CN105407895B - 含有来源于绿茶种子的21-o-当归酰茶皂醇e3成分的用于抗老化的皮肤外用剂组合物 - Google Patents

含有来源于绿茶种子的21-o-当归酰茶皂醇e3成分的用于抗老化的皮肤外用剂组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含有来源于绿茶种子的21‑O‑当归酰茶皂醇E3成分作为有效成分的用于抗老化的皮肤外用剂组合物，更详细地，涉及一种改善皱纹及皮肤弹力提高效果优异的用于抗老化的皮肤外用剂组合物，所述皮肤外用剂组合物含有来源于绿茶种子的21‑O‑当归酰茶皂醇E3成分作为有效成分，所述21‑O‑当归酰茶皂醇E3成分是通过利用酸、碱、酶或生产所述酶的微生物的分解反应来从绿茶种子提取物中得到的。

Description

含有来源于绿茶种子的21-O-当归酰茶皂醇E3成分的用于抗 老化的皮肤外用剂组合物
技术领域
本发明涉及一种含有来源于绿茶种子的21-O-当归酰茶皂醇E3成分作为有效成分的用于抗老化的皮肤外用剂组合物，更详细地，涉及一种改善皱纹及皮肤弹力提高效果优异的用于抗老化的皮肤外用剂组合物，所述皮肤外用剂组合物含有来源于绿茶种子的21-O-当归酰茶皂醇E3成分作为有效成分，所述21-O-当归酰茶皂醇E3成分是通过利用酸、碱、酶或生产所述酶的微生物的分解反应来从绿茶种子提取物中得到的。
背景技术
皮肤的老化根据其因素可以大体分为两种。作为其中之一的自然衰老(Intrinsicaging)是皮肤的结构和生理功能随年龄的增加而引起的持续性的减退，作为另一种的外因性老化(Extrinsic aging)是因太阳光线等累积的外部压力而产生的。尤其是太阳光的紫外线(ultr aviolet rays；UV)作为众所周知的老化原因的一种，皮肤长时间暴露在紫外线下时，其角质层会变厚，并且作为皮肤的主要组成因素的胶原蛋白和弹性蛋白会变性，从而逐渐失去皮肤的弹力性。
另外，皮肤的弹力由真皮组织的细胞外基质(ECM；extracelluar matrix)成分来负责，ECM大体由两种成分组成。一个是在总ECM中约占2～4％的弹性纤维(elasticfiber)，另一个是在总ECM中约占70～80％的胶原蛋白。弹性纤维呈以下形态。所述形态为在被称为弹性蛋白(elastin)的无定形基质上镶嵌有微纤维(microfibrils)的形态。弹性蛋白是由非常独特的氨基酸组成的蛋白质，所述非常独特的氨基酸只能在来源于赖氨酸的锁链素(desmosine)和被称为异锁链素(isodesmosine)的弹性纤维中找到。这些锁链素和异锁链素等在长肽链中形成交联(cross-links)，这种结构使弹性蛋白具有与橡胶相同的性质。
此外，由弹性蛋白组成的弹力纤维与被称为胶原蛋白(collagen)的胶原纤维一起存在，在弹性蛋白和胶原蛋白充分存在的状态下，能够实现维持皮肤弹力。
皮肤弹力的降低是由老化或紫外线等引起的胶原蛋白和弹性蛋白的生成的降低或破坏所导致的。尤其是诸如胶原酶(collagenase)和弹性蛋白酶(elastase)等的基质金属蛋白酶(matrix metallo prote ase)的表达使皮肤内正常生成的胶原蛋白和弹性蛋白被分解，从而导致皮肤弹力降低。
以抑制这种成为弹力下降的原因的胶原蛋白及弹性蛋白的减少为目的，开发并使用了各种物质，其中，视黄醇和视黄酸等的类视黄醇显示出弹性改善效果(Dermatologytherapy，1998，16，357～364)，从豆科种子(Leguminosae Seeds)中得到的蛋白质级分也显示出弹力增大效果(美国专利第5,322,839号)，包含麦芽提取物(malt ex tract)等的组合物被应用于抑制胶原酶(日本特制第5,105,693号)。
然而，这些类视黄醇具有即使以少量用于皮肤也会产生刺激的缺点，大部分来源于天然物的原料一直以简单提取物的形态使用，并且没有确认该提取物显示出的功效确切是由何种物质所带来的，因此难以持续维持并控制该提取物的活性。
发明内容
要解决的技术问题
对此，本发明人为了寻找显示出抗老化效果的同时，还显示出优异的皮肤弹力提高效果的物质而进行研究的结果，确认了通过利用酸、碱、酶或生成所述酶的微生物的分解反应来从绿茶种子提取物中获得的21-O-当归酰茶皂醇E3成分具有优异的皮肤改善皱纹及提高皮肤弹力的效果，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种用于抗老化的皮肤外用剂组合物，所述皮肤外用剂组合物含有从绿茶种子提取物中得到的21-O-当归酰茶皂醇E3成分。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种含有21-O-当归酰茶皂醇E3作为有效成分的皮肤外用剂组合物。
有益效果
本发明中使用的来源于绿茶种子的21-O-当归酰茶皂醇E3促进胶原蛋白生物合成的同时，还抑制弹性蛋白酶及胶原酶的表达，从而有效改善皮肤皱纹，并且提高皮肤弹力，因此能够提供优异的抗老化效果。
最佳实施方式
本发明提供一种含有下述化学式1所示的21-O-当归酰茶皂醇E3(21-O-angeloyltheasapogenol E3)作为有效成分的皮肤外用剂组合物：
化学式1
优选地，所述21-O-当归酰茶皂醇E3来源于绿茶种子。
本发明中使用的21-O-当归酰茶皂醇E3可以通过以下方法来制备，所述方法包括：第一步骤，利用水或有机溶剂从植物中获取皂苷粗提取物；以及第二步骤，利用酸、碱、酶或生产所述酶的微生物来水解所述提取物，从而分离21-O-当归酰茶皂醇E3。
第一步骤：皂苷粗提取物的获取
从植物中获得皂苷粗提取物，尤其是从绿茶种子中得到皂苷粗提取物。这时，作为提取溶剂，可以使用水或有机溶剂，作为有机溶剂，可以使用选自乙醇、甲醇、丁醇、醚(ether)、乙酸乙酯及氯仿中的一种以上的有机溶剂或它们和水的混合物，优选使用50％乙醇。
为了利用水或有机溶剂来从植物中获取皂苷粗提取物，在植物中加入约1至6倍的水或有机溶剂，优选加入约3倍的水或有机溶剂，并在常温下搅拌并提取1至5次而使植物脱脂。在脱脂的植物中加入约1至8倍的水或有机溶剂，优选加入约4倍的水或有机溶剂，并进行回流提取1至5次后，在10至20℃下沉淀1至3天。然后，通过过滤和离心分离来分离残渣和滤液，然后将通过对分离的滤液进行减压浓缩而得到的榨取物悬浮于水中后，利用醚(ether)来去除色素。使用有机溶剂来提取水层1至5次后，对获取的有机溶剂层进行减压浓缩，从而得到有机溶剂榨取物，然后将其溶解于少量的甲醇、乙醇、丙醇及丁醇等中。然后，添加大量的乙酸乙酯及乙腈(acetonitrile)等来生成沉淀物，然后干燥该沉淀物，从而能够获取本发明的皂苷粗提取物。
第二步骤：21-O-当归酰茶皂醇E3的分离
使从所述第一步骤中获取的皂苷粗提取物进行水解，从而能够分离21-O-当归酰茶皂醇E3。水解可以通过利用酸、碱、酶或生产所述酶的微生物来实施。
所述酸可以使用选自盐酸、硫酸及硝酸中的一种以上的酸，或者这些酸和选自乙醇、甲醇及丁醇中的一种以上的醇的混合溶剂，优选使用这些酸与50％乙醇的混合溶剂。
当利用酸进行水解时，在皂苷粗提取物中，添加0.1～2N浓度的酸，优选添加1N浓度的酸，或者添加1～10％的酸和醇的混合溶剂后，在50～100℃的水浴槽中，优选在80℃的水浴槽中进行加热回流0.5～8小时，优选进行1小时。
所述碱可以使用选自甲氧基钠、氢氧化钠及氢氧化钾中的一种以上的碱，或者这些碱和选自乙醇、甲醇及丁醇中的一种以上的醇的混合溶剂，优选使用这些碱与50％丁醇的混合溶剂。
当利用碱进行水解时，将皂苷粗提取物溶解于水或水和乙醇的混合溶剂后，添加0.1～2N浓度的碱，优选添加1N浓度的碱，或者添加1～10％的碱和醇的混合溶剂后，在50～100℃的水浴槽中，优选在100℃的水浴槽中进行加热回流0.5～24小时，优选进行12小时。
所述酶为分解糖苷键的酶，其特征为，通过去除绿茶皂苷的糖部分，从而生成21-O-当归酰茶皂醇E3。此酶可以使用商业上出售的酶，或者根据需要制备而使用，尤其，可以从生产所述酶的微生物中得到。
另外，更优选地，所述酶可以使用选自葡糖苷酶(glucosidase)、阿拉伯糖苷酶(arabinosidase)、鼠李糖苷酶(rhamnosidase)、木糖苷酶(xylosidase)、纤维素酶(cellulase)、橘皮苷酶(hesperidinas e)、柚皮苷酶(naringinase)、葡萄糖醛酸酶(glucuronidase)、果胶酶(pectinase)、半乳糖苷酶(galactosidase)及淀粉葡糖苷酶(amyloglucosidase)中的一种以上。
另外，生产所述酶的微生物可以使用选自曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、青霉菌属(Penicillium)、根酶属(Rhizop us)、根毛酶属(Rhizomucor)、踝节菌属(Talaromyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、被孢霉属(Mortierella)、隐球菌属(Cry ptococcus)、细杆菌属(Microbacterium)、明串珠菌属(Leuconost oc)及乳杆菌属(Lactobacillus)中的一种以上。
当利用酶进行水解时，将皂苷粗提取物溶解于5至20倍的酸性缓冲溶液中，优选溶解于约10倍的酸性缓冲溶液中后，添加0.001～10％的酶。将其在约25～37℃的水浴槽中进行搅拌约40至55小时，优选搅拌约48小时，同时用薄层色谱法确认底物的消除率，待底物完全消失时，在热水(80～100℃)中进行加热5至15分钟并结束反应。
当利用微生物进行水解时，将皂苷粗提取物溶解于5至10倍的离子水中，优选溶解于约10倍的离子水中，然后在121℃下进行灭菌30分钟，并冷却至30℃。然后，接种以液体量计为5～10重量％的预培养的微生物，并在20～30℃下培养2至5天，优选培养5天，然后，用薄层色谱法确认底物的消除率，待底物完全消失时，以5,000～10,000转数/分(rpm)的转速，对培养液进行离心分离而回收的沉淀物用蒸馏水清洗3次后，进行离心分离，从而得到沉淀物。
如上所述，利用酸、碱、酶或生产所述酶的微生物进行水解后，对反应液进行减压浓缩，从而去除溶剂，并且在残渣中加入醇并搅拌1～5次。然后，通过过滤来去除沉淀的盐，然后对过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)分离获取的粗生成物，从而能够获取21-O-当归酰茶皂醇E3。
本发明的组合物含有以组合物总重量计为0.000001～5重量％的通过如上所述的方法制备的21-O-当归酰茶皂醇E3。如果含量少于0.000001重量％，则不能得到由所述成分带来的改善皱纹及皮肤弹力效果，即使含量超过5重量％，效果的增加相对于含量的增加并不大。
本发明的组合物可以作为用于抗老化的组合物使用，所述组合物促进胶原蛋白的生物合成，抑制弹性蛋白酶及胶原酶的表达，通过这两种活性的复合上升作用，从而能够提供更优异的皮肤弹力提高效果及皮肤皱纹改善效果。
本发明的组合物可以含有化妆品学或皮肤科学上可接受的介质或基材而被剂型化。所述组合物可以以适合局部使用的全部剂型来提供，例如，可以以溶液、凝胶、固体、糊状无水生成物、将油相分散于水相而获得的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微细颗粒球或离子型(脂质体)及非离子型小囊分散剂的形态，或者以霜、化妆水、洗剂、粉、软膏、喷雾剂或遮瑕棒的形态提供。另外，可以以泡沫(f oam)形态或进一步包含压缩的推进剂的气雾剂组合物的形态使用。这些组合物可以根据本领域常用的方法制得。
另外，本发明的组合物可以含有脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(f oaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、螯合剂、络合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质小囊，或者诸如在化妆品中通常使用的任一其它成分的在化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的辅助剂。所述辅助剂以在化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的量导入。
另外，本发明的组合物，为了增加皮肤老化改善效果，可以含有促进皮肤吸收的物质。
具体实施方式
以下，将通过实施例及试验例更详细地说明本发明，然而，本发明并不限定于这些例。
[实施例1]绿茶种子提取物的制备
在2kg的绿茶种子中加入6L的己烷，并且在常温下搅拌并提取3次而使绿茶种子脱脂后，在1kg的脱脂的绿茶种子中加入4L的50％乙醇，并进行回流提取3次后，在15℃下沉淀1天。然后，通过滤布过滤和离心分离来分离残渣和滤液，然后将通过对分离的滤液进行减压浓缩而得到的榨取物悬浮于水中后，利用1L的乙醚提取5次而去除色素，并且用500ml的1-丁醇来提取水层3次。对由此得到的整体1-丁醇层进行减压浓缩，从而得到1-丁醇榨取物，然后将其溶解于少量的甲醇后，添加到大量的乙酸乙酯中而生成沉淀物，然后干燥该沉淀物，从而获取300g的绿茶种子提取物(皂苷粗提取物)。
[实施例2]通过酸水解方法的21-O-当归酰茶皂醇E3的制备
[2-1]在10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物中加入20倍(v/w)的1NHCl-50％甲醇溶液(v/v)，并在80℃的水浴槽中进行加热回流8小时，从而使结合在绿茶种子粗皂苷的糖进行水解。对反应液进行减压浓缩，从而去除溶剂，然后在残渣中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀的盐。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝7:1～3:1)来对获得的粗生成物进行分离，从而获取0.55g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[2-2]在10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物中加入20倍(v/w)的1MH2SO4-30％水溶液(v/v)，并在90℃的水浴槽中进行加热回流8小时，从而使结合在绿茶种子粗皂苷的糖进行水解。对反应液进行减压浓缩，从而去除溶剂，然后在残渣中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀的盐。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝7:1～3:1)来对获得的粗生成物进行分离，从而获取0.59g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[2-3]在10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物中加入20倍(v/w)的1MHNO3-10％水溶液(v/v)，并在90℃的水浴槽中进行加热回流8小时，从而使结合在绿茶种子粗皂苷上的糖进行水解。对反应液进行减压浓缩，从而去除溶剂，然后在残渣中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀的盐。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝7:1～3:1)来对获得的粗生成物进行分离，从而获取0.39g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[实施例3]通过碱水解方法的21-O-当归酰茶皂醇E3的制备
[3-1]将10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物溶解于干燥吡啶(500ml)中，然后在其中加入甲氧基钠(sodium methoxid e)(粉末，10g)，并在油浴中进行加热回流8小时，从而使结合在绿茶种子皂苷的糖进行水解。对反应液进行减压浓缩，从而去除溶剂，并且用精制水清洗3次后，通过过滤来获取过滤物，并且在残渣中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀的盐。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获得粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获得的粗生成物进行分离，从而获取0.35g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[3-2]在10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物中加入20倍(v/w)的1MNaOH-20％水溶液(v/v)，并在80℃下进行加热回流8小时，从而使结合在绿茶种子粗皂苷的糖进行水解。对反应液进行减压浓缩，从而去除溶剂，并且用精制水清洗3次后，通过过滤来获取过滤物，并且在残渣中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀的盐。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获取的粗生成物进行分离，从而获取0.31g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[3-3]在10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物中加入20倍(v/w)的1MKOH-20％水溶液(v/v)，并在80℃下进行加热回流8小时，从而使结合在绿茶种子粗皂苷的糖进行水解。对反应液进行减压浓缩，从而去除溶剂，并且用精制水清洗3次后，通过过滤来获取过滤物，并且在残渣中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀的盐。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获取的粗生成物进行分离，从而获取0.25g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[实施例4]通过酶分解方法的21-O-当归酰茶皂醇E3的制备
[4-1]将10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物溶解于100ml的0.1M醋酸缓冲溶液(pH4.5)中，然后在其中添加2.5g的酶(0.5g的橘皮苷酶、0.5g的柚皮苷酶、0.5g的纤维素酶、0.2g的β-葡萄糖醛酸酶、0.5g的β-半乳糖苷酶、0.3g的淀粉转葡糖苷酶；西格玛公司制造)，并在37℃的水浴中搅拌48小时，同时用薄层色谱法来进行周期性确认，待绿茶皂苷消失时，在热水(80～100℃)中加热10分钟并结束反应。对反应液进行减压浓缩，从而去除溶剂，并且在残渣中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀物。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获取的粗生成物进行分离，从而获得1.02g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[4-2]将10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物溶解于100ml的0.1M醋酸缓冲溶液(pH6.5)中，然后在其中添加3.5g的酶(1g的葡糖苷酶、0.5g的阿拉伯糖苷酶、1g的鼠李糖苷酶、0.5g的木糖苷酶、0.5g的果胶酶)，并在27℃的水浴中搅拌48小时，同时用薄层色谱法来进行周期性确认，待绿茶皂苷消失时，在热水(80～100℃)中加热10分钟并结束反应。对反应液进行减压浓缩，从而去除溶剂，并且在残渣中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀物。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获取的粗生成物进行分离，从而获得1.53g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[实施例5]利用微生物的21-O-当归酰茶皂醇E3的制备
[5-1]将10g的从所述实施例1中获得的绿茶种子提取物溶解于100ml的离子水中，然后在121℃下进行灭菌30分钟，并冷却至30℃。然后，接种以液体量计为5～10％的预培养的黑曲霉(Aspergillus nige r)KCCM11885，并在30℃下培养5天后，用薄层色谱法确认底物的消除率，待确认底物完全消失后，以5,000～10,000转数/分的转速，对培养液进行离心分离而回收的沉淀物用蒸馏水清洗3次后，进行离心分离，从而得到沉淀物。在该沉淀物中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀物。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获得的粗生成物进行分离，从而获得0.72g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[5-2]将10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物溶解于100ml的离子水中，然后在121℃下进行灭菌30分钟，并冷却至27℃。然后，接种以液体量计为5～10％的预培养的米根霉(Rhizopus oryza e)，并在27℃下培养5天后，用薄层色谱法确认底物的消除率，待确认底物完全消失后，以5,000～10,000转数/分的转速，对培养液进行离心分离而回收的沉淀物用蒸馏水清洗3次后，进行离心分离，从而得到沉淀物。在该沉淀物中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀物。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获取的粗生成物进行分离，从而获得0.92g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[5-3]将10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物溶解于100ml的离子水中，然后在121℃下进行灭菌30分钟，并冷却至27℃。然后，接种以液体量计为5～10％的预培养的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并在27℃下培养2天后，用薄层色谱法确认底物的消除率，待确认底物完全消失后，以5,000～10,000转数/分的转速，对培养液进行离心分离而回收的沉淀物用蒸馏水清洗3次后，进行离心分离，从而得到沉淀物。在该沉淀物中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀物。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获得的粗生成物进行分离，从而获得0.72g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[5-4]将10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物溶解于100ml的离子水中，然后在121℃下进行灭菌30分钟，并冷却至27℃。然后，接种以液体量计为5～10％的预培养的肠膜明串珠菌(Leucono stoc mesenteroides)，并在27℃下培养2天后，用薄层色谱法确认底物的消除率，待确认底物完全消失后，以5,000～10,000转数/分的转速，对培养液进行离心分离而回收的沉淀物用蒸馏水清洗3次后，进行离心分离，从而得到沉淀物。在该沉淀物中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀物。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获取的粗生成物进行分离，从而获得0.52g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[5-5]将10g的从所述实施例1中获取的绿茶种子提取物溶解于100ml的离子水中，然后在121℃下进行灭菌30分钟，并冷却至27℃。然后，接种以液体量计为5～10％的预培养的长双岐杆菌(Bifidobacte rium longum)，并在27℃下培养2天后，用薄层色谱法确认底物的消除率，待确认底物完全消失后，以5,000～10,000转数/分的转速，对培养液进行离心分离而回收的沉淀物用蒸馏水清洗3次后，进行离心分离，从而得到沉淀物。在该沉淀物中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀物。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获得的粗生成物进行分离，从而获得0.52g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[5-6]将10g的从所述实施例1中获得的绿茶种子提取物溶解于100ml的离子水中，然后在121℃下进行灭菌30分钟，并冷却至27℃。然后，接种以液体量计为5～10％的预培养的植物乳杆菌(Lactobacill us plantarum)，并在27℃下培养2天后，用薄层色谱法确认底物的消除率，待确认底物完全消失后，以5,000～10,000转数/分的转速，对培养液进行离心分离而回收的沉淀物用蒸馏水清洗3次后，进行离心分离，从而得到沉淀物。在该沉淀物中加入乙醇(200ml)，并搅拌3次后，通过过滤来去除沉淀物。对经过过滤的滤液进行减压浓缩，从而获取粗生成物后，用硅胶柱色谱法(氯仿:甲醇＝8:1～4:1)来对获得的粗生成物进行分离，从而获得0.42g的21-O-当归酰茶皂醇E3。
[试验例1]胶原蛋白生物合成促进效果的测定
对于从所述实施例2至5中得到的21-O-当归酰茶皂醇E3的胶原蛋白生物合成促进效果，通过与生育酚及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)进行比较并测定。
首先，将人成纤维细胞(fibroblast)(PromoCell公司，德国)以每孔105个细胞的量接种(seeding)于24孔(well)中，并进行培养，直到生长至90％程度。然后用无血清DMEM培养基培养24小时后，分别用10-4摩尔浓度的溶解在无血清培养基中的实施例2至5的21-O-当归酰茶皂醇E3、生育酚及表没食子儿茶素没食子酸酯(E GCG)进行处理，并在CO2培养器中培养24小时。然后取出它们的上层液，并且利用(I)型原骨胶原酶(procollagen type(I)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒)来观察了原骨胶原(procollagen)的增减与否。其结果示于下述表1中，其中，合成能力是将非处理组设为100而进行比较的。
表1
试验物质 合成能力(％)
实施例2-1 121
实施例3-1 120
实施例4-1 121
实施例5-1 121
非处理组 100
生育酚 113
表没食子儿茶素没食子酸酯 120
如上述表1中所示，可以确认所述实施例2至5中得到的21-O-当归酰茶皂醇E3有效地增加了胶原蛋白的生物合成。
[试验例2]胶原酶表达抑制功效测定
如下所述，对于所述实施例2至5中得到的21-O-当归酰茶皂醇E3的胶原酶表达抑制功效(生成阻碍能力)，通过与生育酚及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)进行比较，并且用胶原酶表达程度来进行测定。
首先，在装有含2.5％的胎牛血清的DMEM(Dulbecco's Modifie d Eagle'sMedia)培养基的96-孔微量滴定板(96-well microtiter pla te)中，加入人成纤维细胞，使每孔浓度为5,000个细胞/孔(well)，并进行培养，直到生长至90％程度。之后在无血清DMEM培养基中培养24小时后，分别用10-4摩尔浓度的作为试验物质的溶解在无血清DMEM培养基中的所述实施例2至5的21-O-当归酰茶皂醇E3、生育酚及表没食子儿茶素没食子酸酯(阳性对照组)进行处理24小时后，收集了细胞培养液。
之后，利用商业上可利用的胶原酶测量仪器(美国安发玛西亚公司)，对收集的细胞培养液的胶原酶生成程度进行了测定。
首先，在均匀涂覆有胶原酶一抗的96-孔板(96-welll plate)中加入收集的细胞培养液，并在恒温槽中实施抗原-抗体反应3小时。3小时后，在96-孔板(96-welll plate)中加入结合有显色团的胶原蛋白二抗，并再次反应15分钟。15分钟后，加入显色引发物质 在室温下引发显色15分钟，然后再次加入1M硫酸来终止反应(显色)时，反应液的颜色呈黄色，根据反应进行程度，显示出的黄色的程度不同。
利用吸光计，在405nm下测定呈黄色的96-孔板的吸光度，并且通过下述数学式1来计算胶原酶的表达程度。此时，将从没有处理所述试验物质的组中收集的细胞培养液的反应吸光度作为对照组的吸光度。将胶原酶表达程度示于下述表2中，这是将非处理组的胶原酶表达程度设为100而进行比较的。
数学式1
胶原酶表达程度(％)＝A/B×100
A：用所述试验物质进行处理的细胞组的吸光度
B：对照组的吸光度
表2
试验物质 胶原酶表达程度(％)
非处理组 100
生育酚(阳性对照组) 75
EGCG(阳性对照组) 60
实施例2-1 59
实施例3-1 59
实施例4-1 60
实施例5-1 60
如所述表2中所示，当用所述实施例2至5中得到的21-O-当归酰茶皂醇E3进行处理时，胶原酶表达程度与已知为抑制胶原酶表达的生育酚相比显示出低的值，而与EGCG相比，显示出同等水平的胶原酶表达程度。因此，由此可以知道21-O-当归酰茶皂醇E3有效地抑制胶原酶的表达。
[试验例3]弹性蛋白酶表达抑制功能测定
如下所述，对于所述实施例2至5中得到的21-O-当归酰茶皂醇E3的弹性蛋白酶表达抑制功效(生成阻碍能力)，通过与生育酚及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)进行比较，并且用弹性蛋白酶表达程度来进行测定。
首先，在装有含2.5％的胎牛血清的DMEM(Dulbecco's Modifie d Eagle'sMedia)培养基的96-孔微量滴定板(96-well microtiter pla te)中，加入人成纤维细胞，使每孔浓度为5,000细胞/孔(well)，并进行培养，直到生长至90％程度。之后在无血清培养基中培养24小时后，分别用10-4摩尔浓度的作为试验物质的溶解在无血清培养基中的所述实施例2至5的21-O-当归酰茶皂醇E3、生育酚及表没食子儿茶素没食子酸酯(阳性对照组)进行处理24小时后，收集了细胞培养液。
之后，利用商业性上可利用的弹性蛋白酶测量仪器(美国安发玛西亚公司)，对收集的细胞培养液的弹性蛋白酶生成程度进行了测定。
首先，在均匀涂覆有弹性蛋白酶一抗的96-孔板中加入收集的细胞培养液，并在恒温槽中实施抗原-抗体反应3小时。3小时后，在96-孔板中加入结合有显色团的弹性蛋白二抗，并再次反应15分钟。15分钟后，加入显色引发物质，在室温下引发显色15分钟，然后再次加入1M硫酸并终止反应(显色)时，反应液的颜色呈黄色，根据反应进行程度，显示出的黄色的程度不同。
利用吸光计，在405nm下测定呈黄色的96-孔板的吸光度，并且通过下述数学式2来计算弹性蛋白酶的表达程度。此时，将从没有处理所述试验物质的组中收集的细胞培养液的反应吸光度作为对照组的吸光度。将弹性蛋白酶表达程度示于下述表3中，这是将非处理组的弹性蛋白酶表达程度设为100而进行比较的。
数学式2
弹性蛋白酶表达程度(％)＝A/B×100
A：用所述试验物质进行处理的细胞组的吸光度
B：对照组的吸光度
表3
物质 弹性蛋白酶表达程度(％)
非处理组 100
生育酚(阳性对照组) 88
EGCG(阳性对照组) 68
实施例2-1 64
实施例3-1 64
实施例4-1 65
实施例5-1 64
如所述表3中所示，当用所述实施例2至5中得到的21-O-当归酰茶皂醇E3进行处理时，弹性蛋白酶表达程度与已知为抑制弹性蛋白酶表达的生育酚或EGCG相比显示出低的值，由此，可以知道21-O-当归酰茶皂醇E3有效地抑制弹性蛋白酶的表达。
[试验例4]皮肤弹力提高功效确认
为了确认21-O-当归酰茶皂醇E3对皮肤弹力的提高功效，按照下述表4的成分及含量制备了作为化妆品组合物的剂型例1及比较例1的化妆水。
表4
为了比较所述剂型例1及比较例1的化妆水的皮肤弹力提高效果，以20名30～40岁年龄段的女性作为对象，对皮肤弹力提高程度进行了测定。实验方法如下。
首先，给被测对象剂型例1及比较例1的化妆水而让她们以每天一次的频率定量涂抹于眼周12周。此时，被测对象的左眼周涂抹所述剂型例1的化妆水，右眼周涂抹比较例1的化妆水。利用能够测定开始涂抹所述化妆水前及涂抹12周后的皮肤弹力的皮肤弹性测量仪(cutometer；SEM474，德国Courage+Khazaka electronic GmbH.公司，德国)来测定被测对象的皮肤弹力，并求出其平均值。将其实验结果示于表5中。
表5
类别 皮肤弹力提高率(％)
比较例1 13
剂型例1 45
如所述表5中所示，可以确认使用包含21-O-当归酰茶皂醇E3的剂型例1的化妆品组合物时的皮肤弹力提高率与使用比较例1的组合物时相比，高出3倍以上。因此，可以确认包含本发明的21-O-当归酰茶皂醇E3的化妆品组合物对皮肤弹力的提高非常有效。

Claims (2)

1.一种皮肤外用剂组合物在改善皮肤皱纹及提高皮肤弹性方面的应用，其特征在于，所述皮肤外用剂组合物含有下述化学式1所示的21-O-当归酰茶皂醇E3作为有效成分：
[化学式1]
2.一种皮肤外用剂组合物在改善皮肤皱纹及提高皮肤弹性方面的应用，其特征在于，所述皮肤外用剂组合物含有下述化学式1所示的21-O-当归酰茶皂醇E3作为唯一的有效成分：
[化学式1]
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