CN101316573A

CN101316573A - 一种含有淫羊藿苷的水解产物的化妆品组合物

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Publication number: CN101316573A
Application number: CNA2006800447555A
Authority: CN
Inventors: 朴俊星; 卢浩植; 金德姬; 张利燮
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2006-10-30
Publication date: 2008-12-03
Anticipated expiration: 2026-10-30
Also published as: KR20070056674A; CN101316573B; KR100803577B1; US20090170787A1; JP2009517461A; JP5227181B2; WO2007064085A1; US8394775B2

Abstract

本发明涉及一种含有淫羊藿苷的水解产物的化妆品组合物，更具体地涉及这样一种含有淫羊藿苷的水解产物的化妆品组合物，所述淫羊藿苷的水解产物含有淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II。所述淫羊藿苷的水解产物由包括如下步骤的方法制备得到：(a)使用水或有机溶剂从含有淫羊藿苷的植物中得到提取物；和(b)使用酸、碱、酶、或能够生成酶的微生物对所述植物的提取物进行水解。根据本发明的化妆品组合物能够用于抗氧化、抗老化、增白或抗皱效应。

Description

一种含有淫羊藿苷的水解产物的化妆品组合物

技术领域

本发明涉及一种含有淫羊藿苷(icariin)的水解产物的化妆品组合物，更具体地涉及这样一种含有淫羊藿苷的水解产物的化妆品组合物，所述淫羊藿苷水解产物含有淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II，其中，所述淫羊藿苷的水解产物由包括如下步骤的方法制备得到：(a)使用水或有机溶剂从含有淫羊藿苷的植物中得到提取物；和(b)使用酸、碱、酶、或能够生成酶的微生物对所述植物的提取物进行水解。

背景技术

如中国药典所述，属于小檗科(Berberidaceae family)的淫羊藿属(Epimedium genus)植物分为心叶淫羊藿(E.brevicornum)、箭叶淫羊藿(E.sagittatum)和朝鲜淫羊藿(E.koreanum)这三个种类。有研究报道淫羊藿属植物主要由类黄酮、生物碱和木酚素组成。特别地，通过将除根部以外的整棵淫羊藿属植物进行干燥而制备得到的草药称作淫羊藿草药(Epimeii Herb)，该草药已经用于治疗全身性瘫痪和健忘症，并可用作催欲素和兴奋剂。

众所周知，各种物理、化学和环境因素(如体内的酶体系和新陈代谢)产生的氧自由基，化学药品，污染物，和光化学反应能够诱发多种疾病，包括由对脂质、细胞组成物质(如蛋白质、糖类和DNA)的非选择性的、不可逆的破坏而引起的细胞老化或癌症。并且，氧自由基是许多疾病的起因，因为多种过氧化物均能够引发多种功能紊乱，所述过氧化物包括由细胞氧化性破坏生成的氧自由基引发的脂质的过氧化作用而产生的脂质过氧化物。

因此，抗氧化剂(例如能够除去自由基的自由基清除剂)，或能够抑制过氧化物(如自由基)生成的物质，被期望成为由这些过氧化而引起的老化和各种疾病的抑制或治疗制剂。

为了开发天然的抗氧化剂，对许多从天然来源得到的物质进行了研究。然而，大多数由天然来源得到的物质以简单的提取物形式使用，提取物的效果是由哪些物质带来的并不明确。根据经验和口头信息，这些物质已经用于化妆品组合物中。

同时，皮肤老化大多根据其起因而进行分类。一种是自然老化(固有老化)，其中，皮肤的结构和生理功能随着人变老而持续不断地衰退。另一种是由外部应力的积聚(如太阳辐射)而引起的非固有老化。特别地，太阳光中的紫外线是老化的主要原因。当皮肤在紫外光中长时间曝露时，组织的角质层将增厚，胶原蛋白和弹性蛋白变性，这样就使得皮肤失去弹性。这些胶原蛋白和弹性蛋白由许多因素控制。通过基质金属蛋白酶(如胶原蛋白酶和弹性蛋白酶)的表达，合成的胶原蛋白和弹性蛋白将被分解，并且皮肤中的胶原水平降低。

为了抑制引起弹性降低的胶原蛋白和弹性蛋白的减少，开发使用了许多物质。在这些物质当中，类维生素A，如视黄醇和维甲酸，表现出其能够改善弹性(Dermatology therapy，1998，16，357-364)，一种从豆科(Leguminosae)种子中得到的蛋白质组分表现出具有增加弹性的作用(US 5322839)。

但是，这些类维生素A具有即使少量用于皮肤也会引起刺激的缺点。它们主要是从天然物质中得到的物质，因此，尚未清楚地了解到提取物中的哪些组分表现出了效果。因而，很难保持和控制提取物的活性。

同时，人体的皮肤颜色由许多因素决定。特别地，形成黑色素颜料的黑色素细胞的活性，血管的分布，皮肤的厚度和皮肤内部或外部的色素(如类胡萝卜素和胆红素)的存在都是很重要的。

在这些因素中最重要的因素是黑色素，黑色素是一种由人体中的多种酶(如黑色素细胞中的酪氨酸酶)产生的黑色颜料。这种黑色素颜料的形成受到遗传因素、与激素分泌和应力有关的生理因素和环境因素(如紫外线的照射)的影响。

在人类皮肤的黑色素细胞中生成的黑色素颜料是一种高分子量的苯酚化合物，具有黑色颜料和蛋白质的组成结构，用以阻挡来自太阳的紫外线以保护真皮下的皮肤机体，同时通过捕获皮肤中生成的自由基来保护蛋白质和基因。

如上所述，由外部应力刺激而生成的黑色素是稳定的物质，甚至在应力减弱后也不会消失，直到它通过皮肤的角质化作用而除去。但是，当生成的黑色素超过了所需要的量时，可能会引起色素沉积、化妆不良的情况(如脱色、雀斑和斑点)。

并且，由于休闲人群的增加，越来越多的人喜欢户外活动，因而，需要阻止由紫外线引起的黑色素沉积。

为了满足上述需要，维生素C、曲酸、熊果苷、对苯二酚、谷胱甘肽或它们的衍生物，或对酪氨酸酶具有抑制活性的物质，均被用在了化妆品组合物或药物产品中。但是，由于增白效果不够、用在皮肤上的安全性、以及当加入到化妆品组合物中时的发生的配方和安全性问题，这些物质的使用受到了限制。

发明内容

因而，为了解决上述问题，并且为了得到一种具有优异的抗氧化、抗老化和增白效果的物质，本发明的发明人研究了许多天然物质，发现：淫羊藿属植物的提取物中含有的黄酮类化合物——淫羊藿苷具有这样的效果，并且通过对淫羊藿苷用酸、碱、酶、或能够生成酶的微生物进行水解而制备得到的淫羊藿苷的水解产物在抗氧化、抗老化和增白方面的效果更优异。

因此，本发明的一个目的在于提供一种化妆品组合物，该组合物含有淫羊藿苷的水解产物作为有效成分。

本发明的另一个目的在于提供一种制备淫羊藿苷的水解产物的方法，该淫羊藿苷的水解产物用作化妆品组合物的有效成分，该方法是通过使用酸、碱、酶、或能够生成酶的微生物对由淫羊藿属植物得到的淫羊藿苷进行水解。

为了实现上述目的，根据本发明的特征，提供了一种化妆品组合物，该组合物中含有淫羊藿苷的水解产物，该淫羊藿苷的水解产物如下式1所示：

式1

其中，R1为OH或吡喃鼠李糖，R2为OH或吡喃葡萄糖，且R1和R2不同时为吡喃鼠李糖或吡喃葡萄糖。

根据本发明，所述组合物是用于抗氧化、抗老化、增白或者抗皱效应的化妆品组合物。

本发明的化妆品组合物中含有的淫羊藿苷的水解产物是由包括如下步骤的方法制备得到的：(a)使用水或有机溶剂从含有淫羊藿苷的植物中得到提取物；和(b)使用酸、碱、酶、或能够生成酶的微生物对所述植物的提取物进行水解。

步骤(a)中的提取物是从淫羊藿属植物中提取得到的，所述有机溶剂可以为选自由乙醇、甲醇、丁醇、乙醚、乙酸乙酯和氯仿所组成的组中的至少一种，或者为它们与水的混合物，优选为80％的乙醇。

而且，步骤(b)中所用的酸可以为选自由盐酸、硫酸和硝酸所组成的组中的至少一种，或者为它们与由乙醇、甲醇和丁醇所组成的组中的至少一种的混合物。此处，酸的浓度为0.1-2N，醇溶剂混合物中醇的含量为10-50％。反应的温度为50-100℃，反应的时间为0.5-8小时。

步骤(b)中所用的碱可以为选自由氢氧化钠和氢氧化钾所组成的组中的至少一种，或者为它们与由乙醇、甲醇和丁醇所组成的组中的至少一种的混合物。此处，碱的浓度为0.1-2N，醇溶剂混合物中醇的含量为10-50％。反应的温度为50-100℃，反应的时间为0.5-24小时。

步骤(b)中所用的酶或能够生成酶的微生物可以为能够分解糖键的酶，或者为能够生成可分解糖键的酶的微生物。所述酶将淫羊藿苷中的糖部分去除掉，生成淫羊藿苷的水解产物。

所述酶可以为选自由葡萄糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、鼠李糖苷酶、木糖苷酶、纤维素酶、橙皮苷酶、柚皮苷酶、葡萄糖醛酸苷酶、果胶酶、半乳糖苷酶和淀粉葡糖苷酶所组成的组中的至少一种。并且，所述生成该酶的微生物可以为选自由曲霉菌属(Aspergillus genus)、芽孢杆菌属(Bacillus genus)、青霉菌属(Penicillium genus)、根霉菌属(Rhizopus genus)、根毛霉菌属(Rhizomucorgenus)、篮霉菌属(Talaromyes genus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、被孢霉菌属(Mortierella genus)、隐球菌属(Cryptococcus genus)和微杆菌属Microbacterium genus)所组成的组中的至少一种。

具体实施方式

所述淫羊藿苷和淫羊藿苷的水解产物，即淫羊藿素(icaritin)、淫羊藿次苷(icarisides)I和淫羊藿次苷II具有如下式所示的结构：

式1

下面，将对淫羊藿苷的水解产物的制备方法进行详细的描述。

在步骤(a)中，通过如下方法，使用水或有机溶剂从植物中得到含有淫羊藿苷的植物提取物。首先，将植物放置到1-6倍的水中，优选为3倍的水中，或者放置到选自由乙醇、甲醇、丁醇、乙醚、乙酸乙酯和氯仿所组成的组中的至少一种有机溶剂中，或者放置到它们与水的混合物中，在室温下搅拌1-5次，并脱脂。

然后将脱脂后的植物放入到约8倍的水或有机溶剂中，优选为约4倍的水或有机溶剂中，在回流下提取1-5次，并在10-20℃下沉降1-3天。

通过过滤和离心分离，将沉降物分离为残渣和滤液。将滤液在低压下进行浓缩，得到提取物。将该提取物悬浮在水中，并用乙醚脱色。将水层用丁醇提取1-5次，并将得到的有机溶液进行减压浓缩，得到丁醇提取物。将少量的甲醇加入该丁醇提取物中，并与大量乙酸乙酯混合。将得到的沉淀干燥，即得到淫羊藿苷。

在步骤(b)中，由步骤(a)得到的淫羊藿苷被酸、碱、酶或能够生成该酶的微生物水解，制得淫羊藿苷的水解产物。

此处，在使用酸水解的情况下，将所述植物的提取物与酸或者酸和醇的混合物进行混合，优选为50％的乙醇混合物；浓度为0.1-2N，优选为1N，在50-100℃的水浴中加热回流，优选为80℃，时间为1-48小时，优选为8小时，得到产物。

在使用碱水解的情况下，将所述植物的提取物与碱或者碱和醇的混合物进行混合，优选为50％的丁醇混合物；浓度为0.1-2N，优选为1N，在50-100℃的水浴中加热回流，优选为100℃，时间为1-48小时，优选为8小时，得到产物。

在使用酶水解的情况下，将所述植物的提取物溶解在5-20倍的酸性缓冲溶液中，优选为约10倍的酸性缓冲溶液中。将酶加入到该溶液中，在约37℃的水浴中搅拌约40-55小时，优选为48小时。当由薄层色谱法测得的底物的消失速率证明底物全部消失时，在热水(80-100℃)中加热5-15分钟结束水解反应，得到产物。

在使用能够生成酶的微生物水解的情况下，将所述植物的提取物溶解在5-10倍的电离水中，优选为约10倍的电离水中，在121℃下灭菌30分钟，冷却到约30℃，接种已经过培养的微生物，以溶液的总量为基准，微生物的接种量为5-10％，在30℃下培养2-5天，优选为5天。当由薄层色谱法测得的底物的消失速率证明底物全部消失时，在热水(80-100℃)中加热5-15分钟结束水解反应。将得到的培养液以5000-10000rpm的速率进行离心，用蒸馏水将沉淀洗涤3次，离心得到沉淀物，即为产物。

如上所述，对使用酸、碱、酶或能够生成酶的微生物水解得到的产物进行减压浓缩，以除去溶剂。将残渣加入到醇中，搅拌1-5次。过滤除去沉淀的盐，将滤液减压浓缩，以得到粗产品，将该粗产品用硅凝胶柱色谱法(氯仿∶甲醇＝8∶1至4∶1)进行分离，得到淫羊藿苷的水解产物。

根据本发明方法制备的淫羊藿苷的水解产物通过抑制1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)和活性氧(ROS)的生成而表现出优异的抗氧化效果，通过促进胶原蛋白的生物合成和抑制胶原酶的表达而表现出抗老化效果，和通过抑制黑色素的产生和改善由紫外线引起的色素沉淀而表现出增白效果。

因此，根据本发明，提供了一种用于抗氧化效应的化妆品组合物，其中该组合物含有淫羊藿苷的水解产物作为有效成分。

并且，根据本发明，提供了一种用于抗老化效应的化妆品组合物，其中该组合物含有淫羊藿苷的水解产物作为有效成分。

并且，根据本发明，提供了一种用于增白效应的化妆品组合物，其中，该组合物含有淫羊藿苷的水解产物作为有效成分。

并且，根据本发明，提供了一种用于改善皱纹效应的化妆品组合物，其中，该组合物含有淫羊藿苷的水解产物作为有效成分。

所述化妆品组合物可以被配制成化妆品组合物或者药物组合物，以组合物的总重量为基准，所述淫羊藿苷的水解产物的含量为0.0001-10重量％。所述组合物可以含有一种或多种淫羊藿苷的水解产物。

下面，将通过实施例对本发明进行更详细的描述。但是，应该理解的是，这些实施例只是为了解释本发明，本发明的范围并不限于此。

实施例1：淫羊藿苷的制备和鉴定

淫羊藿苷的制备

将2千克的朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)的干叶加入到6升己烷中，在室温下提取3次，同时搅拌，以除去脂肪。将1千克脱脂后的叶子加入到4升80％的甲醇中，回流提取3次，并在15℃下放置1天。然后，用滤布过滤并离心，将残渣和滤液分离。将滤液减压浓缩，以得到提取物。将提取物悬浮在水中，用1升乙醚提取5次，以除去颜料。用500毫升的1-丁醇将水层提取3次。将1-丁醇层合并，进行减压浓缩，以得到1-丁醇提取物。将该1-丁醇提取物溶解在少量乙醇中，并向其中加入大量的乙酸乙酯，以生成沉淀。将该沉淀干燥得到80克含有淫羊藿苷的朝鲜淫羊藿。

淫羊藿苷的鉴定

将20克实施例1制得的提取物，通过使用含有100克硅凝胶的硅凝胶柱色谱进行纯化。此处，使用氯仿和甲醇作为洗脱溶剂。通过从10∶1到2∶1增加氯仿和甲醇的比例，来得到不同组分，从中得到2.3克淫羊藿苷。该产物经过鉴定(Varian Gemini 2000 300MHz，Varian)，表现出如下特征。

淫羊藿苷的物理化学特性

形态：浅黄色微晶

阳性快原子轰击质谱(Positive FAB-MS)：677[M+H]

¹H NMR：(DMSO-d6)δ：0.81(3H，d，J＝6Hz，Rham-6)，1.61 & 1.69(6H，br s，Me-11)，ca 3.1-3.3(m)，3.33(1H，br d-like，ca 5)，ca 3.4-3.6(m)，ca 3.7-3.76(1H，m)，3.86(3H，s，OMe-4`)，4.01(1H，br，H2``)，5.00(1H，d，7.5，H1```)，5.19(1H，brt，7，H10)，5.30(1H，d，J＝1.5Hz，H1``)，6.64(1H，s，H6)，7.12(2H，d，9，H3`，5`)，7.89(2H，d，9，H2`，6`)，12.53(1H，s，OH-5).

¹³C-NMR：(DMSO-d6)δ：153.0，135.7，178.3，160.5，98.2，161.4，108.4，157.3，105.6，122.2，130.5，114.1，160.5，114.1，130.5，21.1，122.3，131.1，25.4，17.5，102.0，70.4，70.6，69.7，70.1，17.9，100.6，73.4，76.7，71.2，76.7，60.7，55.5.

酸性水解产物：淫羊藿素、葡萄糖、鼠李糖

实施例2：淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II的制备和鉴定

通过酸水解来制备淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II

将20克实施例1制备的提取物加入到20倍量(体积/重量)的1N的HCl-50％的甲醇溶液中(体积/体积)，并在80℃水浴中回流8小时，以使与淫羊藿苷结合的糖类水解。将反应产物减压浓缩，除去溶剂。将残渣加入到乙醇中(200毫升)，搅拌(3次)，并过滤，以除去沉淀的盐。将滤液减压浓缩，得到粗产品，然后通过硅凝胶柱色谱法(氯仿∶甲醇＝8∶1至4∶1)将粗产品分离，得到0.9克淫羊藿素，0.7克淫羊藿次苷I和0.5克淫羊藿次苷II。

通过碱水解来制备淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II

将20克实施例1制备的提取物加入到无水吡啶(500毫升)中，并向其中加入甲醇钠(粉末，10克)。将该溶液在80℃水浴中回流8小时，以使与淫羊藿苷结合的糖类水解。将反应产物减压浓缩，以除去溶剂。将残渣加入到乙醇中(200毫升)，搅拌(3次)，并过滤，以除去沉淀的盐。将滤液减压浓缩，得到粗产品，然后通过硅凝胶柱色谱(氯仿∶甲醇＝8∶1至4∶1)将粗产品分离，得到0.6克淫羊藿素，0.7克淫羊藿次苷I和0.8克淫羊藿次苷II。

通过酶水解来制备淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II

将20克实施例1制备的提取物加入到100毫升0.1M醋酸缓冲溶液中(pH 4.5)，并向其中加入2.5克酶(0.5克橙皮苷酶，0.5克柚皮苷酶，0.5克纤维酶，0.2克β-葡萄糖醛酸苷酶，0.5克β-半乳糖苷酶，0.3克葡萄糖苷酶，Sigma公司)。将该溶液在37℃水浴中搅拌48小时。当通过定时的薄层色谱法证实淫羊藿苷完全消失时，在热水(80-100℃)中加热10分钟结束反应。将反应产物减压浓缩，以除去溶剂。将残渣加入到乙醇中(200毫升)，搅拌(3次)，并过滤，以除去沉淀的盐。将滤液减压浓缩，得到粗产品，然后通过硅凝胶柱色谱(氯仿∶甲醇＝8∶1至4∶1)将粗产品分离，得到1.1克淫羊藿素，1.2克淫羊藿次苷I和0.9克淫羊藿次苷II。

通过微生物来制备淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II

将20克实施例1制备的提取物加入到去离子水中，在约121℃下灭菌30分钟，冷却到约30℃，向其中接种已经过培养的黑曲霉菌(Aspergillusniger)KCCM 11885，以溶液的总重量为基准，黑曲霉菌的接种量为5-10％，在30℃下培养5天，优选为5天。当通过定时的薄层色谱法证实淫羊藿苷完全消失时，反应结束。将得到的培养液以5000-10000rpm的速率进行离心。将沉淀物用蒸馏水洗涤3次，离心，得到沉淀物。将该沉淀物加入到乙醇中(200毫升)，搅拌(3次)，并过滤，以除去残渣。将滤液减压浓缩，得到粗产品，然后通过硅凝胶柱色谱(氯仿∶甲醇＝8∶1至4∶1)将粗产品分离，得到0.8克淫羊藿素，0.7克淫羊藿次苷I和0.8克淫羊藿次苷II。

淫羊藿次苷I的鉴定

将20克由酶水解制得的提取物，通过含有100克硅凝胶的硅凝胶柱色谱进行纯化。此处，使用氯仿和甲醇作为洗脱溶剂。通过从10∶1到2∶1增加氯仿和甲醇的比例，得到不同组分，从中得到1.8克淫羊藿次苷I。该产物经过鉴定(Varian Gemini 2000 300MHz，Varian)，表现出如下特征。

淫羊藿次苷I的物理化学特性

形态：浅黄色微晶

阳性快原子轰击质谱(Positive FAB-MS)：531[M+H]

¹H NMR：(DMSO-d6)δ：1.70，1.83(ea.3H，s，Me-4″，5″)，2.90(2H，H1″)，3.87(3H，s，OMe)，3.83-5.40(m，糖质子)，6.64(1H，s，H6)，7.16(2H，d，9，H3′，5′)，8.23(2H，d，9，H2′，6′).

¹³C-NMR：(DMSO-d6)δ：146.9，136.2，176.5，160.1，97.5，160.6，108.1152.7，104.5，123.4，129.3，114.1，158.5，114.1，129.3，21.5，122.3，131.1，25.4，17.9，100.5，73.4，76.7，69.7，77.2，60.7，55.4.

酸性水解产物：淫羊藿素、葡萄糖

淫羊藿次苷II的鉴定

将20克由酶水解制得的提取物，通过含有100克硅凝胶的硅凝胶柱色谱进行纯化。此处，使用氯仿和甲醇作为洗脱溶剂。通过从10∶1到2∶1增加氯仿和甲醇的比例，得到不同组分，从中得到1.5克淫羊藿次苷II。该产物经过鉴定(Varian Gemini 2000300MHz，Varian)，表现出如下特征。

淫羊藿次苷II的物理化学特性

形态：浅黄色微晶

阳性快原子轰击质谱(Positive FAB-MS)：515[M+H]

¹H NMR：(DMSO-d6)δ：0.79(3H，d，6，Me-5″)，1.63 & 1.68(6H，br s，Me-11)，3.03(1H，qd，6，9.5，H5″)，3.14(1H，dd，9，9.5，H4″)，ca 3.4(2H-9，与H2O的信号重叠)，3.47(1H，br，H3″)，3.85(3H，s，OMe-4′)，3.98(1H，br，H2″)，5.15(1H，br t，7，H10)，5.26(1H，d，1.5，HI″)，6.31(1H，s，10H6)，7.12(2H，d，9，H3′，5′)，7.86(2H，d，9，H2′，6′)，12.52(1H，s，OH-5).

¹³C-NMR：(DMSO-d6)δ：156.2，133.8，177.1，103.6，158.1，97.8，160.9，105.4，153.8，21.0，121.7，130.3，17.6，25.2，121.8，129.7，113.5，160.5，55.2，101.4，69.7，70.0，70.2，70.8，17.3.

酸性水解产物：淫羊藿素、鼠李糖

淫羊藿素的鉴定

将20克由酶水解制得的提取物，通过含有100克硅凝胶的硅凝胶柱色谱进行纯化。此处，使用氯仿和甲醇作为洗脱溶剂。通过从10∶1到2∶1增加氯仿和甲醇的比例，得到不同组分，从中得到2.4克淫羊藿素。该产物经过鉴定(Varian Gemini 2000 300MHz，Varian)，表现出如下特征。

淫羊藿素的物理化学特性

形态：浅黄色微晶

阳性快原子轰击质谱(Positive FAB-MS)：369[M+H]

¹H NMR：(DMSO-d6)δ：3.82(3H，s，OMe)，1.62(3H，s，Me-5″)，1.75(3H，s，Me-4″)，5.14(1H，t，6，H2″)，3.24(2H，d，6，H1″)，7.08(2H，d，8.7，H3′，5′)，8.10(2H，d，8.7，H2′，6′)，6.27(1H，s，H6).

实验实施例1：淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II的抗氧化效果检测(DPPH检测)

使用通过由减少有机自由基DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)(当抗氧化剂被氧化时)而引起的吸收改变，来评价抗氧化效果的方法。当DPPH的氧化被抑制的时候，吸收会降低，测量与对照相比的吸收的改变。在某一浓度下吸收为对照的50％或者更低，则定义该浓度为有效的抗氧化浓度。

将190微升的100μM的DPPH(乙醇)溶液和10微升由实施例1-2鉴定出的淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II和淫羊藿素，和对照样品混合，形成反应物，然后让该反应物在37℃下反应30分钟。在540纳米处检测吸收。所述对照样品为普遍使用的合成的水溶性维生素E(Trolox)抗氧化剂。

各物质的DPPH分析结果如表1所示。

表1：DPPH分析(抑制％)

(IC50：通过加入各种物质，在吸收降为50％时的浓度)

如表1所示，与淫羊藿苷相比，本发明的淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II表现出更高的活性，甚至与水溶性维生素E(Trolox)相比也表现出了更好的抗氧化效果。

实验实施例2：通过荧光材料来检测淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对活性氧(ROS)的抑制效果

本测试用的细胞株为人角质化细胞HaCaT细胞株。以每个孔中2.0×10⁴个细胞的量，将该细胞分布在96孔黑色板中，进行荧光测试，并在添加有青霉素/链霉素的DMEM(达尔伯克改良的伊格尔培养基，胎牛血清(FBS)10％)中在37℃、5％CO₂的条件下培养1天，然后用测试样品进行处理。表2所示的添加有青霉素/链霉素的不含血清的DMEM(不含FBS)用于对经过样品处理过的培养基进行培养。在37℃，5％CO₂条件下培养1天。

与测试样品一起培养24小时之后，用氢化可的松琥珀酸钠溶液(HCSS)(羟乙基哌嗪乙磺酸-缓冲的对照盐溶液)洗涤该培养板以除去培养基，用100微升20μM的DCFH-DA(2′，7′-二氯二氢-醋酸荧光素，分子探针公司)处理该HCSS。然后，将该培养板在37℃，5％CO₂条件下放置20分钟，并用HCSS洗涤。接下来，使用100微升的含有不同浓度的样品的HCSS，对该培养板进行处理，通过荧光板阅读器(Ex＝485nm，Em＝530nm)测量在早期被氧化成ROS的DFC(二氯荧光黄)的荧光强度。在UVB(30毫焦/平方厘米)激发后立即用荧光板阅读器(激发波长(Ex)＝485nm，发射波长(Em)＝530nm)测量荧光，或者激发3小时后测量。

水溶性维生素E(Trolox)被用作对照样品。

每个测试样品对ROS生成的抑制效果的结果如表2所示。

表2：对ROS产品的抑制效果(对照％)

浓度(μM)	淫羊藿苷	淫羊藿次苷I	淫羊藿次苷II	淫羊藿素	Trolox
浓度(μM)	淫羊藿苷	淫羊藿次苷I	淫羊藿次苷II	淫羊藿素	Trolox	50	86.3	43.8	46.6	43.2	58.5
25	88.6	54.8	56.6	51.7	73.3	50	86.3	43.8	46.6	43.2	58.5
25	88.6	54.8	56.6	51.7	73.3	12.5	89.7	61.4	62.0	61.5	74.6
6.25	98.1	65.6	63.2	68.2	76.9	12.5	89.7	61.4	62.0	61.5	74.6

如表2所示，和淫羊藿苷相比，本发明的淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对表现出更高的活性，甚至和Trolox相比也表现出了更好的抑制ROS生成的效果。

实验实施例3：淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对胶原蛋白生物合成的促进效果

比较实施例1-2鉴定的淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II与生育酚和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对胶原蛋白生物合成的促进作用。

首先，将成纤维细胞(PromoCell公司，德国)以每个孔中10⁵水平的接种量，接种在24孔板中进行培养，直到它们长到90％。将该细胞在不含血清的DMEM中培养24小时，使用以10^-4的摩尔浓度溶解在不含血清的培养基中的实施例1-2鉴定的淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II和淫羊藿素以及生育酚和EGCG进行处理，并在CO₂介质中培养24小时。取上清液，用原骨胶原(I)型酶联免疫吸附试剂盒(过程/；胶原(I)型)检查胶原蛋白的增加和减少。将合成量与未处理组的100进行比较，结果列于表3。

表3

如表3所示，和淫羊藿苷相比，本发明的淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对更进一步地促进了胶原蛋白的生物合成，甚至比阳性对照的效果还好。

实验实施例4：淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对胶原酶表达的抑制作用

按照如下方法比较实施例1-2鉴定的淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II与生育酚和EGCG对胶原酶表达的抑制作用。

首先，将人类成纤维细胞以每孔5000个细胞的量，接种在一个含有添加了2.5％胎牛血清的DMEM的96孔板中进行培养，直到它们长到90％。将该细胞在不含血清的DMEM中培养24小时，使用以10^-4的摩尔浓度溶解在不含血清的培养基中的作为测试材料的实施例1-2鉴定的淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II和淫羊藿素以及生育酚和EGCG进行处理，并培养24小时，取培养液。

然后，使用商购的胶原酶测试试剂盒(Amorsham pharmacia，USA)，测试该培养液中胶原酶的生成。

首先，将得到的细胞培养液加入到具有初始胶原酶抗体的96孔板中，并使之在恒温箱中进行3小时的抗原-抗体反应。3小时后，向该96孔板中加入结合有载色体的二级胶原抗体，并使之反应15分钟。15分钟后，向其中加入显色剂并放置15分钟。然后，向其中加入1M的硫酸以加速反应(显色)，这会使反应产物的颜色变为黄色。黄色的程度根据反应的进展而不同。

使用分光光度计在405nm处，测量该96孔板对黄色的吸光度。用下面的公式I计算胶原酶的表达。此处，对照的吸光度为未经测试物质处理过的组中取出的细胞培养液的吸光度。

公式I

胶原酶的表达(％)＝(A/B)×100

(A：用测试物质处理过的细胞的吸光度

B：对照的吸光度)

同时，测试物质对人成纤维细胞中胶原酶表达的抑制作用的测试结果如表4所示，其中，将该胶原酶的表达与未处理组的100进行比较。

表4

如表4所示，本发明的淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II能够有效地抑制胶原酶的表达。

实验实施例5：淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对弹性蛋白酶表达的抑制作用

按照如下方法比较实施例1-2鉴定的淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II与生育酚和EGCG对弹性蛋白酶表达的抑制作用。

首先，将人类成纤维细胞以每孔5000个细胞的量，接种在一个含有添加了2.5％胎牛血清的DMEM的96孔板中进行培养，直到它们长到90％。将该细胞在不含血清的DMEM中培养24小时，使用以10^-4的摩尔浓度溶解在不含血清的培养基中的作为测试材料的实施例1-2鉴定的淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II和淫羊藿素以及生育酚和EGCG进行处理，并培养24小时取培养液。

然后，用商购的弹性蛋白酶测试试剂盒(Amorsham pharmacia，USA)测试该培养液中弹性蛋白酶的生成。

首先，将得到的细胞培养液加入到具有初始弹性蛋白酶抗体的96孔板中，并使之在恒温箱中进行3小时的抗原-抗体反应。3小时后，向该96孔板中加入结合有载色体的二级胶原抗体，并使之反应15分钟。15分钟后，向其中加入显色剂并放置15分钟。然后，向其中加入1M的硫酸以加速反应(显色)，这会使反应产物的颜色变为黄色。黄色的程度根据反应的进展而不同。

使用分光光度计在405nm处，测量该96孔板对黄色的吸光度。用下面的公式II计算弹性蛋白酶的表达。此处，对照的吸光度为未经过测试物质处理过的组中取出的细胞培养液的吸光度。

公式II

I酶的表达(％)＝(A/B)×100

(A：用测试物质处理过的细胞的吸光度

B：对照的吸光度)

同时，测试物质对人成纤维细胞中弹性蛋白酶表达的抑制作用的测试结果如表5所示，其中，将该弹性蛋白酶的表达与未处理组的100进行比较。

表5

如表5所示，本发明的淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II能够有效地抑制弹性蛋白酶的表达。

实验实施例6：使用鼠色素细胞测试淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对黑色素合成的抑制作用

为了检验实施例1-2鉴定的淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对黑色素合成的抑制作用，使用了鼠色素细胞。

首先，在37℃，5％CO₂条件下，在添加有10％胎牛血清、100nM的2-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯、和1nM的霍乱毒素的DMEM中培养源自C57BL/6鼠(Dooley，T.P.等，Skin pharmacol，7，pp 188-200)的鼠色素细胞(Mel-Ab)。将培养的Mel-Ab细胞用0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸进行分离，并以10⁵的浓度(细胞/孔)在24孔板上培养。两天后，连续3天加入各种测试物质：对苯二酚、在实施例1和2中鉴定的淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II和淫羊藿素，并进行培养。此处，对苯二酚为阳性对照。然后，除去培养液，并用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤。用1N的氢氧化钠将细胞溶解，在400nm处测量吸光度。用下面的公式III计算对黑色素合成的抑制率，结果如表6所示(多利法(Dooley’s method))。

公式III

对黑色素合成的抑制率(％)＝100-{(各测试组的吸光度/对照组的吸光度)×100}

表6

如表6所示，与由实施例1鉴定的淫羊藿苷相比，本发明实施例1和2制备的淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对黑色素的合成表现出更优异的抑制作用。特别地，淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II表现出与对苯二酚相似的对黑色素合成的抑制作用。

实验实施例7：淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对人体皮肤增白效果的测试

下面的实施用于检验由实施例1-2鉴定的淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对人体皮肤的增白效果。

首先，征集12名健康男性进行测试。在他们的胳膊上部粘有一个具有1.5厘米的孔的不透明胶带。照射比最小红斑量大1.5-2倍的紫外线以使皮肤颜色变深。

紫外线照射之后，向该皮肤施用1％的淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II和淫羊藿素(溶剂：1，3-二丁醇∶乙醇＝7∶3)，1％的对苯二酚，1％的溶剂(赋形剂)(阴性对照)，其它部分上不施用任何物质。10周后，观察变化。每1周，用比色计CR2002(日本，美能达)测量皮肤的颜色。

然后，根据下面的公式计算当开始施用测试物质时，该点的皮肤颜色和结束施用测试物质之后该点的皮肤颜色之间的差别(ΔL^*)，结果列于表7。同时，通过对样品施用部分和对照施用部分的ΔL^*进行比较，来测试增白效果。当ΔL^*的值约为2时，对色素沉积的增白效果明显。当ΔL^*的值大于1.5时，就认为样品具有增白效果。

公式4

ΔL^*＝(当施用结束时该点的L^*)-(当施用开始时该点的L^*)

表7

如表7所示，由本发明实施例1-2制备的淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II和淫羊藿素表现出与对苯二酚相似的增亮皮肤的作用。这是因为上述物质能够改善由紫外线产生的色素沉积，并增亮皮肤的颜色。

下面，通过下面的制剂实施例来说明本发明的组合物的制剂。然而，应该理解的是，这些实施例只是为了说明本发明，本发明的范围并不限于此。

制剂实施例1：肥皂的制备

表8

按照所述混合比例，各种组分与纯水混合，以使总重量为100。

制剂实施例2：洗液的制备

表9

制剂实施例3：乳膏的制备

表10

制剂实施例4：美容涂敷剂的制备

表11

制剂实施例5：化妆液的制备

表12

按照所述混合比例，各种成分与纯水混合，以使总重量为100。

制剂实施例6：分散体的制备

表13

将上述组分混合并装入气密性袋中。

制剂实施例7：片剂的制备

表14

上述组分根据常规使用的制备片剂的方法进行混合。

制剂实施例8：胶囊的制备

表15

按照常规使用的制备胶囊的方法将上述组分进行混合，并填充入明胶胶囊中。

制剂实施例9：注射溶液的制备

表16

按照常规使用的制备注射溶液的方法，将上述组分进行混合制得一个制剂(2毫升)。

制剂实施例10：溶液的制备

表17

按照常规使用的制备溶液的方法，将上述组分溶解在纯化水中。加入柠檬香后，将这些组分混合，并向混合物中加入纯化水使总体积为100毫升。将得到的溶液加入至琥珀瓶中。

如上所述，证明了所述含有通过使用酸、碱、酶、或能够生成酶的微生物将淫羊藿苷水解而制得的淫羊藿苷的水解产物的化妆品组合物，具有抑制DPPH和ROS生成的抗氧化效果，并且通过促进胶原蛋白的生物合成，而具有抗老化效果，通过抑制胶原酶和弹性蛋白酶表达，和通过抑制黑色素生成和改善由紫外线引起的色素沉积，而具有增白效果，所述淫羊藿苷是从淫羊藿属植物中提取得到的类黄酮成分。因此，本发明的淫羊藿苷的水解产物可以用作具有抗氧化、抗老化、增白和抗皱效果的化妆品组合物或者药物组合物。

Claims

1、一种化妆品组合物，该组合物含有淫羊藿苷的水解产物，该淫羊藿苷的水解产物如式1所示：

式1

2、根据权利要求1所述的组合物，其中，该组合物用于抗氧化效应。

3、根据权利要求1所述的组合物，其中，该组合物用于抗老化效应。

4、根据权利要求1所述的组合物，其中，该组合物用于增白效应。

5、根据权利要求1所述的组合物，其中，该组合物用于改善皱纹。

6、根据权利要求1所述的组合物，其中，所述淫羊藿苷的水解产物是由包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)使用水或有机溶剂从含有淫羊藿苷的植物中得到提取物；和

(b)使用酸、碱、酶、或能够生成酶的微生物对所述植物的提取物进行水解。

7、根据权利要求6所述的组合物，其中，所述步骤(a)中的提取物是从淫羊藿属植物中提取得到的。

8、根据权利要求6所述的组合物，其中，所述步骤(b)中的酸为选自由盐酸、硫酸和硝酸所组成的组中的至少一种，或者为它们与选自由乙醇、甲醇和丁醇所组成的组中的至少一种的混合物。

9、根据权利要求6所述的组合物，其中，所述步骤(b)中的碱为选自由氢氧化钠和氢氧化钾所组成的组中的至少一种，或者为它们与选自由乙醇、甲醇和丁醇所组成的组中的至少一种的混合物。

10、根据权利要求6所述的组合物，其中，所述步骤(b)中的酶为选自由葡萄糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、鼠李糖苷酶、木糖苷酶、纤维素酶、橙皮苷酶、柚皮苷酶、葡萄糖醛酸苷酶、果胶酶、半乳糖苷酶、和淀粉葡糖苷酶所组成的组中的至少一种。

11、根据权利要求6所述的组合物，其中，所述步骤(b)中的微生物为选自由曲霉菌属(Aspergillus genus)、芽孢杆菌属(Bacillus genus)、青霉菌属(Penicillium genus)、根霉菌属(Rhizopus genus)、根毛霉菌属(Rhizomucorgenus)、篮霉菌属(Talaromyes genus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、被孢霉菌属(Mortierella genus)、隐球菌属(Cryptococcus genus)、和微杆菌属Microbacterium genus)所组成的组中的至少一种。