KR100892273B1

KR100892273B1 - 캄페롤-3-ｏ-루티노사이드를 유효 성분으로 함유하는 피부외용제 조성물

Info

Publication number: KR100892273B1
Application number: KR1020070040486A
Authority: KR
Inventors: 박준성; 박혜윤; 노호식; 김덕희; 장이섭
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2007-04-25
Filing date: 2007-04-25
Publication date: 2009-04-09
Also published as: KR20080095678A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 캄페롤-3-O-루티노사이드(Kaempferol-3-O-rutinoside)를 유효 성분으로 하는 주름 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 식물류, 특히, 녹차(Camellia sinensis)로부터 분리한 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 당쇄 형태의 재구성을 통해 얻어진 캄페롤-3-O-루티노사이드(Kaempferol-3-O-rutinoside)를 유효 성분으로 하는 주름 개선용 피부 외용제 조성물로서, 프로콜라겐 발현 촉진 및 콜라게나제 발현 억제의 효과를 통한 두 가지 활성의 복합 상승으로 피부 주름을 개선시킨다.

[화학식 1]

녹차, 주름, 프로콜라겐, 콜라게나제, 캄페롤-3-O-루티노사이드

Description

캄페롤-3-Ｏ-루티노사이드를 유효 성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물{Composition of skin external application comprising kaempferol-3-O-rutinoside as active ingredient}

본 발명은 캄페롤-3-O-루티노사이드(Kaempferol-3-O-rutinoside)를 유효 성분으로 함유하는 주름 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물에서 추출한 캄페롤-3-O-루티노사이드(Kaempferol-3-O-rutinoside) 배당체로부터 당을 제거하여 얻은 캄페롤-3-O-루티노사이드(Kaempferol-3-O-rutinoside)를 유효 성분으로 함유하는 주름 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부의 외형은 진피 조직의 세포외 기질(ECM; extracelluar matrix) 성분이 담당하게 되는데, ECM 전체의 약 70～80%를 차지하고 있는 것이 콜라겐이다. 피부 주름의 생성은 노화나 자외선 등에 의해 유발되는 콜라겐의 생성 저하 또는 파괴에 기인하며, 특히, 콜라게나제(collagenase)와 같은 기질 메탈로 프로테아제(matrix metallo protease)의 발현으로 인하여 피부내에서 정상적으로 생성된 콜라겐이 분해되어 주름이 생성되게 된다.

이러한 주름 생성의 원인이 되는 콜라겐의 감소를 억제하려는 목적으로 여러 가지 물질들이 개발되어 사용되고 있는데, 레티놀, 레티노익산 등의 레티노이드 물질은 주름 개선 효과를 나타내고(Dermatology therapy, 1998, 16, 357～364), 맥아추출물(malt extract) 등을 포함하는 조성물은 콜라게나제(collagenase)를 억제하는데 응용되고 있다(일본특제 제5,105,693호). 하지만, 이들 레티노이드들은 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가진다. 또한, 대부분의 천연물 유래의 원료들은 단순추출물의 형태로 사용되어 왔고, 그 추출물들이 보이는 효능이 정확하게 어떤 물질에 의한 것인지 밝혀지지 않아 그 추출물의 활성을 지속적으로 유지, 제어하기가 어려운 것이 현실이다.

이에 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하고 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내는 물질을 찾고자 연구한 결과, 식물류, 특히, 녹차 유래의 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 당쇄의 재구성을 통해 얻어진 캄페롤-3-O-루티노사이드가 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 녹차 유래의 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 당쇄의 재구성을 통해 얻어진 캄페롤-3-O-루티노사이드의 프로콜라젠 생성 촉진 효과와 콜라게나제 활성 저해 효과를 조사하고, 두 활성의 복합 상승효과를 통한 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 캄페롤-3-O-루티노사이드를 함유하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

식물, 특히, 녹차로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 플라보노이드 배당체를 함유하는 추출물을 제조하기 위하여 녹차 잎 또는 녹차 종자에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3배의 유기용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5회 교반하면서 추출하여 탈지시킨다. 탈지된 식물에 약 1 내지 8 배, 바람직하게는 약 4 배의 물 또는 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20 ℃에서 1 내지 3일간 침적시킨다. 그 다음, 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한다. 수층을 유기용매를 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 유기용매 엑기스를 얻는다. 그 다음, 이를 소량의 메탄올 등에 녹인 후, 대량의 에틸아세테이트 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜, 본 발명의 상기 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체를 함유하는 추출물을 수득할 수 있다.

이렇게 제조된 상기 추출물 중의 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체, 특히, 카멜리아시드 A 또는 B로부터 효소를 이용하여 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조한다.

카멜리아시드 A로부터 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 반응은 하기 반응식 1과 같다. 이 때, 카멜리아시드 A로부터 당을 제거하기 위한 효소는 글루코시다제, 셀룰라제, 갈락토시다제 및 아밀로글루코시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이다.

카멜리아시드 B로부터 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 반응은 하기 반응식 2와 같다. 이 때, 카멜리아시드 B로부터 당을 제거하기 위한 효소는 자일로시다제, 자일라나아제 및 나린지나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이다.

이 때, 효소 반응시의 pH는 4.0 내지 5.5의 범위가 적절하며, pH 4미만이면 반응 속도가 느려지고 pH 5.5를 초과하면 수율이 떨어지는 문제점이 있다. 또한 효소 반응시의 온도는 30 내지 50℃가 바람직하며, 상기 온도가 30℃ 미만이면 반응 속도가 느려지고 반응 온도가 50℃가 초과하면 효소의 반응 선택성이 떨어지는 문제점이 있다.

한편, 상기 기질로서 식물 추출물의 농도는 5 내지 20% 범위가 바람직하며, 상기 범위를 벗어날 경우 효소의 사용량 대비 경제성이 떨어지거나 반응 속도가 너무 느려지는 문제점이 있다. 이때 반응 시간은 48 내지 76시간이 바람직하다.

마지막으로, 반응액을 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80 ~ 100℃) 내에서 5 내지 15분 동안 가열하여 반응을 종료시킨다. 반응액을 감압 농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1 내지 5회 교반시킨 다음, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거한다. 그 후 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하고, 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1 ~ 4:1)로 분리하여 순수한 캄페롤-3-O-루티노사이드를 수득할 수 있다.

식물, 특히 녹차로부터 얻은 캄페롤-3-O-루티노사이드를 함유한 외용제 조성물은 프로콜라겐 생성 촉진과 콜라게나제의 발현 억제 활성의 복합 상승 작용으로 피부 주름 개선 효과가 뛰어나다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 상기의 캄페롤-3-O-루티노사이드를 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량% 함유함을 특징으로 한다. 함량이 0.0001중량% 미만일 경우에는 상기 성분에 의한 피부 주름 개선 효과 등을 얻을 수 없고, 함량이 10중량% 초과할 경우에는 함량 증가에 비해 효과의 증가가 크지 않기 때문이다.

본 발명에 따른 캄페롤-3-O-루티노사이드를 함유하는 피부 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없다. 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스, 바디 세정제 등의 화장료 조성물 또는 연고, 겔, 크림, 패취, 분무제 등의 의약용 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[제조예 1] 녹차 종자 추출물의 제조

녹차 종자 2㎏에 헥산 6ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 녹차 종자 1kg에 80% 메탄올 4ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500㎖로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 총 1-부탄올층을 감압 농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메 탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 녹차 종자 추출물 250g을 수득하였다.

[실시예 1] 카멜리아시드 A의 효소 반응을 통한 캄페롤-3-O-루티노사이드의 제조

상기 제조예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 효소 1.5g을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 48시간~76시간 동안 반응시켰다. 여기에서 효소는 베타-글루코시다제(실시예 1-1), 셀룰라제-A(실시예 1-2) 또는 베타-갈락토시다제(실시예 1-3)를 사용하여 각각의 효소를 이용하여 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드를 수득하도록 하였다. 그 후, 반응액을 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80~100℃) 내에서 5~15분 동안 가열하여 반응을 종료시켰다. 반응액을 감압 농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1~5회 교반시킨 다음, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하였다. 그 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하고, 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 순수한 캄페롤-3-O-루티노사이드를 수득하였다.

[실시예 2] 카멜리아시드 B의 효소 반응을 통한 캄페롤-3-O-루티노사이드의 제조

사용한 효소가 베타-자일로시다제(실시예 2-2), 자일라나아제(실시예 2-2) 또는 나린지나아제(실시예 2-3)인 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 카멜리아시드 B로부터 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하였다.

[시험예 1] 콜라게나제 발현 억제 효능 측정

상기 실시예 1 내지 2로부터 얻은 캄페롤-3-O-루티노사이드의 콜라게나제 생성 억제능을 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 측정하였다. 토코페롤 및 EGCG는 항산화물질로서 피부의 표피 세포를 재생시켜 피부의 노화를 방지하는 기능이 있는 것으로 알려진 물질이다.

시험은 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어 있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 다음, 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 실시예 1 내지 2의 캄페롤-3-O-루티노사이드, 토코페롤 및 EGCG를 10-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다.

채취한 세포배양액을 상업적으로 이용가능한 콜라게나제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 콜라게나제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게나제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채위된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다.

3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하였고, 하기 수학식 1에 의해 콜라게나제의 합성정도를 계산하였다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군의 채위된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다. 즉, 비처리군에서의 콜라게나제의 발현정도를 100으로 하고, 이에 대비하여 조성물을 처리한 군에서의 콜라게나제의 발현정도를 구하였으며, 결과는 표 1에 나타내었다.

물질			콜라게나제 발현 정도(%)
비처리군			100
토코페롤			75
EGCG			60
실시예 3	실시예 3-1	베타-글루코시다제(Almond)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 A로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	70
	실시예 3-2	셀룰라제-A(Aspergillus niger)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 A로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	71
	실시예 3-3	베타-갈락토시다제(Aspergillus oryzae)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 A로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	63
실시예 4	실시예 4-1	베타-자일로시다제(Aspergillus niger)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 B로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	68
	실시예 4-2	자일라나아제(Trichoderma viride)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 B로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	73
	실시예 4-3	나린지나아제(Penicillium decumbens)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 B로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	70

콜라게나제의 발현 정도가 낮을수록 콜라게나제의 발현 억제능이 높고, 피부내의 콜라겐의 분해가 적게 일어나며, 따라서 생성되는 주름의 양이 적어진다. 표 1에서 보면, 실시예 1 및 실시예 2에서 사용한 효소에 따라 콜라게나제 발현의 정도에 차이가 있으나, 본 발명에 의한 캄페롤-3-O-루티노사이드들은 시험관내(in vitro)에서 콜라게나제의 발현을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 콜라게나제의 발현 억제능이 항산화 물질로 알려져 있는 토코페롤보다 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 2] 프로콜라겐 생성 촉진 효능 실험

상기 실시예 1 내지 2로부터 얻은 캄페롤-3-O-루티노사이드의 프로콜라겐 생성능을 비타민 C 와 비교하여 측정하였다. 프로콜라겐은 콜라겐 생성 유도 물질로 콜라겐 생성과 노화 방지에 필요한 물질이며, 비타민 C는 콜라겐의 합성에 필수성분으로 알려져 있다.

시험은 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어 있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 다음, 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 실시예 1 내지 2의 캄페롤-3-O-루티노사이드, 비타민 C를 10-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다. 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐 타입-1 C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit) (MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

비처리군에서의 프로콜라겐 생성 정도를 100으로 하고, 이에 대비하여 조성물을 처리한 군에서의 프로콜라겐 생성 정도를 구하였으며, 결과는 표 2에 나타내었다.

물질			콜라게나제 발현 정도(%)
비처리군			100
비타민 C			120
실시예 3	실시예 3-1	베타-글루코시다제(Almond)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 A로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	121
	실시예 3-2	셀룰라제-A(Aspergillus niger)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 A로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	118
	실시예 3-3	베타-갈락토시다제(Aspergillus oryzae)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 A로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	138
실시예 4	실시예 4-1	베타-자일로시다제(Aspergillus niger)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 B로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	145
	실시예 4-2	자일라나아제(Trichoderma viride)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 B로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	123
	실시예 4-3	나린지나아제(Penicillium decumbens)를 반응효소로 사용하여 카멜리아시드 B로부터 제조된 캄페롤-3-O-루티노사이드	122

프로콜라겐의 생성 정도가 높을수록 콜라겐의 생성 정도가 높아지며, 따라서 피부 주름의 생성을 방지할 수 있다. 표 2에서 보면, 실시예 1 및 실시예 2에서 사용한 효소에 따라 프로콜라겐 생성 정도에 차이가 있으나, 본 발명에 의한 캄페롤-3-O-루티노사이드들은 시험관내(in vitro)에서 프로콜라겐의 생성을 촉진한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 대체적으로 프로콜라겐의 생성 촉진 정도가 콜라겐의 합성에 필수적인 성분으로 알려져 있는 비타민 C보다 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 캄페롤-3-O-루티노사이드는 프로콜라겐 생성 촉진과 콜라게나제 발현 억제효과를 나타냈으며, 이 두 가지 활성의 복합 상승 작용으로 우수한 피부 주름 개선 효과를 기대할 수 있다. 이와 같은 효과에 기인하여 상기 캄페롤-3-O-루티노사이드는 피부 주름 개선을 목적으로 하는 피부 외용제 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

물 또는 유기용매를 이용하여 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체를 함유하는 식물 추출물을 수득하는 1단계; 및

상기 1단계의 추출물에서 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 효소를 이용하여 선택적으로 당을 제거하는 가수분해를 통해 캄페롤-3-O-루티노사이드를 분리하는 제2단계;를 포함하고,

상기 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체는 카멜리아시드 A 또는 카멜리아시드 B이며,

상기 가수분해는 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체가 카멜리아시드 A인 경우는 글루코시다제, 셀룰라제, 갈락토시다제 및 아밀로글루코시다제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소를 사용하고, 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체가 카멜리아시드 B인 경우는 자일로시다제, 자일라나아제 및 나린지나아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소를 사용하여 이루어지는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표현되는 캄페롤-3-O-루티노사이드를 함유하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물.

[화학식 1]
제 1항에 있어서, 상기 캄페롤-3-O-루티노사이드는 프로콜라겐 생성 촉진과 콜라게나제 발현 억제효과의 복합 상승 작용을 갖는 것임을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물
제 1항에 있어서, 상기 캄페롤-3-O-루티노사이드는 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량% 함유됨을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 또는 바디 세정제의 제형을 가지는 화장료 조성물임을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형을 가지는 의약용 조성물임을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
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