CN102634558B - 一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的方法，该方法首先通过基因重组技术将木聚糖降解酶带上一个在高温下结合力强的高效稳定的亲和标签后进行共表达，并与固定化载体材料特异结合制备基因工程共固定化木聚糖降解酶，然后用共固定化木聚糖降解酶水解木聚糖溶液或农林废弃物的汽瀑液，即可得到低聚木糖和木糖。该法实现了多酶制备的一步法生产，多酶纯化与固定化同步，产物的分离回收和酶重复使用相偶联，提高酶对温度和pH的稳定性；达到了系列木聚糖降解酶之间的协同作用，催化效率高，反应副产物少， 产量和纯度高，且所用载体是一种惰性、廉价、易于获得的多聚糖，生物相容性好，特别适用于食品和医药等领域。

Description

一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的方法

技术领域

本发明涉及一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的方法，具体涉及以制备的基因工程共固定化木聚糖降解酶为催化剂，然后将其作用于木聚糖溶液进行酶解反应制备制备低聚木糖和木糖。

背景技术

低聚木糖又称木寡糖，由2～7个木糖以β-1，4-糖苷键连接而成，以木二糖，木三糖为主。各项研究表明，低聚木糖，尤其是木二糖，具有显著的双歧杆菌增殖能力，不被消化性，无龋齿性以及促进人体对钙的吸收等特性，因此，低聚木糖作为一种新型功能性低聚糖成为食品工业研究开发的热点之一。木糖作为食品添加剂主要用于糖尿病患者的甜味剂，在工业上是印染和制革业中的助剂。而随着木糖醇作为糖尿病患者治疗剂的广泛应用，以及木糖醇作为甜味剂用作防龋齿口香糖、糖果、饮料等的开发，作为木糖醇生产原料木糖的酶法制备技术，也倍受人们广泛关注。木聚糖类半纤维素在自然界存在多样性，包括了葡萄糖醛酸木聚糖(硬木)、阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖(软木、禾本科植物：秸秆)以及阿拉伯木聚糖(小麦)等，分别存在于不同的植物中。秸杆半纤维素属阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖，是一条以β-1，4糖苷键相联的木聚糖主链，平均每6个木糖单元就带有一个1，2-4-O-甲基葡萄糖醛酸侧枝，每8～9个木糖单元带一个1，3-α-L-阿拉伯呋喃糖侧枝，因此，酶法水解秸杆木聚糖制备低聚木糖和木糖需要系列木聚糖降解酶：β-1.4内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-D-葡萄糖醛酸酶，有的木糖苷酶同时也是阿拉伯糖苷酶即双功能酶。发明人的以前专利(ZL200410044977.X.；ZL200510038237.X；CN1884569A)中，利用系列木聚糖降解酶(葡萄糖醛酸酶、阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶)的联合作用木聚糖不仅加速木聚糖产生木寡糖的反应速度，而且使酶解产物中带有葡萄糖醛酸或阿拉伯糖侧枝的大片段得到进一步水解，提高了产物的产量和纯度。因此，高效酶促转化秸秆木聚糖制备低聚木糖和木糖需要大量生产2至4种游离酶。这势必带来能源消耗和成本的大大增加。如多个酶的大量制备、纯化和固定化是需要多步完成，多步操作又会造成酶的损失；同时，产物与酶分离回收困难，酶利用效率低。因此，找到一种多酶制备简单又成本低且可反复回收利用的低聚木糖和木糖高效制备的途径非常有意义。

目前重要的亲和标签肽有聚组氨酸和谷胱甘肽-S转移酶，已广泛用于实验室规模的纯化，但由于其所用载体材料，如琼脂糖，聚丙烯酰胺和玻璃珠需要高成本的化学修饰，因而至今未得到工业应用，而纤维素结合域作为一个更具应用价值的亲和多肽，却因其分子量过大，与目的蛋白融合后影响所固定蛋白的生物学活性存在不足。几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，ChBD)因其氨基酸数量少，对目的蛋白活性的干扰也相应减小，而且几丁质是世界上第二大类多糖，来源广泛、价格低廉、理化性质稳定、无毒和易于制成适宜形状，具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此，几丁质结合结构域更适合用于生物亲和固定化技术。但是，现在使用的ChBD标签为来源于常温菌环状芽孢杆菌(Bacilluscirculus)，其在高温条件下与几丁质基质的结合力较弱，限制了其在高温酶固定化的应用。因此，找到一种在高温下能与几丁质基质的结合力强、同时又不影响蛋白质功能的的高效稳定的亲和标签是解决高温酶固定化应用的关键。

发明内容

本发明的原理是，通过基因重组技术将木聚糖降解酶带上一个在高温下结合力强的高效稳定的亲和标签后进行共表达，然后与固定化载体材料特异结合从而构建一个基因工程共固定化木聚糖降解酶用于秸秆木聚糖底物制备低聚木糖和木糖。

本发明目的之一是通过基因重组技术将木聚糖降解酶带上一个在高温下结合力强的高效稳定的亲和标签后进行表达，然后与固定化载体材料特异结合制备一个基因工程共固定化木聚糖降解酶，以期达到简化多酶制备为一步生产，且酶纯化与固定化同步，产物的分离回收和酶连续再使用相偶联的高效和低成本制备技术。该法获得的共固定化酶，其载体与酶结合力强、特异性好和稳定性高，可以多次回收利用，既减少环境污染又提高生物质的利用率，具有广阔的工业应用前景。

本发明目的之二是提供一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶作为催化剂，在温和的反应条件下制备低聚木糖和木糖的方法，通过对基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的工艺条件的优化，达到系列木聚糖降解酶之间的协同作用，催化效率高，反应副产物少，产量和纯度高的生产工艺。

本发明的技术方案：利用基因工程技术将木聚糖降解酶带上在高温下结合力强的高效稳定的亲和标签后进行表达，通过亲和标签与几丁质类载体的非可逆性结合制备基因工程共固定化木聚糖降解酶，然后将其作用于木聚糖溶液或农林废弃物汽瀑液进行酶解反应制备低聚木糖和木糖。

本发明的用基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的方法，按照如下步骤进行：

(1)构建带有高效稳定亲和标签的木聚糖降解酶的表达质粒

根据SEQ ID NO.13序列所示标签DNA序列设计引物，所得的上游和下游引物各含有标签结构一半基因序列，以表达质粒为模板进行反向PCR扩增，得到含有标签序列的DNA扩增产物，通过反向磷酸化、连接、转化，得到带有标签结构的重组质粒；然后克隆出木聚糖降解酶基因，经酶切后分别插至带有标签结构的重组质粒，与亲和标签结构基因进行融合，获得一系列带有木聚糖降解酶和亲和标签结构基因的重组质粒，即带有木聚糖酶和亲和标签结构基因的重组质粒、带有葡萄糖醛酸酶和亲和标签结构基因的重组质粒和带有阿拉伯/木糖苷酶和亲和标签结构基因的重组质粒。为了降低成本简化操作步骤，进一步将这些带有亲和标签的木聚糖降解酶基因插在同一个表达载体上进行串联共表达，构建带有亲和标签木聚糖降解酶、葡萄糖醛酸酶以及阿拉伯/木糖苷酶的重组质粒。

(2)重组菌的培养与粗酶制备：将上述带有亲和标签的木聚糖降解酶的表达质粒转化宿主，在LB培养基中25～37℃温度培养12-24h，然后将菌液在0-10℃、转速4000-6000rpm条件下离心，用水洗涤沉淀物3次，在用0.02-0.5MpH6.0-8.0的缓冲液重悬，置冰水浴中超声破碎或用高压破碎，破碎后的菌液在0-4℃、10000-13000rpm条件下离心10-30min，取上清，即得带有亲和标签的木聚糖降解酶的粗酶液。

(3)共固定化木聚糖降解酶的制备：

将固定化载体几丁质先进行溶胀或酸解处理，将几丁质与粗酶按照重量比为1∶0.01-0.2溶于缓冲液中，常温或低温下混合搅拌1h以上，离心去上清，再用缓冲液洗涤至无蛋白检出，获得共固定在几丁质上的木聚糖降解酶，包括共固定化木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶，共固定化木聚糖酶和阿拉伯/木糖苷酶以及共固定化木聚糖酶、葡萄糖醛酸酶和阿拉伯/木糖苷酶。

(4)基因工程共固定化木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶作为催化剂的转化反应：

用pH 4-7的缓冲液配制浓度为3-20％(g/mL)木聚糖溶液或农林废弃物汽瀑液，加入50-220(U/g木聚糖)的基因工程共固定化木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶，60-80℃下保温2-6小时，并回收共固定化木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶。

(5)基因工程共固定化木聚糖酶和阿拉伯/木糖苷酶作为催化剂的转化反应：用缓冲液配制3-20％(g/mL)木聚糖溶液或农林废弃物汽瀑液，加入50-220(U/g木聚糖)的基因工程共固定化木聚糖酶和阿拉伯/木糖苷酶，60-80℃下保温2-6小时，并过滤回收共固定化木聚糖酶和阿拉伯/木糖苷酶。

(6)最后向上述酶解液中加入3-5倍体积乙醇，然后取上清液进一步浓缩结晶得到低聚木糖和木糖产品。

上述方法中所述的木聚糖降解酶在本发明中是指包括β-1.4内切木聚糖酶、阿拉伯/木糖苷酶和α-D-葡萄糖醛酸酶在内的两种及两种酶类以上。

以上所述的基因工程共固定化木聚糖降解酶，由载体和带有亲和标签结构的木聚糖酶、阿拉伯\木糖苷和葡萄糖醛酸酶的两种及两种酶类以上组成，其中高效稳定的亲和标签结构为EWASNTYYKIGDLVTYNGITYKCIQAHTSLVGWEPPNVPALWQLQ(SEQ ID NO.14)，载体为几丁质类载体，可以是几丁质、几丁质珠或其他壳质类产品等载体之一。

所述的如SEQ ID NO.14的高效稳定的亲和标签结构为来源于嗜热菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571的几丁质水解酶。

本发明优点和有益效果：(1)本发明简化多酶制备为一步生产，使酶的固定和纯化同步，生产过程大大简化；(2)本发明固定化酶的活力回收率高达90％以上；(3)本发明固定化酶载体与酶的结合牢固，连续使用稳定性好；(4)本发明利用了几丁质结合结构域与几丁质特异性结合的特点，固定化和纯化的效果好；(5)本发明所用载体价格低廉，节约了生产成本，并减少了环境污染。

附图说明

图1本发明固定化酶结构示意图。

图2本发明获得纯化固定化葡萄糖醛酸酶的SDS-PAGE电泳图谱.

1-载体未吸附蛋白，2-纯化固定化葡萄糖醛酸酶，3-粗酶液，M-蛋白质标样。

图3用于低聚木糖制备的固定化木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶的循环使用率。

图4共固定化木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶制备低聚木糖的TLC图谱.

M1，M2：木糖标样；1-8：循环使用1-8次酶解液。

图5纯化固定化阿拉伯/木糖苷酶的SDS-PAGE电泳图谱，1-粗酶液，2-载体未吸附蛋白，3-纯化固定化阿拉伯/木糖苷酶。

图6纯化固定化阿拉伯/木糖苷酶的热稳定性.，(◆)，固定化阿拉伯/木糖苷酶，(■)游离阿拉伯/木糖苷酶。

图7用于木糖制备的固定化阿拉伯/木糖苷酶的循环使用率.

图8共固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶的热稳定性，(◆)对照；(■)未固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶1，(▲)未固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶2；(●)固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶1；固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶2。

图9共固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶的循环使用率。(◆)对照；(■)未固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶1，(▲)未固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶2；(●)固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶1；固定化木聚糖酶-阿拉伯/木糖苷酶2。

图10共固定化木聚糖酶和和阿拉伯/木糖苷酶制备木糖的TLC图谱.

M：木寡糖标样；0：对照；1-10：水解5min，10min，20min，30mi，40min，60min，80min，1.5h，2h，3h，4h的酶解液。

具体实施方式

实施例1：

(1)重组表达载体pET-20b-ChBD的构建：引物1：

5’-GCATCCAGGCACATACCAGCCTGGTGGGTTGGGAACCGCCGAACGTG

CCG GCACTGTGGCAGCTGCAGTGAGATCCGGCTGCTAAC-3’(SEQ IDNO.1)；

引物2：

5’-ATTTGTAGGTGATACCGTTGTAGGTCACCAGATCACCGATTTTGTAGT

AG GTGTTGCTTGCCCATTCCTCGAGTGCGGCCGCAA 3’(SEQ ID NO.2)；

以质粒pET-20b(Novagen公司)为模板，用上述引物1和引物2(上海生工)为引物反向PCR扩增，在设计引物时引入编码

EWASNTYYKIGDLVTYNGITYKCIQAHTSLVGWEPPNVPALWQLQ片段的全基因。扩增条件：

扩增条件：95℃5min，(94℃40s，55℃40s，72℃3min 40s)30个循环，72℃10min。采用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN公司)回收并纯化PCR产物，用磷酸化酶进行处理，T4 DNA连接酶(TAKARA公司)16℃连接过夜，使基因片段自环化。将连接液转化E.coli DH10B感受态细胞，转化条件参见《分子克隆实验指南》。使用带有氨苄抗性的LB平板37℃培养12h，挑选阳性克隆培养过夜，提取质粒，测序(基天生物公司)获得正确的质粒pET-20b-ChBD。(2)以重组质粒pET-20b-xynB(无锡轻工大学学报，2003，22(3)：57-61.；食品与发酵工业，2003，29(11)：11-15.)为模板，以上游引物5’-CGGTCTAGATGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGA

GATATACATATGGATG TCT CAG AAT GTG TCT CTG AG-3’(SEQ ID NO.3)和下游引物5’-CGG CCATGG TTT TCT TTC TTC TAT CTG TTT CTC-3’(SEQ ID NO.4)作为引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后与质粒pET-20b-ChBD一起用Xba I和Nco I双酶切，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，使基因片段连接。将连接液转化E.coli DH10B感受态细胞，转化条件参见《分子克隆实验指南》。使用带有氨苄抗性的LB平板37℃培养12h，挑选阳性克隆培养过夜，提取质粒，测序(基天生物公司)获得正确的重组质粒pET-20b-xynB-ChBD。

(3)以重组质粒pHsh-aguA(African Journal of Biotechnology，2008，7(14)：2454-2461.)为模板，以上游引物5’-

CGGCCATGGATGTGCTGGCTGGAATACCGT CTG CCG GCT-3’(SEQ IDNO.5)和下游引物5’-CGG GGTACCCGGATATATATATCTTTCTTCCC-3’(SEQID NO.6)为引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后与质粒pET-20b-ChBD一起用Nco I和Kpn I双酶切，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，使基因片段连接。将连接液转化E.coli DH10B感受态细胞，转化条件参见《分子克隆实验指南》。使用带有氨苄抗性的LB平板37℃培养12h，挑选阳性克隆培养过夜，提取质粒，测序(基天生物公司)获得正确的重组质粒pET-20b-aguA-ChBD。

(4)以重组质粒pET-20b-aguA-ChBD为模板，以带有核糖体序列的上游引物5’-CGGTCTAGATGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGA

GATATACATATGTGCTGGCTGGAATACCGTCT-3’(SEQ ID NO.7)和下游引物5’-CGGTCTAGA CTGCAGCTGCCACCAGTGC-3’(SEQ ID NO.8)作为引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后与质粒pET-20b-xynB-ChBD一起用Xba I单酶切，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，使基因片段连接。将连接液转化E.coliDH10B感受态细胞，转化条件参见《分子克隆实验指南》。使用带有氨苄抗性的LB平板37℃培养12h，挑选阳性克隆培养过夜，提取质粒，测序(基天生物公司)获得正确的重组质粒pET-20b-aguA-ChBD-xynB-ChBD。

(5)将上述所构建的重组质粒pET-20b-xynB-ChBD-aguA-ChBD转化E.coliJM109(DE3)，在LB培养基37℃下生长至OD＝0.6-0.8时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导培养8-12h，在4℃、4000rpm下离心去上清，沉淀用水洗涤3次，用三倍体积的pH6.20.05M邻苯咪唑缓冲液重悬，用高压破碎的方法破碎细胞(压力为1250psi，1psi＝6.897kPa，重复3次)，高压破碎后的菌液在4℃、12000rpm条件下离心20min，取上清液，65℃温度条件下热处理10min，冰浴后在4℃、12000rpm条件下离心20min，取上清，即为热处理的粗酶液。

(6)固定化酶的制备：

胶状几丁质的制备：取几丁质(Sigma)与85％磷酸按照1∶50(g/mL，w/v)混合，4℃搅拌处理24h，然后倒入10倍体积的去离子水中，5000rpm离心10min，沉淀用去离子水清洗至pH 5.0，然后用6N的NaOH中和，5000rpm离心10min，用6倍体积的去离子水清洗除盐，沉淀用去离子水重悬，终浓度为1％，得到胶状几丁质。

取胶状几丁质载体与步骤(3)所得粗酶按照重量体积比为1∶0.01-0.2(mg/mL)溶于磷酸盐缓冲液中，4℃搅拌过夜，离心去上清，用缓冲液洗涤载体数次，至上清中没有酶活为止，获得共固定在几丁质上的木聚糖降解酶，即为共固定化木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶(见图2)。

(7)酶解木聚糖制备低聚木糖先用20mM pH6.2缓冲液配制3％(g/mL)木聚糖悬液，以酶用量分别为50U/g和10U/g加人基因工程共固定化木聚糖酶和葡萄糖醛酸酶，80℃下保温2-4小时，离心分离固定化酶和上清中的反应产物。通过DNS法检测反应液中还原糖量，计算酶解效率；然后将固定化酶回收洗净后再用于下一批次的低聚木糖制备，连续重复20次，计算共固定化酶的酶解效率(见图3)。

(8)向上述酶解液中加入3-5倍体积乙醇混匀去除不溶性沉淀，然后将上清液维持在60℃下进行蒸发浓缩即得到低聚木糖产品(见图4)。

实施例2：

与实施例1基本相同，不同之处在于α-葡萄糖醛酸酶是嗜热脂肪芽孢杆菌α-葡萄糖醛酸酶，水解温度是65℃。

实施例3：

与实施例1基本相同，不同之处在于原料预处理方法和酶的使用量，具体操作如下：

(1)称取碎木屑10kg，加水浸泡后，挤干弃水，控制含水量为30％，然后1.5Mpa下高温蒸煮10分钟后突然降压，冷却，离心分离即得汽爆液。

(2)一边搅拌一边将共固定化木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶液加入汽爆液中，酶用量为15U/g，80℃下保温2小时，水解结束后经过滤回收固定化酶用于下一批次的木糖制备，所得滤液加入4倍体积的乙醇并搅拌均匀后，离心取上清，维持75-80℃下进行蒸发浓缩，然后冷却至60℃，喷雾干燥得到低聚木糖产品。

实施例4：

(1)其它与实施例1相同，与实施例1不相同的是，步骤(3)以本实验室已构建的重组质粒pET-20b-Xyl(Biotechnology Letters，2004，26(19)：1511-1515.)为模板，用下面引物3和引物4为引物，构建重组质粒pET-20b-Xyl-ChBD。引物3：

5’-CATGCCATGGAACTGTACAGGGATC-3’(SEQ ID NO.9)；引物4：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTCCTCGCAGGCTTCC-3’(SEQ ID NO.10)；

PCR扩增条件：

扩增条件：95℃5min，(94℃40s，57℃40s，72℃2min 30s)30个循环，72℃10min。纯化后的PCR产物与已构建的质粒pET-20b-ChBD都用Nco I和Not I双酶切，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，使基因片段连接。将连接液转化E.coli DH1OB感受态细胞，转化条件参见《分子克隆实验指南》。使用带有氨苄抗性的LB平板37℃培养12h，挑选阳性克隆培养过夜，提取质粒，测序(基天生物公司)获得正确的重组质粒pET-20b-Xyl-ChBD。

(2)其它与实施例1相同，与实施例1不相同的是，不同的是，在步骤3固定化酶的制备时，采用取胶状几丁质载体与所得粗酶按照重量比为1∶0.15溶于磷酸盐缓冲液中，所制得固定化木糖苷酶的性能参见图5、图6。

(3)其它与实施例1相同，与实施例1不同的是，步骤5以酶用量分别为20U/g和10U/g加人基因工程固定化木聚糖酶和木糖苷酶，连续重复30次共固定化酶的酶解效果(见图7)。

(4)其它与实施例1相同，与实施例1不相同的是，步骤6所得到的蒸发浓缩液为木糖产品(见图8、9)

实施例5：

(1)其它与实施例1步骤(1)相同，与实施例1不相同的是，以带有木聚糖酶和阿拉伯/木糖苷酶的融合基因的重组质粒pET-20b-xar-L-xynA为模板(该表达质粒构建参见文献Enzyme and Microbial Technology，2010，47：194-199)，用上游引物5’-CGG CCATGGATGAAGCCATTATATTTAGATTCC-3’(SEQ IDNO.11)和下游引物5’-CGGGGTACCTTTATTCTCTACCCTTACTTCC-3’(SEQID NO.12)为引物进行PCR扩增。PCR产物经纯化后与质粒pET-20b-ChBD一起用Nco I和Kpn I双酶切，然后16℃下以T4 DNA连接酶过夜连接后转化E.coli DH10B感受态细胞，具体参见《分子克隆实验指南》。使用带有氨苄抗性的LB平板37℃培养12h，挑选阳性克隆培养过夜，提取质粒，测序(基天生物公司)获得带有木聚糖酶和阿拉伯/木糖苷酶和亲和标签结构基因的重组质粒pET-20b-xar-L-xynA-ChBD。

(2)重组菌的培养与粗酶制备：将重组质粒pET-20b-xar-L-xynA-ChBD转化E.coli JM109(DE3)，在LB培养基37℃下生长至OD＝0.6-0.8时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导培养8-12h，在4℃、4000rpm下离心去上清，沉淀用水洗涤3次，用三倍体积的pH6.20.05M邻苯咪唑缓冲液重悬，用高压破碎的方法破碎细胞(压力为1250psi，1psi＝6.897kPa，重复3次)，高压破碎后的菌液在4℃、12000rpm条件下离心20min，取上清液，65℃温度条件下热处理10min，冰浴后在4℃、12000rpm条件下离心20min，取上清，即为热处理的粗酶液。

(3)取商品几丁质小珠经洗涤溶胀后与步骤(2)所得粗酶按照重量比为1∶0.08溶于磷酸盐缓冲液中，常温搅拌过夜，离心去上清，用缓冲液洗涤至上清中无活性蛋白后，获得共固定在几丁质上的木聚糖降解酶，即为共固定化木聚糖酶和阿拉伯/木糖苷酶(见图8)。

(4)用20mM pH6.2缓冲液配制2％(g/mL)木聚糖悬液，以酶用量为50U/g加人基因工程共固定化木聚糖酶和阿拉伯/木糖苷酶，65℃下保温2小时，离心分离回收洗净后再用于下一批次的木糖制备，连续重复30次，计算共固定化酶的酶解效率(见图9)；所得上清液中加入3倍体积的乙醇并搅拌均匀后，离心取上清，维持60℃下进行蒸发浓缩，即得到木糖产品。

实施例6：

与实施例4基本相同，不同之处在于，预处理原料选择的是麦草纤维，并以2％的NaOH溶液从玉米芯中浸提出木聚糖，获得的木糖溶液采用TLC薄层层析检测其中糖的成分见图10。

实施例7：

与实施例5基本相同，不同之处在于，木聚糖酶是来源于海栖热袍菌的木聚糖酶B，水解温度是75℃。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京师范大学

 

<120>  一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的方法

 

<130> 

 

<160>  14   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  86

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gcatccaggc acataccagc ctggtgggtt gggaaccgcc gaacgtgccg gcactgtggc     60

 

agctgcagtg agatccggct gctaac                                          86

 

 

<210>  2

<211>  84

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

atttgtaggt gataccgttg taggtcacca gatcaccgat tttgtagtag gtgttgcttg     60

 

cccattcctc gagtgcggcc gcaa                                            84

 

 

<210>  3

<211>  75

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cggtctagat gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat ggatgtctca     60

 

gaatgtgtct ctgag                                                      75

 

 

<210>  4

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cggccatggt tttctttctt ctatctgttt ctc                                  33

 

 

<210>  5

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cggccatgga tgtgctggct ggaataccgt ctgccggct                            39

 

 

<210>  6

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

cggggtaccc ggatatatat atctttcttc cc                                   32

 

 

<210>  7

<211>  71

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

cggtctagat gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gtgctggctg     60

 

gaataccgtc t                                                          71

 

 

<210>  8

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

cggtctagac tgcagctgcc accagtgc                                        28

 

 

<210>  9

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

catgccatgg aactgtacag ggatc                                           25

 

 

<210>  10

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

ataagaatgc ggccgcctcc tcgcaggctt cc                                   32

 

 

<210>  11

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

cggccatgga tgaagccatt atatttagat tcc                                  33

 

 

<210>  12

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

cggggtacct ttattctcta cccttacttc c                                    31

 

 

<210>  13

<211>  135

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

gaatgggcaa gcaacaccta ctacaaaatc ggtgatctgg tgacctacaa cggtatcacc     60

 

tacaaatgca tccaggcaca taccagcctg gtgggttggg aaccgccgaa cgtgccggca    120

 

ctgtggcagc tgcag                                                     135

 

 

<210>  14

<211>  45

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  14

 

Glu Trp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Lys Ile Gly Asp Leu Val Thr Tyr

1               5                   10                  15     

 

 

Asn Gly Ile Thr Tyr Lys Cys Ile Gln Ala His Thr Ser Leu Val Gly

            20                  25                  30         

 

 

Trp Glu Pro Pro Asn Val Pro Ala Leu Trp Gln Leu Gln

        35                  40                  45 

 

 

Claims (3)

1.一种基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖的方法，其特征是首先制备基因工程共固定化木聚糖降解酶，然后用共固定化木聚糖降解酶水解木聚糖溶液或农林废弃物的汽瀑液，即可得到低聚木糖；所述基因工程共固定化木聚糖降解酶，由载体和带有在高温下结合力强的高效稳定亲和标签结构的β-1.4内切木聚糖酶和α-D-葡萄糖醛酸酶组成，其中该高效稳定亲和标签结构与几丁质类载体特异性地结合，从而使β-1.4内切木聚糖酶和α-D-葡萄糖醛酸酶共固定在载体上；所述的高效稳定亲和标签结构的氨基酸序列为EWASNTYYKIGDLVTYNGITYKCIQAHTSLVGFEPPNVPALWQLQ。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)重组表达载体的构建：

根据标签DNA序列设计上、下游引物，所述的上游和下游引物各含有标签结构一半基因序列，以表达质粒为模板进行反向PCR扩增，得到含有标签序列的DNA扩增产物，通过反向磷酸化、连接、转化，得到带有标签结构的重组质粒；然后克隆出木聚糖降解酶基因,经酶切后分别插至带有标签结构的重组质粒，与亲和标签结构基因进行融合，获得带有木聚糖降解酶和亲和标签结构基因的重组质粒；

(2)重组菌的培养与粗酶制备：

将带有亲和标签的木聚糖降解酶的表达质粒转化宿主，在LB培养基中25～37℃温度培养12-24h，然后将菌液在0-10℃、转速4000-6000rpm条件下离心，用水洗涤沉淀物3次，再用0.02-0.5M pH6.0-8.0的缓冲液重悬，置冰水浴中超声破碎或用高压破碎，破碎后的菌液在0-4℃、10000-13000rpm条件下离心10-30min，取上清，即得带有亲和标签的木聚糖降解酶的粗酶液；

(4)共固定化木聚糖降解酶的制备：

将固定化载体几丁质先进行溶胀或酸解处理，将几丁质与粗酶按照重量比为1﹕0.01-0.2溶于pH 4–9的缓冲液中，常温下混合搅拌1h以上，离心去上清，再用缓冲液洗涤至无蛋白检出，获得共固定在几丁质上的木聚糖降解酶，即为基因工程共固定化木聚糖降解酶。

3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将得带有亲和标签的木聚糖降解酶的粗酶液在60-70℃温度条件下热处理10-20min，以去除大量菌体杂蛋白，获得纯度较高酶液。