CN107641621A - 一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酶工程及生物医药技术领域，尤其涉及一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法。本发明筛选获得了一种能有效降解淫羊藿苷母核结构上鼠李糖残基的α‑L‑鼠李糖苷酶及能高效降解其母核结构中葡萄糖残基耐高温β‑葡萄糖苷酶，随后通过双酶转化高效制备具有完全保持原有生物活性的淫羊藿苷元。本发明提供的组合物中，两种糖苷酶的最适反应温度都较高，底物溶解性较好，不需要助溶剂；并且酶解时间短，得率高。实验表明，采用本发明提供的糖苷酶组合物对淫羊藿苷进行酶解，摩尔转化率为98.3％，淫羊藿苷元的得率为90％。

Description

一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法

技术领域

本发明涉及酶工程及生物医药技术领域，尤其涉及一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法。

背景技术

淫羊藿苷元(Icaritin)为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿中的一种多羟基黄酮类单体成分，具有雌激素样作用、调节免疫、促进心肌细胞再生和分化、促骨质保护、壮阳、抗肝损伤及延缓肝纤维化、抗肿瘤等多种药理活性。目前已经作为一类抗肝癌新药(阿可拉定)进入临床研究。淫羊藿苷元主要从中药淫羊藿中提取获得，但淫羊藿苷元在淫羊藿体内含量极低，分离提取工艺复杂，成本高。未来淫羊藿苷元的国际市场需求很大，因此高效环保地制备淫羊藿苷元的方法将受到广泛的关注。

淫羊藿苷是以淫羊藿苷元为母核，在淫羊藿中的含量很高，可以通过水解糖苷键制备淫羊藿苷元。目前淫羊藿苷元的制备方法主要以淫羊藿苷为原料采用酶法或酸法水解。如用复合纤维素酶或β-葡萄糖苷酶，酶解、酸解相结合，将淫羊藿苷转化为淫羊藿素，但是该酸解反应过程不好控制，副产物多，产品收率低，从而导致产品的成本较高；或通过一种商品化的β-葡萄糖苷酶将淫羊藿苷转化为淫羊藿苷元，虽然该酶能获得淫羊藿苷元，但是其水解时间长(24小时)，最高酶解收率也仅为55％左右，根据酶解效果及酶专一性特性，可知使用的β-葡萄糖苷酶来源于传统微生物发酵，其酶不是纯的β-葡萄糖苷酶；另有研究采用柚苷酶从淫羊藿苷获得淫羊藿苷元，将淫羊藿苷加入到30％～70％乙醇体系中，调节pH(4～8)，体系达到一定温度(40～70℃)，搅拌下控温反应30小时。但是柚苷酶是由微生物发酵制备的复合酶，专一特性主要为特异性水解柚皮苷，其中酶比例不可控、作用的先后顺序不可控，且反应时间长，效率低。可见，淫羊藿苷元的制备方法仍需进一步的改进。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法，本发明提供的糖苷酶组合物能够将淫羊藿苷转化为淫羊藿苷元，酶解时间短，得率高。

本发明提供了一种糖苷酶组合物，由α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成；

所述α-L-鼠李糖苷酶源自Aspergillus terreus CCF 3059、Aspergillus nigerNL-1或Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482；

所述β-葡萄糖苷酶源自Thermotoga thermarum DSM 5069 GH1家族、Thermotogathermarum DSM 5069 GH3家族、Thermotoga petrophila DSM 13995 GH1家族、Thermotogapetrophila DSM 13995 GH3家族或Aspergillus niger NL-1 GH3家族。

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC3.2.1.40)，可以作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α1连接的糖苷键，α-L-鼠李糖苷酶广泛存在于自然界的细菌和真菌中。β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。该酶在自然界中的分布广泛，在植物的种子和微生物中尤为普遍，在动物和真菌体内也发现该酶的存在。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶或β-葡萄糖苷酶，结构不同，催化特性也不尽相同。但它们在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。

本发明中，α-L-鼠李糖苷酶源自Aspergillus terreus CCF 3059，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；该酶的最适反应温度为65℃，温度稳定性较好。

或源自Aspergillus niger NL-1其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

或源自Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

本发明中，β-葡萄糖苷酶源自Thermotoga thermarum DSM 5069 GH1家族，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

或源自Thermotoga thermarum DSM 5069 GH3家族，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；该酶最适反应温度为85℃，催化效率高。

或源自Thermotoga petrophila DSM 13995 GH1家族，其氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示；

或源自Thermotoga petrophila DSM 13995 GH3家族，其氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示；

或源自Aspergillus niger NL-1 GH3家族，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明一些实施例中，所述α-L-鼠李糖苷酶源自Aspergillus terreus CCF3059，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述β-葡萄糖苷酶源自Thermotoga thermarum DSM 5069 GH3家族，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明中，对α-L-鼠李糖苷酶或β-葡萄糖苷酶的获得方式不作限定。本发明实施例中，α-L-鼠李糖苷酶或β-葡萄糖苷酶通过基因工程的方式制得。

本发明中，所述α-L-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷酶的活力比为100:1～600:1。

一些实施例中，所述α-L-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷酶的活力比为500:1。

本发明提供的糖苷酶组合物中，α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶能够分别将淫羊藿苷上的两个糖苷基团水解下来，从而使淫羊藿苷向淫羊藿苷元转变。反应过程如图4。

本发明所述的糖苷酶组合物在转化淫羊藿苷为淫羊藿苷元中的应用。

本发明还提供了一种酶法制备淫羊藿苷元的方法，以本发明所述的糖苷酶组合物对淫羊藿苷进行酶解。

本发明提供的方法中，酶解的缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的浓度为20mM～100mM，pH为5.0～8.0。

一些具体实施例中，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的浓度为100mM，pH为6.5。

本发明所述酶解体系中：

淫羊藿苷的浓度为0.2～1g/L；

α-L-鼠李糖苷酶的浓度为100U/mL～600U/mL；

β-葡萄糖苷酶的浓度为0.2U/mL～1U/mL。

一些具体实施例中，淫羊藿苷的浓度为0.5g/L；

α-L-鼠李糖苷酶的浓度为500U/mL；

β-葡萄糖苷酶的浓度为1U/mL。

本发明提供的糖苷酶组合物在对淫羊藿苷进行酶解时，两种酶可同时加入，也可分别先后加入。实验表明，同时加入两种糖苷酶先以α-L-鼠李糖苷酶适宜的条件进行酶解后以β-葡萄糖苷酶的适宜条件进行酶解，淫羊藿苷向淫羊藿苷元的摩尔转化率为75％；先加α-L-鼠李糖苷酶进行酶解后再加β-葡萄糖苷酶进行酶解，淫羊藿苷向淫羊藿苷元的摩尔转化率为98.3％；先加β-葡萄糖苷酶进行酶解后再加α-L-鼠李糖苷酶进行酶解，淫羊藿苷向淫羊藿苷元的摩尔转化率为39％。

本发明中，酶解的条件为：

淫羊藿苷与α-L-鼠李糖苷酶于50℃～70℃反应1h～12h后，再与β-葡萄糖苷酶于75℃～95℃反应1h～6h。

一些具体实施例中，酶解的条件为：淫羊藿苷与α-L-鼠李糖苷酶于65℃反应8h后，再与β-葡萄糖苷酶于85℃反应2h。

本发明中，酶解后经过大孔树脂纯化。

所述大孔树脂纯化包括：以大孔树脂吸附酶解产物后，用水洗至无色后依次用20vol％、40vol％、60vol％、80vol％的乙醇水溶液洗两个柱体积，然后用100％乙醇洗至无色，将100％乙醇洗脱液浓缩、干燥获得淫羊藿苷元。

所述大孔树脂为AB-8型、D101型、LSD-632型、LSA-700型、XDA-7型或XDA-6型。

本发明筛选获得了一种能有效降解淫羊藿苷母核结构上鼠李糖残基的α-L-鼠李糖苷酶及能高效降解其母核结构中葡萄糖残基耐高温β-葡萄糖苷酶，随后通过双酶转化高效制备具有完全保持原有生物活性的淫羊藿苷元。本发明提供的组合物中，两种糖苷酶的最适反应温度都较高，底物溶解性较好，不需要助溶剂；并且酶解时间短，得率高。实验表明，采用本发明提供的糖苷酶组合物对淫羊藿苷进行酶解，摩尔转化率为98.3％，淫羊藿苷元的得率为90％。

附图说明

图1示不同来源的α-L-鼠李糖苷酶对淫羊藿苷的转化效率比较；

图2示不同来源的β-葡萄糖苷酶对淫羊藿苷的转化效率比较；

图3示α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶加酶顺序对酶解淫羊藿苷得率的影响；

图4示酶法转化淫羊藿苷制备淫羊藿苷元示意图；

图5示淫羊藿苷酶解产物HPLC图谱；

图6示淫羊藿苷和淫羊藿苷元标准品HPLC图谱(HPLC纯度≥98％)。

具体实施方式

本发明提供了一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的糖苷酶组合物由α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成；本发明实施例中，α-L-鼠李糖苷酶或β-葡萄糖苷酶通过基因工程的方式制得。

其中，Aspergillus terreus CCF 3059来源的α-L-鼠李糖苷酶(氨基酸序列如SEQID NO:1)以酵母表达系统制备获得。表达所用的DNA序列以全基因合成方式制得并通过酵母密码子偏好性优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；重组表达的质粒载体为pPICZαA；酵母载体为Pichia pastoris KM71H。连接有α-L-鼠李糖苷酶序列的质粒载体在转化入酵母前，以Sac I线性化。经酵母表达的α-L-鼠李糖苷酶存在于培养液中，经透析纯化获得纯酶。

Aspergillus niger NL-1来源的α-L-鼠李糖苷酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:2)以大肠杆菌表达系统制备获得。表达采用的DNA序列扩增自Aspergillus niger NL-1的cDNA，扩增引物对序列如SEQ ID NO:10～11所示。重组表达的质粒载体为pET20b；插入的酶切位点为Nde I和HindⅢ，大肠杆菌载体为BL21(DE3)。经表达的α-L-鼠李糖苷酶存在于培养液中，利用His-tag标签进行纯化。

Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482来源的α-L-鼠李糖苷酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:3)以大肠杆菌表达系统制备获得。表达采用的DNA序列扩增自Bacteroidesthetaiotaomicron VPI-5482的基因组DNA，扩增引物对序列如SEQ ID NO:12～13所示。重组表达的质粒载体为pET28a；插入的酶切位点为Nco I和Xho I，大肠杆菌载体为BL21(DE3)。经表达的α-L-鼠李糖苷酶存在于培养液中，利用His-tag标签进行纯化。

Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH3家族的β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:4)以大肠杆菌表达系统制备获得。表达采用的DNA序列扩增自Thermotogathermarum DSM 5069的基因组DNA，扩增引物对序列如SEQ ID NO:14～15所示。重组表达的质粒载体为pET20b；插入的酶切位点为Nde I和Xho I，大肠杆菌载体为BL21(DE3)。经表达的β-葡萄糖苷酶存在于培养液中，经离心以上清液作为重组β-葡萄糖苷酶。

Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH1家族的β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:5)以大肠杆菌表达系统制备获得。表达采用的DNA序列扩增自Thermotogathermarum DSM 5069的基因组DNA，扩增引物对序列如SEQ ID NO:16～17所示。重组表达的质粒载体为pET28b；插入的酶切位点为Nco I和Xho I，大肠杆菌载体为BL21(DE3)。经表达的β-葡萄糖苷酶存在于培养液中，经离心以上清液作为重组β-葡萄糖苷酶。

Thermotoga petrophila DSM 13995来源的GH3家族的β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:6)以大肠杆菌表达系统制备获得。表达采用的DNA序列扩增自Thermotogapetrophila DSM 13995的基因组DNA，扩增引物对序列如SEQ ID NO:18～19所示。重组表达的质粒载体为pET20b；插入的酶切位点为Nde I和Xho I，大肠杆菌载体为JM109(DE3)。经表达的β-葡萄糖苷酶存在于培养液中，利用His-tag标签进行纯化。

Thermotoga petrophila DSM 13995来源的GH1家族的β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:7)以大肠杆菌表达系统制备获得。表达采用的DNA序列扩增自Thermotogapetrophila DSM 13995的基因组DNA，扩增引物对序列如SEQ ID NO:20～21所示。重组表达的质粒载体为pET20b；插入的酶切位点为Nde I和Xho I，大肠杆菌载体为JM109(DE3)。经表达的β-葡萄糖苷酶存在于培养液中，利用His-tag标签进行纯化。

Aspergillus niger NL-1来源的GH3家族的β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:8)以酵母表达系统制备获得。表达采用的DNA序列扩增自Aspergillus niger NL-1的cDNA，扩增引物对序列如SEQ ID NO:22～23所示。重组表达的质粒载体为pPICZαA；酵母载体为Pichia pastoris KM71H。连接有β-葡萄糖苷酶序列的质粒载体在转化入酵母前，以Sac I线性化。经表达的β-葡萄糖苷酶存在于培养液中，经透析纯化获得纯酶。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1.1 Aspergillus terreus CCF 3059来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的合成、质粒构建及重组酶的制备

1.1.1 重组质粒pPICZαA-MRha的构建

全基因合成并通过酵母密码子偏好性优化Aspergillus terreus CCF 3059α-L-鼠李糖苷酶基因(SEQ ID NO：9)，将其连接到pPICZαA质粒上，获得的重组质粒命名为pPICZαA-MRha。

1.1.2 重组酶的制备

提取重组质粒pPICZαA-MRha，经Sac I线性化后，采用电转化法将其导入Pichiapastoris KM71H(Novagen)中，筛选阳性克隆。接种在YPD培养基中进行活化后，转入BMGY培养基中继续活化，收集OD₆₀₀为2.0-3.0的菌体，转入到BMMY培养基中，置于30℃，180rpm摇床进行α-L-鼠李糖苷酶的诱导表达。每隔24h按照体积比0.6％向诱导的菌液中补加无菌的甲醇，培养15天后离心取上清得粗酶液。重组蛋白的纯化：(1)向粗酶液中加终浓度为80％的硫酸铵沉淀蛋白，离心弃上清，用pH 7.5 50mM Tris-HCl缓冲液溶解沉淀的蛋白；(2)用pH7.5 50mM Tris-HCl缓冲液于4℃下透析四次，每次8h，以去除盐溶液；(3)将透析后的酶液加到装好的DEAE SFF柱子中，用浓度20-300mM的NaCl梯度洗脱；(4)取合适浓度的NaCl洗脱下的酶液，用pH 6.5 10mM PB缓冲液于4℃下透析四次，每次8h，以去除盐溶液得纯酶。

1.2 Aspergillus niger NL-1来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、质粒构建及重组酶的制备

1.2.1 Aspergillus niger NL-1的培养

Aspergillus niger NL-1为本实验室保存，其液体培养基配方为：10g/L鼠李糖，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，1.5g/L KH₂PO₄，4g/L(NH₄)₂SO₄，0.09g/L ZnSO₄·7H₂O，0.1g/L CaCl₂，1g/L酵母提取物，2.0g/L豆粕，2.0g/L蛋白胨。先用PDA培养基活化菌株，然后将活化的Aspergillus niger NL-1孢子用无菌生理盐水重悬，接种于50mL液体种子摇瓶培养基中，28℃，150r/min恒温振荡培养72h，收集菌体。

1.2.2 Aspergillus niger NL-1总RNA的提取

(1)取菌体适量置于用液氮预冷的研钵中，在液氮条件下将菌体研磨充分，使其细胞裂解。

(2)取研磨充分的菌丝体放入到用液氮预冷的2mL的用DEPC水处理过的EP管中迅速加入1mL Trizol，混匀，使菌丝体中的RNA充分溶解到混合液中；在4℃12000rpm转速下离心10min

(3)将a步棸中的上清转移至另一新的1.5mL EP管中，加入200μL氯仿，用力振荡15s后放在30℃孵育3min；

(4)在4℃12000rpm转速下离心10min，取上清液至另一个EP管中，加入500μL异丙醇，在25℃下孵育10min；

(5)在4℃12000rpm转速下离心10min，弃上清液；

(6)用75％的乙醇在在4℃6000rpm转速下离心5min洗涤RNA；

(7)重复步骤(5)一次；

(8)用20μL RNase-Free H₂O或DEPC水溶解RNA；

(9)取5μL RNA电泳，检测所提取RNA的丰度。

1.2.3 Aspergillus niger NL-1cDNA的获得

以Aspergillus niger NL-1菌株总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链(以下各逆转录所用试剂均来自于试剂盒“PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit”，购自Takara公司)。

在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液：

混匀后65℃下保温5min后冰上放置1min

在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液：

上述反应液混匀后在50℃下保温1h，70℃下保温15min后冰上冷却，得到的反应液立即用于cDNA第二链的合成。

1.2.4 重组质粒pET20b-Rha的构建

参照Genebank上发表的Aspergillus niger基因序列，设计引物，up：GGA ATT CCA TAT GGC CAG CCA AAT CTT CAT TGA AA(SEQ ID NO:10)和down：CCC AAG CTT GGC AATATC CTC CGG TTC AGG TTC A(SEQ ID NO:11)。下划线表示酶切位点。以Aspergillusniger cDNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，3min；30次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，2min10s)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到Aspergillus niger NL-1来源的α-L-鼠李糖苷酶基因。

将得到Aspergillus niger NL-1来源的α-L-鼠李糖苷酶基因和pET20b分别用NdeI和HindⅢ进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，转化产物涂布到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)固体培养基上37℃过夜培养，接种几个单菌落到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)液体培养基中培养8-10小时后，收集菌体提取质粒，酶切验证去除空载质粒，将重组质粒进行核酸序列测定，得到正确的重组表达载体pET20b-Rha。

1.2.5 重组酶的制备

将重组质粒pET20b-Rha转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Amp(100μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(100μg/mL Amp)37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃诱导培养8h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，离心取上清。由于重组质粒pET20b-TPEBGL1中含有His-tag标签，通过His·Bind Purification Kit(Novagen)进行纯化，得到纯化的Aspergillusniger NL-1来源的GH1家族的β-葡萄糖苷酶。

1.3 Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、质粒构建及重组酶的制备

1.3.1 重组质粒pET-28a-Rha-80的构建、质粒构建

按照Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482基因组克隆α-L-鼠李糖苷酶基因,设计引物，Rha-80up：CCCCCATGGGCATACTTT TGGGTGCCTTGTC(SEQ ID NO:12)

Rha-80down：CCCCTCGAGCAAACGATAGGTAACAATTCC(SEQ ID NO:13)

下划线表示酶切位点，以提取的Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是94℃，3min；30次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，2.1min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH1家族β-葡萄糖苷酶基因。

得到Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482来源的α-L-鼠李糖苷酶基因和pET-28a分别用Nco I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET-28a-Rha-80

1.3.2 重组酶的制备

将重组质粒pET-28a-Rha-80转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Kan(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL Kan)37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，28℃诱导培养8h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，离心取上清。由于重组质粒pET-28a-Rha-80中含有His-tag标签，通过His·Bind Purification Kit(Novagen)进行纯化，得到纯化的Bacteroidesthetaiotaomicron VPI-5482来源的α-L-鼠李糖苷酶。

实施例2.β-葡萄糖苷酶的筛选

2.1 Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH3家族的β-葡萄糖苷酶克隆及重组酶制备

2.1.1 Thermotoga thermarum DSM 5069的培养

Thermotoga thermarum DSM 5069购于DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)。编号为：DSM 5069。其培养基配方为：5g/L可溶性淀粉，1g/L酵母粉，1.5g/L KH₂PO₄，4.2g/LNa₂HPO₄x 12H₂O，3.4g/L NaCl，1g/L MgSO₄×7H₂O，0.76g/L EDTA，1mL/L微量元素，0.5g/LNa₂S·9H₂O，0.5g/L Cysteine HCl，1mg/L刃天青，调pH为7.0，煮沸冲氮气，除去氧气后，培养基在无氧条件下装入厌氧瓶灭菌。微量元素(1000×)配方：FeCl₃ 2.0g/L；H₃BO₃ 0.05g/L；ZnCl₂ 0.05g/L；CuCl₂·2H₂O 0.03g/L；MnCl₂·4H₂O 0.05g/L；(NH₄)₂MoO₄ 0.05g/L；AlKSO₄·2H₂O 0.05g/L。)用注射器按照0.5％接种量接种，82℃静止培养24h，收集细胞。

2.1.2 基因组DNA的提取

(1)静置培养Thermotoga thermarum DSM 5069 24h，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。

(2)用9.5mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀，37℃保温1h。

(3)加入1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)/NaCl，混匀，65℃温育20min。

(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。

(5)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。

(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。

(7)用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗。

(8)用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。

(9)室温下风干，加500μL TE缓冲液溶解。

(10)取50μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。

2.1.3 重组质粒pET-20b-GH3BGL的构建

按照Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH3家族β-葡萄糖苷酶基因(YP_004660847.1)设计引物，GH3-up： 和GH3-down： 下划线表示酶切位点，斜体加黑体表示该氨基酸进行了密码子优化。以提取的Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，3min；30次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，2min10s)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到Thermotogathermarum DSM 5069来源的GH3家族β-葡萄糖苷酶基因。

得到Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH3家族β-葡萄糖苷酶基因和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，转化产物涂布到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)固体培养基上37℃过夜培养，接种几个单菌落到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)液体培养基中培养8-10小时后，收集菌体提取质粒，酶切验证去除空载质粒，将重组质粒进行核酸序列测定，得到正确的重组表达载体pET-20b-GH3BGL。

2.1.4 重组酶的制备

将重组质粒pET-20b-GH3BGL转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Amp(100μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(100μg/mL Amp)37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃诱导培养8h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，随后70℃热处理30min，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，上清即为Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH3家族重组β-葡萄糖苷酶。

2.2 Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH1家族的β-葡萄糖苷酶克隆及重组酶制备

2.2.1 重组质粒pET-28a-GH1BGL的构建

按照Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH1家族β-葡萄糖苷酶基因(AEH51094)设计引物，GH1-up： GH1-down： 下划线表示酶切位点，斜体加黑体表示该氨基酸进行了密码子优化。以提取的Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，3min；30次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到Thermotogathermarum DSM 5069来源的GH1家族β-葡萄糖苷酶基因。

得到Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH1家族β-葡萄糖苷酶基因和pET-28a分别用Nco I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET-28a-GH1BGL。

2.2.2 重组酶的制备

将重组质粒pET-28a-GH1BGL转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Kan(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL Kan)37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.01mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃诱导培养8h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，随后70℃热处理30min，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，上清即为Thermotoga thermarum DSM 5069来源的GH1家族重组β-葡萄糖苷酶

2.3 Thermotoga petrophila DSM 13995来源的GH3家族的β-葡萄糖苷酶克隆及重组酶制备

2.3.1 Thermotoga petrophila DSM 13995的培养

Thermotoga petrophila DSM 13995购于DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)编号为13995。其培养基配方为：10g/L starch，5g/L tryptone，3g/L yeast extract，5g/Lmeat extract，10g/L 2-morpholinoethanesulfonic,10mg/L FeSO₄×7H₂O，1mg/Lresazurin,调整pH为7.2。用注射器按照0.5％接种量接种，85℃静止培养24h，收集细胞。

2.3.2 基因组DNA的提取

(1)静置培养Thermotoga petrophila DSM 13995约24小时，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。

(2)用9.5mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀，37℃保温1h。

(3)加入1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)/NaCl，混匀，65℃温育20min。

(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。

(5)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。

(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。

(7)用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗。

(8)用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。

(9)室温下风干，加500μL TE缓冲液溶解。

(10)取50μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。

2.3.3 重组质粒pET20b-TPEBGL3的构建

按照已知的Thermotoga petrophila DSM 13995耐高糖β-葡萄糖苷酶基因设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。P1：CGCCATATGATGGGAAAGATCGATGAAA(SEQ ID NO:18)，下划线表示Nde I位点。P2：CCGCTCGAGTGGTTTGAATCTCTTCTCT(SEQ ID NO:19)，下划线表示Xho I位点，并去除终止密码子。以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到Thermotogapetrophila DSM 13995耐高温β-葡萄糖苷酶基因。

将得到的Thermotoga petrophila DSM 13995耐高温β-葡萄糖苷酶基因和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒pET20b-TPEBGL3。

2.3.4 重组酶的制备

将重组质粒pET20b-TPEBGL3转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃培养6h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，离心取上清。由于重组质粒pET20b-TPEBGL3中含有His-tag标签，通过His·Bind Purification Kit(Novagen)进行纯化，得到纯化的Thermotoga petrophila DSM 13995来源的GH3家族的β-葡萄糖苷酶。

2.4 Thermotoga petrophila DSM 13995来源的GH1家族的β-葡萄糖苷酶克隆及重组酶制备

2.4.1 Thermotoga petrophila DSM 13995的培养

Thermotoga petrophila DSM 13995购于DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)编号为13995，其培养基配方为：10g/L淀粉、5g/L胰蛋白胨、3g/L酵母提取物、5g/L肉浸液、10g/L2-马啉乙磺酸、10mg/L七水合硫酸铁、1mg/L刃天青,调整pH为7.2。用注射器按照0.5％接种量接种，85℃静止培养24h，收集细胞。

2.4.2 基因组DNA的提取

(1)静置培养Thermotoga petrophila DSM 13995约24小时，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。

(2)用9.5mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)和50L蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀，37℃保温1h。

(3)加入1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)/NaCl，混匀，65℃温育20min。

(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。

(5)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。

(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。

(7)用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗。

(8)用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。

(9)室温下风干，加500L TE缓冲液溶解。

(10)取50L用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。

2.4.3 重组质粒pET20b-BGL1的构建

按照已知的Thermotoga petrophila DSM 13995耐高糖β-葡萄糖苷酶基因(登录号：YP_001244492.1)设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下

P1：下划线表示Nde I位点

P2：下划线表示Xho I位点，并去除终止密码子。

以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40L石蜡油密封；28次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，1.5min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到β-葡萄糖苷酶TPEBGL1的DNA分子。

将得到的β-葡萄糖苷酶TPEBGL1的DNA分子和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高温β-葡萄糖苷酶DNA分子的重组质粒pET20b-TPEBGL1。

2.4.4 重组酶的制备

将重组质粒pET20b-TPEBGL1转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌(购自Novagen公司)，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50g/mL氨苄青霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，不加异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃培养7h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，离心取上清。由于重组质粒pET20b-TPEBGL1中含有His-tag标签，通过His·Bind Purification Kit(Novagen)进行纯化，得到纯化的Thermotoga petrophila DSM 13995来源的GH1家族的β-葡萄糖苷酶。

2.5 Aspergillus niger NL-1来源的GH3家族的β-葡萄糖苷酶克隆及重组酶制备

2.5.1 Aspergillus niger NL-1的培养

Aspergillus niger NL-1为本实验室保存，其液体培养基配方为：10g/L葡萄糖，4g/L(NH₄)₂SO₄，3.0g/L KH₂PO₄，0.5g/L Ca²⁺，0.5g/L MgSO₄×7H₂O，0.005g/L FeSO₄，0.0014g/L ZnCl₂，pH值4.8。先用PDA培养基活化菌株，然后将活化的Aspergillus nigerNL-1孢子用无菌生理盐水重悬，接种于50mL液体种子摇瓶培养基中，28℃，150r/min恒温振荡培养72h，收集菌体。

2.5.2 Aspergillus niger NL-1总RNA的提取

(1)取菌体适量置于用液氮预冷的研钵中，在液氮条件下将菌体研磨充分，使其细胞裂解。

(2)取研磨充分的菌丝体放入到用液氮预冷的2mL的用DEPC水处理过的EP管中迅速加入1mL Trizol，混匀，使菌丝体中的RNA充分溶解到混合液中；在4℃12000rpm转速下离心10min

(3)将a步棸中的上清转移至另一新的1.5mL EP管中，加入200μL氯仿，用力振荡15s后放在30℃孵育3min；

(4)在4℃12000rpm转速下离心10min，取上清液至另一个EP管中，加入500μL异丙醇，在25℃下孵育10min；

(5)在4℃12000rpm转速下离心10min，弃上清液；

(6)用75％的乙醇在在4℃6000rpm转速下离心5min洗涤RNA；

(7)重复步骤(5)一次；

(8)用20μL RNase-Free H₂O或DEPC水溶解RNA；

(9)取5μL RNA电泳，检测所提取RNA的丰度。

2.5.3 Aspergillus niger NL-1cDNA的获得

以Aspergillus niger NL-1菌株总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链(以下各逆转录所用试剂均来自于试剂盒“PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit”，购自Takara公司)。

在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液：

混匀后65℃下保温5min后冰上放置1min

在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液：

上述反应液混匀后在50℃下保温1h，70℃下保温15min后冰上冷却，得到的反应液立即用于cDNA第二链的合成。

2.5.4 重组质粒pPICZαA-GH3BGL的构建

参照Genebank上发表的Aspergillus niger基因序列，设计引物，up：CCC GAA TTCATG AGG TTC ACT TTG ATG G(SEQ ID NO:22)和down：CCC AAG CTT TTA GTG AAC AGT AGGCAG(SEQ ID NO:23)。下划线表示酶切位点。以Aspergillus niger cDNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，3min；30次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，2min10s)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到Aspergillus niger NL-1来源的GH1家族β-葡萄糖苷酶基因。

得到Aspergillus niger NL-1来源的GH1家族β-葡萄糖苷酶基因和pPICZαA分别用EcoR I和HindⅢ进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，转化产物涂布到LLB(添加博来霉素至终浓度100mg/L)固体培养基上37℃过夜培养，接种几个单菌落到LLB(添加博来霉素至终浓度100mg/L)液体培养基中培养8-10小时后，收集菌体提取质粒，酶切验证去除空载质粒，将重组质粒进行核酸序列测定，得到正确的重组表达载体pPICZαA-GH3BGL。

2.5.5 重组酶的制备

提取重组质粒pPICZαA-GH3BGL，经Sac I线性化后，采用电转化法将其导入Pichiapastoris KM71H(Novagen)中，筛选阳性克隆。接种在YPD培养基中进行活化后，转入BMGY培养基中继续活化，收集OD600为2.0-3.0的菌体，转入到BMMY培养基中，置于30℃，180rpm摇床进行α-L-鼠李糖苷酶的诱导表达。每隔24h按照体积比0.6％向诱导的菌液中补加无菌的甲醇，培养15天后离心取上清得粗酶液。重组蛋白的纯化：(1)向粗酶液中加终浓度为80％的硫酸铵沉淀蛋白，离心弃上清，用pH 7.5 50mM Tris-HCl缓冲液溶解沉淀的蛋白；(2)用pH 7.5 50mM Tris-HCl缓冲液于4℃下透析四次，每次8h，以去除盐溶液；(3)将透析后的酶液加到装好的DEAE SFF柱子中，用浓度20-300mM的NaCl梯度洗脱；(4)取合适浓度的NaCl洗脱下的酶液，用pH 6.5 10mM PB缓冲液于4℃下透析四次，每次8h，以去除盐溶液得纯酶。

实施例3.α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶酶活测定

以对硝基苯酚-α-鼠李糖苷(pNP-R)为底物，水解得到的对硝基苯酚与碳酸钠发生显色反应，在405nm的波长下测定产物的吸光度。100μL反应体系包括75μL 100mM最适pH的缓冲液，20μL 5mM底物，混匀预热后加入5μL稀释酶液，最适温度下反应10min，然后加入0.3mL 1M NaCO₃终止反应，混匀后在405nm条件下酶标仪测定。同时做有酶液无底物的对照和有底物无酶液的对照。

以对硝基苯酚-β-葡萄糖苷(pNP-G)为底物，水解得到的对硝基苯酚与碳酸钠发生显色反应，在405nm的波长下测定产物的吸光度。100μL反应体系包括90μL 100mM最适pH缓冲液，5μL 20mM底物，混匀预热后加入5μL稀释酶液，最适温度下反应10min，然后加入0.3mL1M NaCO₃终止反应，混匀后在405nm条件下酶标仪测定。同时做有酶液无底物的对照和有底物无酶液的对照。

一个酶活单位(U)定义为：在65℃、pH 6.5的条件下，水解释放1μmol对硝基酚所需的酶量。

对照标准曲线，计算酶活：

酶活(U/mL)＝c×V ₁/(t×V₂)×N

c：由对硝基苯酚标准方程计算出的酶反应后的对硝基苯酚含量(μmol/mL)；

V₁：反应体系总体积(mL)；

t：酶与底物反应时间(min)；

V₂：酶反应时酶液的体积(mL)；

N：酶液稀释倍数。

3.1 不同来源的重组酶降解淫羊藿苷催化能力的比较

3.1.1 不同来源的重组α-L-鼠李糖苷酶降解淫羊藿苷催化能力的比较

淫羊藿苷的浓度为0.5g/L，以三种不同来源的α-L-鼠李糖苷酶在各自最适温度，最适pH为转化条件，均加入60U/mL的酶，反应8h，通过HPLC进行检测。结果表明：反应2h后，来源于Aspergillus terreus CCF 3059、Aspergillus niger NL-1、Bacteroidesthetaiotaomicron VPI-5482的α-L-鼠李糖苷酶转化淫羊藿苷为淫羊藿次苷I的摩尔转化率分别为：61％、0.05％、0.1％(图1)，其中来源于Aspergillus terreus CCF 3059的α-L-鼠李糖苷酶能有效降解淫羊藿苷为淫羊藿次苷I。

3.1.2 不同来源的重组β-葡萄糖苷酶降解淫羊藿苷催化能力的比较

淫羊藿苷的浓度为0.5g/L，以五种不同来源的β-葡萄糖苷酶在各自最适温度，最适pH为转化条件，均加入0.1U/mL的纯酶，反应2h，通过HPLC进行检测。结果表明：反应30min后，来源于Thermotoga thermarum DSM 5069 GH1家族、Thermotoga thermarum DSM 5069GH3家族、Thermotoga petrophila DSM 13995 GH1家族、Thermotoga petrophila DSM13995 GH3家族、Aspergillus niger NL-1 GH3家族的β-葡萄糖苷酶转化淫羊藿苷为淫羊藿次苷Ⅱ的摩尔转化率分别为：66％、94％、91％、83％、56％(图2)，其中来源于Thermotogathermarum DSM 5069 GH3家族的β-葡萄糖苷酶降解效果最佳。

3.2 酶法催化转化淫羊藿苷制备淫羊藿苷元的工艺研究

3.2.1 同时加α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶

淫羊藿苷的浓度为0.5g/L，pH 6.5 100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入500U/mL Aspergillus terreus CCF 3059的α-L-鼠李糖苷酶和1U/mL Thermotogathermarum DSM 5069 GH3家族的β-葡萄糖苷酶，先在65℃下反应8h，然后在85℃继续反应2h。通过HPLC进行检测，结果表明：转化淫羊藿苷为淫羊藿苷元的摩尔转化率为：75％(图3)。

3.2.2 先加α-L-鼠李糖苷酶再加β-葡萄糖苷酶

淫羊藿苷的浓度为0.5g/L，pH 6.5 100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，先加入500U/mL Aspergillus terreus CCF 3059的α-L-鼠李糖苷酶在65℃下反应8h，然后再加入1U/mL Thermotoga thermarum DSM 5069 GH3家族的β-葡萄糖苷酶在85℃继续反应2h。通过HPLC进行检测，结果表明：转化淫羊藿苷为淫羊藿苷元的摩尔转化率为：98.3％(图3)。

3.2.3 先加β-葡萄糖苷酶再加α-L-鼠李糖苷酶

淫羊藿苷的浓度为0.5g/L，pH 6.5 100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，先加入1U/mL Thermotoga thermarum DSM 5069 GH3家族的β-葡萄糖苷酶在85℃反应2h，然后再加入500U/mL Aspergillus terreus CCF 3059的α-L-鼠李糖苷酶在65℃下继续反应8h。通过HPLC进行检测，结果表明：转化淫羊藿苷为淫羊藿苷元的摩尔转化率为：39％(图3)。

由上述结果可知：先加Aspergillus terreus CCF 3059的α-L-鼠李糖苷酶反应再加Thermotoga thermarum DSM 5069 GH3家族的β-葡萄糖苷酶继续反应更有利于转化淫羊藿苷制备淫羊藿苷元。

实施例4淫羊藿苷的酶解

淫羊藿苷(纯度≥98％)的浓度为0.5g/L，pH 6.5 100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，淫羊藿苷先加入500U/mL Aspergillus terreus CCF 3059的α-L-鼠李糖苷酶(实施例1制备)在65℃下反应8h，然后再加入1U/mL Thermotoga thermarum DSM 5069 GH3家族的β-葡萄糖苷酶(实施例2制备)在85℃继续反应2h。反应液通过HPLC进行检测，结果表明：转化淫羊藿苷为淫羊藿苷元的摩尔转化率为：98.3％。

反应液通过大孔树脂AB-8柱子吸附，用水洗至无色，然后依次用20％、40％、60％、80％的乙醇水溶液洗两个柱体积，最后用100％乙醇水溶液洗至无色，通过HPLC进行检测，结果表明：100％乙醇洗脱液中含有淫羊藿苷元，浓缩蒸干即得淫羊藿苷元粉末，粉末用甲醇溶解，HPLC结果如图5所示，对比淫羊藿苷和淫羊藿苷元标准品的HPLC检测图谱(图6)证明得到了淫羊藿苷元。根据标准方程计算可知，纯度达到98％。

0.2g淫羊藿苷双酶转化后通过大孔树脂AB-8分离纯化得0.096g淫羊藿苷元粉末。理论上应得0.107g淫羊藿苷元粉末，因此得率为90％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏康缘药业股份有限公司

<120> 一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法

<130> MP1707127

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 871

<212> PRT

<213> Aspergillus terreus CCF 3059

<400> 1

Met Ala Leu Ser Ile Ser Gln Val Ala Phe Glu His His Arg Thr Ala

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Glu Thr Gln Pro Arg Val Ser Trp Arg Phe Asp Gly

20 25 30

Asn Val Ser Asp Trp Glu Gln Arg Ala Tyr Glu Ile Glu Val Lys Arg

35 40 45

Ala Gly His Asp Ala Asp Val Phe Arg Ser Glu Ser Ser Asp Ser Val

50 55 60

Leu Val Pro Trp Pro Ser Ser Pro Leu Gln Ser Gly Glu Glu Ala Thr

65 70 75 80

Val Arg Val Arg Ser Phe Gly Ser Asp Gly Gln His Asp Thr Pro Trp

85 90 95

Ser Asp Ala Val Thr Val Glu Pro Gly Leu Leu Thr Pro Asp Asp Trp

100 105 110

His Asp Ala Val Val Ile Ala Ser Asp Arg Pro Thr Glu Val Asp Ala

115 120 125

Thr His Arg Pro Ile Gln Phe Arg Lys Glu Phe Ser Val Asp Asp Ser

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Pro Glu Asn Tyr Lys Asp Asp Met Ser Glu Ile Gln Glu Lys Ile Asp

275 280 285

Phe Val Gly Leu Asn Tyr Tyr Ser Gly His Leu Val Lys Phe Asp Pro

290 295 300

Asp Ala Pro Ala Lys Val Ser Phe Val Glu Arg Asp Leu Pro Lys Thr

305 310 315 320

Ala Met Gly Trp Glu Ile Val Pro Glu Gly Ile Tyr Trp Ile Leu Lys

325 330 335

Lys Val Lys Glu Glu Tyr Asn Pro Pro Glu Val Tyr Ile Thr Glu Asn

340 345 350

Gly Ala Ala Phe Asp Asp Val Val Ser Glu Asp Gly Arg Val His Asp

355 360 365

Gln Asn Arg Ile Asp Tyr Leu Lys Ala His Ile Gly Gln Ala Trp Lys

370 375 380

Ala Ile Gln Glu Gly Val Pro Leu Lys Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu

385 390 395 400

Leu Asp Asn Phe Glu Trp Ala Glu Gly Tyr Ser Lys Arg Phe Gly Ile

405 410 415

Val Tyr Val Asp Tyr Ser Thr Gln Lys Arg Ile Ile Lys Asp Ser Gly

420 425 430

Tyr Trp Tyr Ser Asn Val Val Lys Ser Asn Ser Leu Glu Asp

435 440 445

<210> 7

<211> 722

<212> PRT

<213> Thermotoga petrophila DSM 13995 GH3家族

<400> 7

Met Met Gly Lys Ile Asp Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ile Glu Glu

1 5 10 15

Lys Val Lys Leu Val Val Gly Val Gly Leu Pro Gly Leu Phe Gly Asn

20 25 30

Pro His Ser Arg Val Ala Gly Ala Ala Gly Glu Thr His Pro Val Pro

35 40 45

Arg Leu Gly Ile Pro Ser Phe Val Leu Ala Asp Gly Pro Ala Gly Leu

50 55 60

Arg Ile Asn Pro Thr Arg Glu Asn Asp Glu Asn Thr Tyr Tyr Thr Thr

65 70 75 80

Ala Phe Pro Val Glu Ile Met Leu Ala Ser Thr Trp Asn Lys Asp Leu

85 90 95

Leu Glu Glu Val Gly Lys Ala Met Gly Glu Glu Val Arg Glu Tyr Gly

100 105 110

Val Asp Val Leu Leu Ala Pro Ala Met Asn Ile His Arg Asn Pro Leu

115 120 125

Cys Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu Asp Pro Val Leu Ser Gly

130 135 140

Glu Met Ala Ser Ala Phe Val Lys Gly Val Gln Ser Gln Gly Val Gly

145 150 155 160

Ala Cys Ile Lys His Phe Val Ala Asn Asn Gln Glu Thr Asn Arg Met

165 170 175

Val Val Asp Thr Ile Val Ser Glu Arg Ala Leu Arg Glu Ile Tyr Leu

180 185 190

Lys Gly Phe Glu Ile Ala Val Lys Lys Ala Arg Pro Trp Thr Val Met

195 200 205

Ser Ala Tyr Asn Lys Leu Asn Gly Lys Tyr Cys Ser Gln Asn Glu Trp

210 215 220

Leu Leu Lys Lys Val Leu Arg Glu Glu Trp Gly Phe Asp Gly Phe Val

225 230 235 240

Met Ser Asp Trp Tyr Ala Gly Asp Asn Pro Val Glu Gln Leu Lys Ala

245 250 255

Gly Asn Asp Met Ile Met Pro Gly Lys Ala Tyr Gln Val Asn Thr Glu

260 265 270

Arg Arg Asp Glu Ile Glu Glu Ile Met Glu Ala Leu Lys Glu Gly Arg

275 280 285

Leu Ser Glu Glu Val Leu Asn Glu Cys Val Arg Asn Ile Leu Lys Val

290 295 300

Leu Val Asn Ala Pro Ser Phe Lys Gly Tyr Arg Tyr Ser Asn Lys Pro

305 310 315 320

Asp Leu Glu Ser His Ala Lys Val Ala Tyr Glu Ala Gly Val Glu Gly

325 330 335

Val Val Leu Leu Glu Asn Asn Gly Val Leu Pro Phe Asp Glu Ser Ile

340 345 350

His Val Ala Val Phe Gly Thr Gly Gln Ile Glu Thr Ile Lys Gly Gly

355 360 365

Thr Gly Ser Gly Asp Thr His Pro Arg Tyr Thr Ile Ser Ile Leu Glu

370 375 380

Gly Ile Lys Glu Arg Asn Met Lys Phe Asp Glu Glu Leu Thr Ser Ile

385 390 395 400

Tyr Glu Asp Tyr Ile Lys Lys Met Arg Glu Thr Glu Glu Tyr Lys Pro

405 410 415

Arg Thr Asp Ser Trp Gly Thr Val Ile Lys Pro Lys Leu Pro Glu Asn

420 425 430

Phe Leu Ser Glu Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ala Lys Lys Asn Asp Ala

435 440 445

Ala Val Val Val Ile Ser Arg Ile Ser Gly Glu Gly Tyr Asp Arg Lys

450 455 460

Pro Val Lys Gly Asp Phe Tyr Leu Ser Asp Asp Glu Leu Glu Leu Ile

465 470 475 480

Lys Thr Val Ser Arg Glu Phe His Glu Gln Gly Lys Lys Val Val Val

485 490 495

Leu Leu Asn Ile Gly Ser Pro Ile Glu Val Ala Ser Trp Arg Asp Leu

500 505 510

Val Asp Gly Ile Leu Leu Val Trp Gln Ala Gly Gln Glu Met Gly Arg

515 520 525

Ile Val Ala Asp Val Leu Val Gly Arg Val Asn Pro Ser Gly Lys Leu

530 535 540

Pro Thr Thr Phe Pro Lys Asp Tyr Ser Asp Val Pro Ser Trp Thr Phe

545 550 555 560

Pro Gly Glu Pro Lys Asp Asn Pro Gln Arg Val Val Tyr Glu Glu Asp

565 570 575

Ile Tyr Val Gly Tyr Arg Tyr Tyr Asp Thr Phe Gly Val Glu Pro Ala

580 585 590

Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Lys Phe Glu Tyr Lys Asp

595 600 605

Leu Lys Ile Ala Ile Asp Gly Asp Ile Leu Arg Val Ser Tyr Thr Ile

610 615 620

Thr Asn Thr Gly Asp Arg Ala Gly Lys Glu Val Ser Gln Val Tyr Val

625 630 635 640

Lys Ala Pro Lys Gly Lys Ile Asp Lys Pro Phe Gln Glu Leu Lys Ala

645 650 655

Phe His Lys Thr Lys Leu Leu Asn Pro Gly Glu Ser Glu Lys Ile Phe

660 665 670

Leu Glu Ile Pro Leu Arg Asp Leu Ala Ser Phe Asp Gly Lys Glu Trp

675 680 685

Val Val Glu Ser Gly Glu Tyr Glu Val Arg Val Gly Ala Ser Ser Arg

690 695 700

Asp Ile Arg Leu Arg Asp Ile Phe Leu Val Glu Gly Glu Lys Arg Phe

705 710 715 720

Lys Pro

<210> 8

<211> 860

<212> PRT

<213> Aspergillus niger NL-1 GH3家族

<400> 8

Met Arg Phe Thr Leu Ile Glu Ala Val Ala Leu Thr Ala Val Ser Leu

1 5 10 15

Ala Ser Ala Asp Glu Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Tyr Tyr Pro Ser Pro

20 25 30

Trp Ala Asn Gly Gln Gly Asp Trp Ala Gln Ala Tyr Gln Arg Ala Val

35 40 45

Asp Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Asp Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr

50 55 60

Gly Thr Gly Trp Glu Leu Glu Leu Cys Val Gly Gln Thr Gly Gly Val

65 70 75 80

Pro Arg Leu Gly Val Pro Gly Met Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu Gly

85 90 95

Val Arg Asp Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Met Asn Val

100 105 110

Ala Ala Thr Trp Asp Lys Asn Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Lys Ala Met

115 120 125

Gly Gln Glu Phe Ser Asp Lys Gly Ala Asp Ile Gln Leu Gly Pro Ala

130 135 140

Ala Gly Pro Leu Gly Arg Ser Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly

145 150 155 160

Phe Ser Pro Asp Pro Ala Leu Ser Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile

165 170 175

Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Val Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile

180 185 190

Ala Tyr Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Ala Pro Glu Ala Gln Gly Phe

195 200 205

Gly Phe Asn Ile Ser Glu Ser Gly Ser Ala Asn Leu Asp Asp Lys Thr

210 215 220

Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Ile Arg Ala Gly

225 230 235 240

Ala Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly

245 250 255

Cys Gln Asn Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly

260 265 270

Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Ala Ala His His Ala Gly Val

275 280 285

Ser Gly Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val Asp

290 295 300

Tyr Asp Ser Gly Thr Ser Tyr Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ser Val

305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Val Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg

325 330 335

Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Trp Thr Pro

340 345 350

Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Tyr Lys Tyr Tyr

355 360 365

Tyr Val Ser Glu Gly Pro Tyr Glu Lys Val Asn Gln Tyr Val Asn Val

370 375 380

Gln Arg Asn His Ser Glu Leu Ile Arg Arg Ile Gly Ala Asp Ser Thr

385 390 395 400

Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Arg

405 410 415

Leu Val Ala Leu Ile Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Tyr Gly Ala

420 425 430

Asn Gly Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Gly

435 440 445

Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln

450 455 460

Ala Ile Ser Asn Glu Val Leu Lys His Lys Asn Gly Val Phe Thr Ala

465 470 475 480

Thr Asp Asn Trp Ala Ile Asp Gln Ile Glu Ala Leu Ala Lys Thr Ala

485 490 495

Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile

500 505 510

Asn Val Asp Gly Asn Leu Gly Asp Arg Arg Asn Leu Thr Leu Trp Arg

515 520 525

Asn Gly Asp Asn Val Ile Lys Ala Ala Ala Ser Asn Cys Asn Asn Thr

530 535 540

Ile Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Val Asn Glu Trp Tyr

545 550 555 560

Asp Asn Pro Asn Val Thr Ala Ile Leu Trp Gly Gly Leu Pro Gly Gln

565 570 575

Glu Ser Gly Asn Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro

580 585 590

Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ala Tyr Gln

595 600 605

Asp Tyr Leu Val Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Glu

610 615 620

Asp Phe Val Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg Gly Phe Asp Lys Arg

625 630 635 640

Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr

645 650 655

Phe Asn Tyr Ser Asn Leu Glu Val Gln Val Leu Ser Ala Pro Ala Tyr

660 665 670

Glu Pro Ala Ser Gly Glu Thr Glu Ala Ala Pro Thr Phe Gly Glu Val

675 680 685

Gly Asn Ala Ser Asp Tyr Leu Tyr Pro Ser Gly Leu Gln Arg Ile Thr

690 695 700

Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Gly Thr Asp Leu Glu Ala Ser Ser

705 710 715 720

Gly Asp Ala Ser Tyr Gly Gln Asp Ser Ser Asp Tyr Leu Pro Glu Gly

725 730 735

Ala Thr Asp Gly Ser Ala Gln Pro Ile Leu Pro Ala Gly Gly Gly Pro

740 745 750

Gly Gly Asn Pro Arg Leu Tyr Asp Glu Leu Ile Arg Val Ser Val Thr

755 760 765

Ile Lys Asn Thr Gly Lys Val Ala Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu Tyr

770 775 780

Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Ile Val Leu Arg Gln Phe

785 790 795 800

Glu Arg Ile Thr Leu Gln Pro Ser Glu Glu Thr Lys Trp Ser Thr Thr

805 810 815

Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asn Val Glu Lys Gln Asp Trp

820 825 830

Glu Ile Thr Ser Tyr Pro Lys Met Val Phe Val Gly Ser Ser Ser Arg

835 840 845

Lys Leu Pro Leu Arg Ala Ser Leu Pro Thr Val His

850 855 860

<210> 9

<211> 0

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggaattccat atggccagcc aaatcttcat tgaaa 35

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccaagcttg gcaatatcct ccggttcagg ttca 34

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccccatggg catacttttg ggtgccttgt c 31

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cccctcgagc aaacgatagg taacaattcc 30

<210> 14

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccccatatga aagaggttaa tgaaattctg agcaagctga ccctggagga gaaagtg 57

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cccctcgagc ggcttaaagg tgcgctcctt ctcgatgcta aatatcttgc gcaatctta 59

<210> 16

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccccatggg ttttccaaag gattttctgt tcggcgcgag catggccggc ttccaagttg 60

aaatgggata tg 72

<210> 17

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cccctcgagc atgcgccaga tttcgtatgg gcttttcagg tagttgtgaa agcgtgccgt 60

tgtcccttct ttg 73

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgccatatga tgggaaagat cgatgaaa 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccgctcgagt ggtttgaatc tcttctct 28

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cgccatatga acgtgaaaaa gttccc 26

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccgctcgaga tcttccagac tgttgctt 28

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cccgaattca tgaggttcac tttgatgg 28

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cccaagcttt tagtgaacag taggcag 27

Claims (10)

1.一种糖苷酶组合物，其特征在于，由α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成；

所述α-L-鼠李糖苷酶源自Aspergillus terreus CCF 3059、Aspergillus niger NL-1或Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482；

所述β-葡萄糖苷酶源自Thermotoga thermarum DSM 5069 GH1家族、Thermotogathermarum DSM 5069 GH3家族、Thermotoga petrophila DSM 13995 GH1家族、Thermotogapetrophila DSM 13995 GH3家族或Aspergillus niger NL-1GH3家族。

2.根据权利要求1所述的糖苷酶组合物，其特征在于，所述α-L-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷酶的活力比为100:1～600:1。

3.根据权利要求1所述的糖苷酶组合物，其特征在于，

所述α-L-鼠李糖苷酶源自Aspergillus terreus CCF 3059；

所述β-葡萄糖苷酶源自Thermotoga thermarum DSM 5069 GH3家族。

4.权利要求1～3任一项所述糖苷酶组合物在转化淫羊藿苷为淫羊藿苷元中的应用。

5.一种酶法制备淫羊藿苷元的方法，其特征在于，以权利要求1～3任一项所述的糖苷酶组合物对淫羊藿苷进行酶解。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶解的缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶解的条件为：

淫羊藿苷与α-L-鼠李糖苷酶于50℃～70℃反应1h～12h后，再与β-葡萄糖苷酶于75℃～95℃反应1h～6h。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶解体系中：

淫羊藿苷的浓度为0.2～1g/L；

α-L-鼠李糖苷酶的浓度为100U/mL～600U/mL；

β-葡萄糖苷酶的浓度为0.2U/mL～1U/mL。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶解后经过大孔树脂纯化。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大孔树脂纯化包括：以大孔树脂吸附酶解产物后，用水洗至无色后依次用20vol％、40vol％、60vol％、80vol％的乙醇水溶液洗两个柱体积，然后用100％乙醇洗至无色，将100％乙醇洗脱液浓缩、干燥获得淫羊藿苷元。