CN110029123A - 酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的方法与应用，利用现代分子技术成功优化了编码香菇外切型纤维素酶的基因序列，构建了能够在酵母体外表达外切型纤维素酶的表达载体pPICZαA‑Cel7A，利用该载体和毕赤酵母能够制备外切型纤维素酶，进而为外切型纤维素酶在生产中的应用提供技术支撑。通过本发明方法获得的重组毕赤酵母菌酶产率高，活性高，效果佳。

Description

酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种酵母表达载体构建 及表达外切型纤维素酶的方法与应用。

背景技术

目前，我国农业领域每年产生大量的农作物秸秆，以稻草、玉米秸秆、小 麦秸秆为典型代表。这些秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素等碳水化合物， 是反刍动物的重要饲料来源(赵蒙蒙等，几种农作物秸秆的成分分析，材料导 报，2011(16)：122-125)。

但是，生产中，这些秸秆并没有被广泛的用于畜牧养殖业，大部分被直接 焚烧(曹国良等，中国区域农田秸秆露天焚烧排放量的估算，科学通报，2007 (15)：1826-183)或腐解还田，不仅浪费了资源，还严重污染环境。主要原因 在于，秸秆中的木质纤维素结构复杂，不能被牛羊等反刍动物有效的利用，降 低了其营养价值。

为提高这些秸秆饲料的利用率，以往生产中多采用酸化、碱化等方式处理 油菜秸秆，但其残留的酸碱，会对动物本身造成伤害，而且污染环境(张文杰 等，秸秆处理方法的研究进展，中国畜牧兽医，2011(07)：30-33)。

与上述化学方法相比，利用能够降解纤维素或半纤维素的酶制剂，则绿色、 安全、无污染，且可提高饲料的适口性和利用率。外切型纤维素酶(Exoglucanase) 是纤维素分解酶系统的重要组成部分，通过作用于纤维素链的还原端或非还原 端，水解纤维底物的结晶部分并降低其聚合度(Teeri T.T.Crystalline cellulose degradation:new insightinto the function of cellobiohydrolases,Trends in Biotechnology,1997,15:160-167)。许多研究调查了外切型纤维素酶的特性及与 其他酶在降解纤维底物上的协同作用。结果显示，外切型纤维素酶与内切型纤 维素酶、木聚糖酶协同促进了稻草、麦秸、玉米秸秆等秸秆的水解。反刍动物 的瘤胃中存在大量的细菌、原虫、真菌，能够分泌包括纤维素酶、半纤维素酶、 木聚糖酶在内的各种分解木质纤维素的酶。将外切型纤维酶添加到瘤胃中，势 必会通过与上述这些酶的协同作用促进秸秆饲料的降解。

因此，寻找能够在瘤胃环境下强化秸秆降解的外切型纤维素酶，是目前亟 待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的 方法与应用，利用现代分子技术成功优化了编码香菇外切型纤维素酶的基因序 列，构建了能够在酵母体外表达外切型纤维素酶的表达载体pPICZαA-Cel7A，利 用该载体和毕赤酵母能够制备外切型纤维素酶，进而为外切型纤维素酶在生产 中的应用提供技术支撑。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种酵母表达载体构建方法，其步骤为：

(1)对外切型纤维素酶基因片段进行密码子优化，两端加入EcoR I和Xba I酶切位点并合成新的基因序列如SEQ ID NO.1；

(2)利用限制性内切酶EcoR I和Xba I对基因序列如SEQ ID NO.1的外切 型纤维素酶基因片段进行双酶切，胶回收外切型纤维素酶基因片段；

(3)利用与步骤2中相同的限制性内切酶双酶切表达载体pPICZαA；

(4)将步骤2中胶回收的外切型纤维素酶基因片段与步骤3中切后的 pPICZαA载体连接，通过热击法导入大肠杆菌感受态细胞DH5α构建得到重组表 达载体pPICZαA-Cel7A，再利用质粒提取试剂盒从重组大肠杆菌中提取表达载 体质粒pPICZαA-Cel7A。

优选的：一种酵母表达载体，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO.2所示；

优选的：一种酵母表达载体制备外切型纤维素酶的方法，其步骤为：

(1)提取所述重组表达载体pPICZαA-Cel7A，利用限制性内切酶Sac I对 pPICZαA-Cel7A载体进行线性化，反应体系为：10×QuickCut buffer 5μL，Sac I 1μL，质粒8μL，灭菌水36μL，37℃孵育15min；

(2)将线性化的pPICZαA-Cel7A载体通过电穿孔仪转入酵母菌X33，条件： 电压，2-2.5kv；时间，4-6ms；之后再置于含山梨醇0.5-1mol/L培养基；博来霉 素0.1-1μL/mL的YPD培养基中培养，筛选含外切型纤维素酶基因的重组酵母 菌菌落；

(3)将筛选出含外切型纤维素酶基因的重组酵母菌菌落加入YPD培养基 中到30℃震荡培养至浑浊；将菌液全部进入到BMGY培养基中，30℃震荡培养 过夜；将菌体加入到含1.5-2.0L发酵基础盐培养基的6L发酵罐中，培养20-28 小时，待甘油耗尽，溶氧量大于60％，补加甘油培养基培养，流速为5-15毫升/ 每小时每初始培养液体积，4-12小时停止；2-3小时后开始补加甲醇培养基， 流速为3-10毫升/每小时每初始培养液体积，保证溶氧量不低于20％，持续培养 72-120小时，培养终止后，将培养液离心，上清液过0.45μm滤膜，再经浓缩系 统浓缩和Ni柱亲和层析，获得纯化的外切型纤维素酶。

优选的：一种酵母表达载体制备外切型纤维素酶的方法，

所述BMGY培养基组成为，1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源基 础，4×10-5％生物素，100mM磷酸钠缓冲液，pH 6.0，1％甘油；

所述发酵基础盐培养基组成为，每升含26.7毫升85％磷酸，0.93克硫酸钙， 18.2克硫酸钾，14.9克七水硫酸镁，4.13克氢氧化钾，40克甘油；

所述YPD培养基成分为1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

所述甘油培养基为纯甘油稀释为50％，再加入微量元素盐培养基，使其浓 度为每升甘油含12-13毫升微量元素盐培养基；

所述甲醇培养基为纯甲醇为100％，再加入微量元素盐培养基，使其浓度为 每升甲醇含12-13毫升微量元素盐培养基；

所述微量元素盐培养基组成为，每升含6克五水硫酸铜，0.08克碘化钠，3 克一水硫酸锰，0.2克二水钼酸钠，0.02克硼酸，0.5克氯化钴，20克氯化锌， 65克七水硫酸亚铁，0.2克生物素，5毫升硫酸，加水至1升。

优选的：.一种外切型纤维素酶用于提高农作物秸秆瘤胃利用的应用，每克 秸秆饲料，添加300-500μg的外切型纤维素酶。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，优势在于：利用重组DNA技 术可将体外分离到的或合成的目的基因，通过与载体重组连接，导入不含该基 因的受体细胞，使受体细胞产生目的基因蛋白。基于香菇菌在发酵秸秆过程中 能够有效降解秸秆的木质纤维素，本专利旨在构建一种含外切型纤维素酶基因 的酵母表达载体，以为外切型纤维素酶的商业化生产、秸秆类饲料的反刍动物 利用方面提供理论基础和技术支撑。

本发明成功构建了表达载体pPICZαA-Cel7A，在毕赤酵母菌中表达具有较高 的酶活性，可以用于反刍动物的生产中。此外，本发明生产的外切型纤维素酶 在80℃条件下，还能保持近60％的活性，具有耐高温的特性，可用于饲料的高 温制粒，增加了该酶的利用途径。本发明核心是针对秸秆类饲料在反刍动物生 产中利用率低的现实问题，利用现代分子技术克隆并表达了一种能够有效提高 秸秆瘤胃利用率的外切型纤维素酶，活性高、耐高温，能够作为饲料添加剂进 行商业化生产和应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创 造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1外切型纤维素酶的纯化及SDS-PAGE图；

图2外切型纤维素酶的pH依赖性；

图3外切型纤维素酶的温度依赖性；

图4外切型纤维素酶对农作物秸秆的水解。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造 性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

菌株、载体、试剂的准备：大肠杆菌感受态细胞DH5α购自天根生化科技(北 京)有限公司(CB101-01)；毕赤酵母和表达载体pPICZαA本实验室保存；DNA 胶回收试剂盒(SK8743)、PCR产物纯化试剂盒(SK8741)、质粒小提试剂盒(SK8791)购自生工生物工程股份有限公司，T4-DNA连接酶(2011A)，Premix Taq (Ex Taq Version 2.0)PCR混合液(RR003A)、限制性内切酶EcoR I(1611)、Sac I (1627)、Xba I(1634)、pMD 19-T克隆载体试剂盒(6013)购自大连宝生物工程公 司。

实施例1

外切型纤维素酶基因片段的优化：根据毕赤酵母的密码子偏好性和 pPICZαA载体特点，对NCBI中香菇外切型纤维素酶的基因序列(Lentinula edodes cellulase CEL7A(cel7A)mRNA,complete cds，GenBank:AF411250.1， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF411250.1/)，进行优化，并在片段两端 添加限制性内切酶EcoR I和Xba I位点并合成新的基因序列如SEQ ID NO.1。

重组表达载体pPICZαA-Cel7A的构建：利用EcoR I和Xba I限制性内切酶分 别对基因序列如SEQ ID NO.1的外切型纤维素酶基因片段和表达质粒pPICZαA 进行双酶切，酶切体系为：10×QuickCut buffer 5μL，EcoR I 1μL，Xba I 1μL，质粒 8μL，灭菌水35μL，37℃孵育15min。胶回收外切型纤维素酶基因片段；纯化酶 切的pPICZαA质粒；取外切型纤维素酶目的片段4μl，T4连接酶和缓冲液5μl， 纯化的pPICZαA载体1μl混匀，16℃水浴孵育过夜。转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α，于含Amp的LB培养基中筛选阳性克隆。挑取白色菌落加入到含Amp的 液体LB培养基中，37℃震荡过夜培养，待培养基浑浊后，利用质粒提取试剂盒提取重组表达载体质粒，pPICZαA-Cel7A载体基因序列如SEQ ID NO.2所示

实施例2

转化毕赤酵母：利用限制性内切酶Sac I对重组表达载体pPICZαA-Cel7A进 行酶切线性化，酶切体系为：10×QuickCut buffer 5μL，Sac I 1μL，质粒8μL，灭 菌水36μL，37℃孵育15min。利用PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化； 利用电穿孔仪将线性化的表达载体pPICZαA-Cel7A转入毕赤酵母X33感受态细 胞，于含山梨醇0.5-1mol/L，博来霉素0.1-1μL/mLYPD培养基(1％酵母提取物， 2％蛋白胨，2％葡萄糖)中培养，利用pPICZαA载体引物：α-因子引物： 5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′；

3′AOX1引物：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′通过PCR(94℃1分钟预变 性，98℃10秒钟，55℃15秒钟，68℃1分钟，循环30次，72℃延伸5分钟)， 筛选阳性克隆。挑取1个白色菌落加入到2毫升YPD培养基中，30℃震荡过夜 培养。将全部菌液转入到200毫升BMGY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨， 1.34％酵母氮源基础，4×10-5％生物素，100mM磷酸钾缓冲液pH 6.0，1％甘 油)中，30℃震荡过夜培养，得到菌液。

发酵罐培养：将1.5-2升的发酵基础盐培养基(每升含26.7毫升85％磷酸， 0.93克硫酸钙，18.2克硫酸钾，14.9克七水硫酸镁，4.13克氢氧化钾，40克甘 油)加入到6L发酵罐中，121℃下高压灭菌20分钟，冷却至室温；将4-5毫升 微量元素盐培养基通过0.22微米滤头加入到发酵罐中；调试发酵罐，使其温度 为30℃，pH为5-6；将所述菌液在无菌条件下全部加入到发酵罐中，进行培养； 培养20-28小时至溶氧量大于60％，补加甘油培养基(纯甘油稀释为50％，再加 入微量元素盐培养基，使其浓度为每升甘油含12-13毫升微量元素盐培养基)， 流速为流速为5-15毫升/每小时每初始培养液体积，培养4-12小时停止，2-3小时后开始补加甲醇培养基(甲醇纯度为100％，再加入微量元素盐培养基，使其 浓度为每升甲醇含12-13毫升微量元素盐培养基，微量元素盐培养基每升含6 克五水硫酸铜，0.08克碘化钠，3克一水硫酸锰，0.2克二水钼酸钠，0.02克硼 酸，0.5克氯化钴，20克氯化锌，65克七水硫酸亚铁，0.2克生物素，5毫升硫 酸，加水至1升)，流速为3-10毫升/每小时每初始培养液体积，保证溶氧量不 低于20％，持续培养72-120小时。

将培养的菌液离心，获得培养上清液。通过膜分离系统，对获得的上清液 进行浓缩，并用pH 8.0的Binding Buffer(含0.05M磷酸二氢钠和0.3M氯化钠) 换液，之后通过5毫升镍柱和低压层析系统进行亲和层析，流速为1.0ml/min。 结合在镍柱上的外切型纤维素酶首先用pH 8.0的Washing buffer(含0.05M咪 唑，0.05M磷酸二氢钠和0.3M氯化钠)冲洗，最后用Elution buffer(含0.25M咪 唑，0.05M磷酸二氢钠和0.3M氯化钠)冲洗收集，获得纯化的外切型纤维素 酶纯化液。

利用SDS-PAGE技术对纯化液进行外切型纤维素酶的分子量和纯度测定(图 1)。结果显示，本发明重组的外切型纤维素酶表达成功。

实施例3

外切型纤维素酶的特性鉴定：将实施例2制得的外切型纤维素酶5-10微克， 1％微晶纤维素，100mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0-7.0)的反应体系置于40℃的水 浴中，震荡培养1h，测定还原糖浓度，确定外切型纤维素酶对pH的依赖性。 结果显示，外切型纤维素酶在pH5.0条件下的活性最强(图2)。同理，将反应 体系置于pH 5.0的缓冲液中，20-80℃下震荡培养1h，测定还原糖浓度，确定 外切型纤维素酶对温度的依赖性。结果显示，本发明中外切型纤维素酶的最适 温度为60℃(图3)。

实施例4

外切型纤维素酶对农作物秸秆的水解：称取20mg稻草、麦秸和玉米秸分 别放入9个离心管中(每种秸秆3个重复)，加入2ml含重组外切型纤维素酶 (来自实施例2)的0.1M的柠檬酸缓冲液，60℃下震荡培养24h，测定还原糖 浓度。对照组不加外切型纤维素酶，其他条件与处理组相同。结果显示，与对 照组相比，外切型纤维素酶使稻草、麦秸、玉米秸水解产生的还原糖浓度提高 5.7％、23.1％和24.0％(图4)。表明本发明中的外切型纤维素酶能够显著促进 稻草、麦秸、玉米秸等三种农作物秸秆的水解。

实施例5

外切型纤维素酶对农作物秸秆瘤胃降解的影响：取18只120ml血清瓶，其 中6只加入0.5g稻草、6只加入0.5g麦秸、6只加入0.5g玉米秸。对于每种秸 秆，取3只加入100-300μg外切型纤维素酶(来自实施例2)，剩余3只不加外 切型纤维素酶作为对照。向每只瓶子加入60ml的混合瘤胃液(取自3头装有瘤 胃瘘管的肉牛，取出的瘤胃液与缓冲液按照1:2比例混合)，39℃下震荡培养 48h，分析秸秆的纤维降解率，发酵液中的VFA、微生物蛋白合成量。结果显示， 添加本发明中的外切型纤维素酶，促进了3种秸秆中性洗涤纤维的降解率，增 加了总挥发性脂肪酸的产生量，乙酸的摩尔比例以及微生物蛋白的合成量。以 上结果说明，本发明中的外切型纤维素酶能够用于农作物秸秆的瘤胃降解。具 体如下表

外切型纤维素酶对农作物秸秆瘤胃降解的影响

注:星号代表外切型纤维素酶组与对照组在统计上差异显著(P≤0.05)；SEM： 均值标准误。

本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在 其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要 符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 江西农业大学

<120> 酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1508

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattccaac aagctggtac ttctactgct gaaactcatc cacctttgac ttgggagcaa 60

tgtacttctg gtggttcttg tactactcaa tcttcttctg ttgttttgga ttctaactgg 120

agatggactc acgttgttgg tggttacact aattgttata ctggtaacga atggaatact 180

actgtttgtc cagatggtac tacttgtgct gctaactgtg ctttggatgg tgctgattac 240

gagggtactt atggtatttc tacttctggt aacgctttga ctttgaagtt tgttactgct 300

tctgctcaaa ctaatgttgg ttccagagtt tacttgatgg ctccaggttc tgaaactgag 360

tatcaaatgt tcaacccttt gaaccaagag tttactttcg atgttgatgt ttctgctttg 420

ccttgtggtt tgaacggtgc tttgtacttc tctgaaatgg atgctgatgg tggtttgtct 480

gagtatccaa ctaataaggc tggtgctaaa tacggtactg gttattgtga ttctcaatgt 540

cctagagata tcaagttcat tgagggtaaa gctaacgttg agggttggac tccatcttct 600

acttctccta atgctggtac tggtggtact ggtatttgtt gtaacgaaat ggatatttgg 660

gaggctaatt ctatttctga agctttgact ccacatcctt gtactgctca aggtggtact 720

gcttgtactg gagattcttg ttcttctcca aactctactg ctggtatttg tgatcaagct 780

ggttgtgatt tcaactcttt cagaatggga gatacttctt tttacggtcc tggtttgact 840

gttgatacta cttctaagat cactgttgtt actcaattca ttacttctga taacactact 900

actggagatt tgactgctat tagaagaatc tacgttcaaa acggtcaagt tattcaaaac 960

tctatgtcta acattgctgg tgttactcca actaacgaaa tcactactga tttctgtgat 1020

caacaaaaga ctgcttttgg agatactaat actttctctg agaaaggtgg tttgactggt 1080

atgggtgctg ctttttccag aggaatggtt ttggttttgt ctatttggga tgatgatgct 1140

gctgaaatgt tgtggttgga ttctacttac ccagttggta aaactggtcc tggtgctgct 1200

agaggtactt gtgctactac ttctggtcaa ccagatcaag ttgagactca atctcctaac 1260

gctcaagttg ttttctctaa catcaagttc ggtgctattg gttctacttt ttcttctact 1320

ggaaccggta ctggaacagg tactggaact ggaactggta ctggtactac tacttcttct 1380

gctccagctg ctactcaaac taaatatggt caatgtggtg gtcaaggttg gactggtgct 1440

actgtttgtg cttctggttc tacttgtact tcttctggtc cttactattc tcaatgtttg 1500

tttctaga 1508

<210> 2

<211> 5032

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 960

tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga 1020

agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga 1080

tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa 1140

tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta tctctcgaga aaagagaggc 1200

tgaagctgaa ttccaacaag ctggtacttc tactgctgaa actcatccac ctttgacttg 1260

ggagcaatgt acttctggtg gttcttgtac tactcaatct tcttctgttg ttttggattc 1320

taactggaga tggactcacg ttgttggtgg ttacactaat tgttatactg gtaacgaatg 1380

gaatactact gtttgtccag atggtactac ttgtgctgct aactgtgctt tggatggtgc 1440

tgattacgag ggtacttatg gtatttctac ttctggtaac gctttgactt tgaagtttgt 1500

tactgcttct gctcaaacta atgttggttc cagagtttac ttgatggctc caggttctga 1560

aactgagtat caaatgttca accctttgaa ccaagagttt actttcgatg ttgatgtttc 1620

tgctttgcct tgtggtttga acggtgcttt gtacttctct gaaatggatg ctgatggtgg 1680

tttgtctgag tatccaacta ataaggctgg tgctaaatac ggtactggtt attgtgattc 1740

tcaatgtcct agagatatca agttcattga gggtaaagct aacgttgagg gttggactcc 1800

atcttctact tctcctaatg ctggtactgg tggtactggt atttgttgta acgaaatgga 1860

tatttgggag gctaattcta tttctgaagc tttgactcca catccttgta ctgctcaagg 1920

tggtactgct tgtactggag attcttgttc ttctccaaac tctactgctg gtatttgtga 1980

tcaagctggt tgtgatttca actctttcag aatgggagat acttcttttt acggtcctgg 2040

tttgactgtt gatactactt ctaagatcac tgttgttact caattcatta cttctgataa 2100

cactactact ggagatttga ctgctattag aagaatctac gttcaaaacg gtcaagttat 2160

tcaaaactct atgtctaaca ttgctggtgt tactccaact aacgaaatca ctactgattt 2220

ctgtgatcaa caaaagactg cttttggaga tactaatact ttctctgaga aaggtggttt 2280

gactggtatg ggtgctgctt tttccagagg aatggttttg gttttgtcta tttgggatga 2340

tgatgctgct gaaatgttgt ggttggattc tacttaccca gttggtaaaa ctggtcctgg 2400

tgctgctaga ggtacttgtg ctactacttc tggtcaacca gatcaagttg agactcaatc 2460

tcctaacgct caagttgttt tctctaacat caagttcggt gctattggtt ctactttttc 2520

ttctactgga accggtactg gaacaggtac tggaactgga actggtactg gtactactac 2580

ttcttctgct ccagctgcta ctcaaactaa atatggtcaa tgtggtggtc aaggttggac 2640

tggtgctact gtttgtgctt ctggttctac ttgtacttct tctggtcctt actattctca 2700

atgtttgttt ctagaacaaa aactcatctc agaagaggat ctgaatagcg ccgtcgacca 2760

tcatcatcat catcattgag tttgtagcct tagacatgac tgttcctcag ttcaagttgg 2820

gcacttacga gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag aggatgtcag aatgccattt 2880

gcctgagaga tgcaggcttc atttttgata cttttttatt tgtaacctat atagtatagg 2940

attttttttg tcattttgtt tcttctcgta cgagcttgct cctgatcagc ctatctcgca 3000

gctgatgaat atcttgtggt aggggtttgg gaaaatcatt cgagtttgat gtttttcttg 3060

gtatttccca ctcctcttca gagtacagaa gattaagtga gaccttcgtt tgtgcggatc 3120

ccccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg 3180

gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aattttccct 3240

ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag 3300

accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt 3360

ttcttgaaat tttttttttt agtttttttc tctttcagtg acctccattg atatttaagt 3420

taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt 3480

tttttacttc ttgttcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaaggg gcggtgttga 3540

caattaatca tcggcatagt atatcggcat agtataatac gacaaggtga ggaactaaac 3600

catggccaag ttgaccagtg ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt 3660

cgagttctgg accgaccggc tcgggttctc ccgggacttc gtggaggacg acttcgccgg 3720

tgtggtccgg gacgacgtga ccctgttcat cagcgcggtc caggaccagg tggtgccgga 3780

caacaccctg gcctgggtgt gggtgcgcgg cctggacgag ctgtacgccg agtggtcgga 3840

ggtcgtgtcc acgaacttcc gggacgcctc cgggccggcc atgaccgaga tcggcgagca 3900

gccgtggggg cgggagttcg ccctgcgcga cccggccggc aactgcgtgc acttcgtggc 3960

cgaggagcag gactgacacg tccgacggcg gcccacgggt cccaggcctc ggagatccgt 4020

cccccttttc ctttgtcgat atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc 4080

cccccacatc cgctctaacc gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta 4140

tttatttttt tatagttatg ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt 4200

tttttctgta cagacgcgtg tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg 4260

ttttgggacg ctcgaaggct ttaatttgca agctggagac caacatgtga gcaaaaggcc 4320

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 4380

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 4440

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 4500

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat 4560

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 4620

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 4680

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 4740

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 4800

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 4860

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 4920

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 4980

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga tc 5032

Claims (5)

1.一种酵母表达载体构建方法，其特征在于，其步骤为：

(1)对外切型纤维素酶基因片段进行密码子优化，两端加入EcoR I和Xba I酶切位点并合成新的基因序列如SEQ ID NO.1；

(2)利用限制性内切酶EcoR I和Xba I对基因序列如SEQ ID NO.1的外切型纤维素酶基因片段进行双酶切，胶回收外切型纤维素酶基因片段；

(3)利用与步骤2中相同的限制性内切酶双酶切表达载体pPICZαA；

(4)将步骤2中胶回收的外切型纤维素酶基因片段与步骤3中切后的pPICZαA载体连接，通过热击法导入大肠杆菌感受态细胞DH5α构建得到重组表达载体pPICZαA-Cel7A，再利用质粒提取试剂盒从重组大肠杆菌中提取表达载体质粒pPICZαA-Cel7A。

2.如权利要求1所述的构建方法构建的一种酵母表达载体，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求2所述的酵母表达载体制备外切型纤维素酶的方法，其特征在于，其步骤为：

(1)提取所述重组表达载体pPICZαA-Cel7A，利用限制性内切酶Sac I对pPICZαA-Cel7A载体进行线性化，反应体系为：10×QuickCut buffer 5μL，Sac I1μL，质粒8μL，灭菌水36μL，37℃孵育15min；

(2)将线性化的pPICZαA-Cel7A载体通过电穿孔仪转入酵母菌X33，条件：电压，2-2.5kv；时间，4-6ms；之后再置于含山梨醇0.5-1mol/L，博来霉素0.1-1μL/mL的YPD培养基中培养，筛选含外切型纤维素酶基因的重组酵母菌菌落；

(3)将筛选出含外切型纤维素酶基因的重组酵母菌菌落加入YPD培养基中到30℃震荡培养至浑浊；将菌液全部进入到BMGY培养基中，30℃震荡培养过夜；将菌体加入到含1.5-2.0L发酵基础盐培养基的6L发酵罐中，培养20-28小时，待甘油耗尽，溶氧量大于60％，补加甘油培养基培养，流速为5-15毫升/每小时每初始培养液体积，4-12小时停止；2-3小时后开始补加甲醇培养基，流速为3-10毫升/每小时每初始培养液体积，保证溶氧量不低于20％，持续培养72-120小时，培养终止后，将培养液离心，上清液过0.45μm滤膜，再经浓缩系统浓缩和Ni柱亲和层析，获得纯化的外切型纤维素酶。

4.一种如权利要求3所述的酵母表达载体制备外切型纤维素酶的方法，其特征在于：

所述BMGY培养基组成为，1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源基础，4×10-5％生物素，100mM磷酸钠缓冲液，pH 6.0，1％甘油；

所述发酵基础盐培养基组成为，每升含26.7毫升85％磷酸，0.93克硫酸钙，18.2克硫酸钾，14.9克七水硫酸镁，4.13克氢氧化钾，40克甘油；

所述YPD培养基成分为1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

所述甘油培养基为纯甘油稀释为50％，再加入微量元素盐培养基，使其浓度为每升甘油含12-13毫升微量元素盐培养基；

所述甲醇培养基为甲醇纯度为100％，再加入微量元素盐培养基，使其浓度为每升甲醇含12-13毫升微量元素盐培养基；

所述微量元素盐培养基组成为，每升含6克五水硫酸铜，0.08克碘化钠，3克一水硫酸锰，0.2克二水钼酸钠，0.02克硼酸，0.5克氯化钴，20克氯化锌，65克七水硫酸亚铁，0.2克生物素，5毫升硫酸，加水至1升。

5.一种如权利要求3或4所述的方法制备的外切型纤维素酶用于提高农作物秸秆瘤胃利用的应用，其特征在于：每克秸秆饲料，添加300-500μg的外切型纤维素酶。