag 960

acgacacaat cgccgaggca aaagagcccg tgattgtgca agtactaccg gaagatgcat 1020

ccaacttgga atctaacacc acattttacg gagttgccgg tactctcaga gagaaattca 1080

cttttgtctc cactaagtct actgattatg ccaaaaaata cactagcgac tcgactcctg 1140

cctatttgct tgtcagacct ggcgaggaac ctagtgttta ctctggtgag gagttagatg 1200

agactcattt ggtgcactgg attgatattg agtccaaacc tctatttgga gacattgacg 1260

gatccacctt caaatcatat gctgaagcta acatcccttt agcctactat ttctatgaga 1320

acgaagaaca acgtgctgct gctgccgata ttattaaacc ttttgctaaa gagcaacgtg 1380

gcaaaattaa ctttgttggc ttagatgccg ttaaattcgg taagcatgcc aagaacttaa 1440

acatggatga agagaaactc cctctatttg tcattcatga tttggtgagc aacaagaagt 1500

ttggagttcc tcaagaccaa gaattgacga acaaagatgt gaccgagctg attgagaaat 1560

tcatcgcagg agaggcagaa ccaattgtga aatcagagcc aattccagaa attcaagaag 1620

agaaagtctt caagctagtc ggaaaggccc acgatgaagt tgtcttcgat gaatctaaag 1680

atgttctagt caagtactac gccccttggt gtggtcactg taagagaatg gctcctgctt 1740

atgaggaatt ggctactctt tacgccaatg atgaggatgc ctcttcaaag gttgtgattg 1800

caaaacttga tcacactttg aacgatgtcg acaacgttga tattcaaggt tatcctactt 1860

tgatccttta tccagctggt gataaatcca atcctcaact gtatgatgga tctcgtgacc 1920

tagaatcatt ggctgagttt gtaaaggaga gaggaaccca caaagtggat gccctagcac 1980

tcagaccagt cgaggaagaa aaggaagctg aagaagaagc tgaaagtgag gcagacgctc 2040

acgacgagct ttaagcggcc gccagcttgg gcccgaacaa aaactcatct cagaagagga 2100

tctgaatagc gccgtcgacc atcatcatca tcatcattga gttttagcct tagacatgac 2160

tgttcctcag ttcaagttgg gcacttacga gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag 2220

aggatgtcag aatgccattt gcctgagaga tgcaggcttc atttttgata cttttttatt 2280

tgtaacctat atagtatagg attttttttg tcattttgtt tcttctcgta cgagcttgct 2340

cctgatcagc ctatctcgca gctgatgaat atcttgtggt aggggtttgg gaaaatcatt 2400

cgagtttgat gtttttcttg gtatttccca ctcctcttca gagtacagaa gattaagtga 2460

gaccttcgtt tgtgcggatc ccccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt 2520

tactcttcca gattttctcg gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca 2580

cagcatacta aattttccct ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag 2640

gtttggaaaa gaaaaaagag accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa 2700

aatttttatc acgtttcttt ttcttgaaat tttttttttt agtttttttc tctttcagtg 2760

acctccattg atatttaagt taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt 2820

ttcttgttct attacaactt tttttacttc ttgttcatta gaaagaaagc atagcaatct 2880

aatctaaggg cggtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg 2940

acaaggtgag gaactaaacc atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc 3000

gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg 3060

ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc 3120

tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact 3180

ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg 3240

catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc 3300

ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga 3360

ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat 3420

cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc 3480

ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg 3540

tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt 3600

gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga 3660

actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg 3720

ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaacacg 3780

tccgacggcg gcccacgggt cccaggcctc ggagatccgt cccccttttc ctttgtcgat 3840

atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc 3900

gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 3960

ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg 4020

tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 4080

ttaatttgca agctggagac caacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 4140

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 4200

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 4260

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 4320

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 4380

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 4440

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 4500

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 4560

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 4620

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 4680

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 4740

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 4800

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcat gagatc 4836

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> F18C-fw

<400> 7

acttccatct gcgagaacgg ta 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> F18C-rev

<400> 8

taccgttctc gcagatggaa gt 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> R210C-fw

<400> 9

tccgttgcct gcgttgacgt c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> R210C-rev

<400> 10

gacgtcaacg caggcaacgg a 21

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> F46C/D52C-fw

<400> 11

ctggttgcac tactgctact ggttgtgctt tg 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> F46C/D52C-rev

<400> 12

caaagcacaa ccagtagcag tagtgcaacc ag 32

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> G51C -fw

<400> 13

actgctactt gcgacgcttt g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> G51C -rev

<400> 14

caaagcgtcg caagtagcag t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> A80C -fw

<400> 15

agaagattgt gcgaagaaga a 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> A80C -rev

<400> 16

ttcttcttcg cacaatcttc t 21

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> D103C/F106C -fw

<400> 17

ctgggtaact gcaaggattg cagagctgct 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> D103C/F106C -rev

<400> 18

agcagctctg caatccttgc agttacccag 30

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> T133C -fw

<400> 19

ggtttgaaat gcgctttggc c 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> T133C -rev

<400> 20

ggccaaagcg catttcaaac c 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Y223C -fw

<400> 21

tccaacaact gcaacctgaa c 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Y223C -rev

<400> 22

gttcaggttg cagttgttgg a 21

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> P171C/E177C -fw

<400> 23

ttcttgcaag gacggtatcg aatgcaagaa gt 32

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> P171C/E177C -rev

<400> 24

acttcttgca ttcgataccg tccttgcaag aa 32

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> A209C -fw

<400> 25

gaatccgttt gcagagttga c 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> A209C -rev

<400> 26

gtcaactctg caaacggatt c 21

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> T234C -fw

<400> 27

atccactcct gcgaatacgg tgac 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> T234C -rev

<400> 28

gtcaccgtat tcgcaggagt ggat 24

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> A129C/L131C -fw

<400> 29

atctgaaaac tgcggttgca aaactgct 28

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> A129C/L131C -rev

<400> 30

agcagttttg caaccgcagt tttcagat 28

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 5’AOX-fw

<400> 31

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 3’AOX-rev

<400> 32

ggcacctggc attctgacat cc 22

Claims (7)

1.一种壳聚糖酶突变体CsnT，其特征在于，所述壳聚糖酶突变体CsnT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的壳聚糖酶突变体CsnT，其特征在于，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体pPICZαA-csnt，其特征在于，包含权利要求2所述的壳聚糖酶突变体CsnT。

4.一种重组菌，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体pPICZαA-csnt。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还包含表达所述壳聚糖酶突变体CsnT的分子伴侣蛋白表达载体pGAPGA-pdi。

6.一种重组酵母工程菌，其特征在于，包含权利要求5所述的重组菌。

7.一种如权利要求1所述的壳聚糖酶突变体CsnT在制备壳寡糖中的应用。

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