KR20070022994A - 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 항노화용,주름 개선용, 및 피부 탄력 향상용 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 분해 반응을 통해 얻어진 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 항노화용, 주름 개선용, 및 피부 탄력 향상용 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 그 중 캄페롤 함량이 90%이상인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 상기 방법으로 수득한 녹차 유래의 캄페롤은 지질 과산화 억제 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과를 가지며, 이를 통해 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 지질 산화물인 스쿠알렌 모노퍼옥시드로부터 유도된 주름을 개선하는 효과를 나타내며, 엘라스타아제 및 콜라게나아제의 발현 억제 효과를 통해, 이 두 가지 활성의 복합 상승 작용으로 피부 탄력을 향상시키는 효과를 나타내므로, 이를 포함하는 피부 외용제 조성물은 항노화용, 주름 개선용, 및 피부 탄력 향상용 화장료 조성물 또는 약학 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

녹차, 캄페롤 배당체, 산, 염기, 효소, 노화, 지질 과산화, 콜라겐, 스쿠알렌 모노퍼옥시드, 주름, 개선, 엘라스타아제, 콜라게나아제, 탄력, 외용제, 화장료, 약학, 조성물.

Description

녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 항노화용, 주름 개선용, 및 피부 탄력 향상용 피부 외용제 조성물{Skin compositions for external application for anti-aging, improving wrinkle, and enhancing skin elasticity comprising kaempferol from green tea}

도 1은 본 발명의 녹차 유래 캄페롤의 스쿠알렌 모노퍼옥시드에 의해 유도된 주름에 대한 효과를 측정한 결과도이다.

본 발명은 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 분해 반응을 통해 얻어진 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 항노화용, 주름 개선용, 및 피부 탄력 향상용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부의 노화는 그 요인에 따라 크게 두 가지로 구분할 수 있다. 그 중 하나인 자연적인 노화(Intrinsic aging)는 피부의 구조와 생리적인 기능이 나이를 먹으 면서 계속적인 감퇴를 일으키는 것이고, 다른 하나인 외적 노화(Extrinsic aging)는 태양광선 등 누적된 외부 스트레스로 인해 발생하는 것이다. 특히 태양광의 자외선(ultraviolet rays; UV)은 잘 알려진 노화 원인의 하나로 장시간 자외선에 노출된 피부는 각질층이 두꺼워지고 피부의 주요 구성요소인 콜라겐과 엘라스틴이 변성되어 피부의 탄력성을 잃어가게 된다.

피부의 표면에는 다양한 지질(lipid)이 존재하는데 일반적으로 알려져 있는 조성은 다음과 같다. 즉, 피부 표면의 지질은 스쿠알렌(squalene), 스테롤(sterol)과 왁스 에스터(wax esters), 트리글리세라이드(triglycerides), 자유 지방산(free fatty acids), 세라마이드(ceramide)류의 화합물로 이루어져 있다. 이중에서 스쿠알렌은 10 ~ 15%의 비율로 함유되어 있다.

그런데, 피부가 자외선을 받으면 피부표면에 존재하는 지질들이 쉽게 퍼옥시드(peroxide)로 변화 되는데, 특히, 피부에 존재하는 다양한 지질 중에서 특히 불포화 이중 결합이 6개 존재하는 스쿠알렌은 쉽게 과산화가 일어나 퍼옥시드로 변형된다. 특히, 스쿠알렌의 과산화물중 스쿠알렌 모노퍼옥시드(squalene monoperoxide; SqOOH)는 자외선이 피부 표면에 조사 되었을때 초기 단계의 생성물이다. 또한, 피부 표면에서 스쿠알렌 모노퍼옥시드는 말론알데하이드와 같은 과산화 반응의 생성물이 생겨나게 하는 주요한 공급원으로 알려져 있다.

주름의 생성이라는 측면에서는 SqOOH와 UV가 동일 하지만 생성된 주름의 성질에서는 SqOOH와 UV가 차이를 나타낸다. SqOOH로부터 유도된 주름의 특징은 단기간에 생성(3주) 되어 추가적인 처치가 없으면 주름의 강도가 약해지는 일시적인 현 상을 보이나, UV에 의한 주름은 최소한 15주 동안 UV를 조사해야만 생성된다. 또한, SqOOH에 의해 생성된 주름의 경우를 UV에 의해 생성된 주름의 경우와 비교하기 위해 15주간 처리하였을 때도 그 외관상의 특징은 차이가 있다. 즉, SqOOH에 의해 생성된 주름의 경우에는 주름이 일정한 방향이 없이 어지럽게 생성되지만, UV에 의한 의한 주름은 굵고 방향성을 가지면서 배치가 된다(Chiba, K. et al., Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 16, pp242-251, 2003; Chiba, K. et al., Exp. Dermatol., 8, pp471-479, 1999).

상기와 같이 스쿠알렌 모노퍼옥시드로부터 유도되는 주름이 자외선에 의해 유도되는 주름과 다른 형태를 보임이 알려진 것은 최근의 일이다.

따라서, 상기와 같이 스쿠알렌 모노퍼옥시드에 의해 유도되는 주름을 억제할 수 있는 물질에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다.

한편, 피부의 탄력은 진피 조직의 세포외 기질(ECM; extracelluar matrix) 성분이 담당하게 되는데, ECM은 크게 두 가지 성분으로 구성되어 있다. 하나는 ECM 전체의 약 2∼4%를 차지하는 탄력섬유(elastic fiber)이며, 또 다른 하나는 ECM 전체의 약 70∼80%를 차지하고 있는 콜라겐이다. 탄력섬유는 엘라스틴(elastin)이라는 무정형의 기질에 미원섬유(microfibrils)들이 박혀 있는 형태를 띠고 있으며, 엘라스틴은 라이신에서 유래한 데스모신(desmosine)과 아이소데스모신(isodesmosine)이라는 탄력섬유에서만 발견되는 아주 톡특한 아미노산으로 구성된 단백질이다. 이러한 데스모신과 아이소데스모신 등은 긴 펩타이드 사슬 안에서 가교(cross-links)를 형성하고 있는데, 이러한 구조가 엘라스틴으로 하여금 고무와 같은 성질을 갖게 한다.

또한, 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유는 콜라겐(collagen)이라고 하는 교원섬유와 함께 존재하는데, 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력유지가 가능하다.

피부 탄력의 저하는 노화나 자외선 등에 의해 유발되는 콜라겐과 엘라스틴의 생성 저하 또는 파괴에 기인한다. 특히, 콜라게나아제(collagenase)와 엘라스타아제(elastase)와 같은 매트릭스 메탈로 프로테아제(matrix metallo protease)의 발현으로 인하여 피부 내에서 정상적으로 생성된 콜라겐과 엘라스틴이 분해되어 피부 탄력이 저하 되게 된다.

이러한 탄력감소의 원인이 되는 콜라겐 및 엘라스틴의 감소를 억제하려는 목적으로 여러 가지 물질들이 개발되어 사용되고 있는데, 그 중 레티놀과 레티노익산 등의 레티노이드 등이 탄력개선 효과를 나타내고(Dermatology therapy, 1998, 16, 357∼364), 레구미노사 종자(Leguminosae Seeds)에서 얻어진 단백질분획도 탄력증대 효과를 나타내며(미국특허 제5,322,839호), 맥아추출물(malt extract)등을 포함하는 조성물은 콜라게나제(collagenase)를 억제하는데 응용되고 있다(일본특제 제5,105,693호).

그러나, 이들 레티노이드들은 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가지며 대부분의 천연물 유래의 원료들은 단순추출물의 형태로 사용되어 왔고, 그 추출물들이 보이는 효능이 정확하게 어떤 물질에 의한 것인지 밝혀지지 않아 그 추출물의 활성을 지속적으로 유지, 제어하기가 어려운 것이 현실이다.

이에, 본 발명자들은 항노화 효과를 나타내며, 스쿠알렌 모노퍼옥시드에 의해 유도되는 주름을 억제할 수 있으며 우수한 피부 탄력 향상 효과도 나타내는 물질을 찾고자 연구한 결과, 녹차 유래의 캄페롤 배당체로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생성하는 미생물을 이용한 분해반응을 통해 얻어진 캄페롤이 항노화 효과, 스쿠알렌 모노퍼옥시드에 의해 유도되는 주름 개선 효과, 및 피부 탄력 향상 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 녹차 유래의 캄페롤 배당체로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 분해 반응을 통하여 얻어진 생성물의 캄페롤 함량별 지질 과산화 억제 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과, 콜라게나아제 및 엘라스타아제 발현 억제 효능을 조사하고, 이를 바탕으로 항노화 효과를 나타내며, 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 지질 산화물인 스쿠알렌 모노퍼옥시드에 의해 유도되는 주름을 개선시키고, 피부 탄력을 향상시키는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 분해시켜 얻어진 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항노화용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 분해시켜 얻어진 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 분해시켜 얻어진 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 탄력 향상용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

상기 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 효소를 이용하여 46 내지 50 시간 동안 분해시켜 얻어진 것임을 특징으로 한다.

상기 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 캄페롤 함량이 90%이상인 것을 특징으로 한다.

상기 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 산은 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매인 것을 특징으로 한다.

상기 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매 인 것을 특징으로 한다.

상기 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 효소는 캄페롤 배당체에서 당 부분을 제거하여 캄페롤을 분리하는 엑소(exo) 당결합 분해 효소인 것을 특징으로 한다.

상기 엑소 당결합 분해 효소는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(Xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 구성되는 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 효소를 생산하는 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 주름 개선용 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 주름은 자외선에 의해 생성된 지질 과산화물인 스쿠알렌 모노퍼옥시드로부터 유도되는 주름인 것을 특징으로 한다.

상기 주름 개선용 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 지질 과산화를 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 주름 개선용 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 콜라겐 생합성을 촉진하는 것을 특징으로 한다.

상기 피부 탄력 향상용 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 엘라스타아제 및 콜라게나아제 발현 억제를 통해 두 가지 활성의 복합 상승 작용으로 피부 탄력을 향상시키는 것을 특징으로 한다.

상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물임을 특징으로 한다.

상기 피부 외용제 조성물은 약학 조성물임을 특징으로 한다.

상기 피부 외용제 조성물은 상기 녹차 유래의 캄페롤을 조성물 총중량에 대해 0.0001∼10중량％의 양으로 함유함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 하기와 같다.

본 발명의 녹차 유래의 캄페롤은 녹차(Camellia sinensis)로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 분해 반응을 통해 얻어진 것이 바람직하다.

먼저, 녹차로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 제조하기 위하여 녹차잎 또는 녹차씨에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3배의 물 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5회 교반하면서 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 식물에 약 1 내지 8 배, 바람직하게는 약 4 배의 물 또는 상기 유기용 매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20 ℃에서 1 내지 3일간 침적시킨 후, 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한 다음, 수층을 상기 유기용매를 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 상기 유기용매 엑기스를 얻은 다음, 이를 소량의 메탄올 등에 녹인 후, 대량의 에틸아세테이트 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜, 본 발명의 상기 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 수득할 수 있다.

그 다음 상기 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 녹차 유래의 캄페롤을 제조한다.

이 때 산을 이용 시, 상기 녹차 추출물에 0.1N∼2N 농도, 바람직하게는 1N 농도의 산 또는 산 및 알코올의 혼합용매(바람직하게는 50% 에탄올 혼합용매)를 가한 후, 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 80 ℃ 수욕조에서 0.5 내지 2시간 동안 가열 환류시켜 가수분해하여 반응액을 수득할 수 있다.

상기 산은 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용할 수 있다.

이 때 염기를 이용 시, 상기 녹차 추출물을 녹인 후, 0.1N∼2N 농도, 바람직하게는 1N 농도의 염기 또는 염기 및 알코올의 혼합용매(바람직하게는 50% 부탄올 혼합용매)를 가해 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 100 ℃ 수욕조에서 1 내지 12 시 간 동안 가열 환류시켜 가수분해하여 반응액을 수득할 수 있다.

상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기, 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올, 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용할 수 있다.

이 때 효소를 이용시, 상기 녹차 추출물을 5 내지 20 배, 바람직하게는 약 10 배의 산성완충용액에 용해시킨 다음, 효소를 첨가하여 약 37 ℃ 수욕상에서 약 1 내지 60시간 동안 교반하면서, 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80∼100 ℃)중에서 5 내지 15 분 동안 가열하여 가수분해 반응을 종료시키고 반응액을 수득할 수 있다.

상기 효소를 생산하는 미생물을 활용 시, 상기 녹차 추출물을 5 내지 10배, 바람직하게는 약 10배의 이온수에 용해시킨 후 121℃에서 30분간 멸균하여 30 ℃로 냉각한 후 미리 배양된 미생물을 액체량 대비 5∼10%로 접종하여 30 ℃에서 2 내지 5일 배양 시킨 후 5,000 내지 10,000 rpm 으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 후 원심분리하여 침전물로써 반응액을 수득할 수 있다.

상기 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물은 엑소(exo) 당결합 분해 효소 또는 상기 엑소 당결합 분해 효소를 생산하는 미생물을 사용하며, 상기 효소는 캄페롤 배당체에서 당 부분을 제거하여 캄페롤을 분리할 수 있다.

상기와 같이 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해 한 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1 내지 5회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하고, 여과된 여액을 감압농축하여 캄페롤 함량별(중량 대비 10∼90%) 조 생성물을 수득하고, 상기 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름: 메탄올= 8:1 내지 4:1)로 분리하여 일정량의 캄페롤을 수득할 수 있다.

상기 방법으로 수득된 녹차 유래 캄페롤의 주름 개선 효과를 알아보기 위해, 녹차 잎 추출물 또는 녹차 씨 추출물을 효소를 이용한 반응 시간별 분해반응을 통하여 캄페롤의 함량별 샘플(녹차 씨 추출물의 효소분해 반응 시간별 생성물)을 제조한 후 캄페롤의 함량별 지질 산화 억제 정도, 콜라겐 생합성 촉진 정도를 측정한 다음, 이를 바탕으로 가장 효능이 좋은 캄페롤 함량 90% 이상인 효소분해 반응 생성물(이하, 고순도 캄페롤이라고 함)을 활용하여 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 지질 과산화물인 스쿠알렌 모노퍼옥시드에 의해 유도되는 주름 억제 정도를 측정한 결과, 그 우수한 효과를 확인하였다.

또한, 상기 방법으로 수득된 녹차 유래 캄페롤의 피부 탄력 향상 효과를 알아보기 위해, 상기 산 및 염기 가수분해, 효소분해, 미생물을 이용한 방법을 통하여 수득한 캄페롤의 콜라게나아제 및 엘라스타아제 발현 억제 효능 및 피부 탄력 향상 효능을 측정한 결과, 그 탁월한 효과를 확인하였다.

본 발명에 따른 상기 녹차 유래의 캄페롤은 피부 외용제 조성물에 사용될 수 있는데, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없다. 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이컵 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 또는 바디 세정제 등의 화장료 조성물 또는 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 등의 의약용 조성물로 제형화될 수 있다.

이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 상기 녹차 유래의 캄페롤을 조성물 총 중량에 대하여 각각 0.0001∼10중량％의 양으로 함유함을 특징으로 한다. 그 함량이 0.0001 중량％ 미만일 경우, 상기 성분에 의한 항노화 효과, 주름 개선 효과, 또는 피부 탄력 향상 효과 등을 얻을 수 없고, 함량이 10중량％ 이상이 될 경우, 함량 증가에 비해 효과의 증가가 크지 않기 때문이다.

본 발명의 피부 외용제 조성물의 제형을 좀 더 설명하면 하기와 같다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물로써, 상기 녹차 유래의 캄페롤의 양이 전체 화장료 조성물 총중량에 대하여 0.0001∼10중량％의 양으로 함유됨을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은, 상기한 녹차 유래의 캄페롤 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 주름 개선 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

본 발명에 따른 녹차 유래의 캄페롤은, 각 화장료 제형으로 제조하여 그대로 도포하는 것이 적합하나, 통상의 외용의 제제로도 할 수 있다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 항노화 효과, 주름 개선 효과, 또는 피부 탄력 향상 효과를 위한 화장품 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품 류와 클렌징, 세안제, 비누, 미용액 등이 있다.

본 발명의 상기 녹차 유래의 캄페롤을 함유하는 조성물이 첨가된 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

즉, 본 발명의 화장료는 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 메이크업 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 샴푸, 린스, 바디세정제, 비누, 염모제, 분무제 등과 같은 제형을 들 수 있다.

각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 녹차 유래의 캄페롤 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의선정하여 배합할 수 있다.

상기한 제제는 항노화 효과, 주름 개선 효과, 또는 피부 탄력 향상 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 약학 조성물로써, 상기 녹차 유래 의 캄페롤의 양이 전체 약학 조성물의 0.0001 내지 10 중량 %를 갖는 주름 개선용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 녹차 유래의 캄페롤을 포함하는 약학 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

그 제형으로는 본 발명에 따른 녹차 유래의 캄페롤을 포함하는 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 등의 외용제 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용할 수 있다.

상기 제제의 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 투여 방법에 의해 상이하나, 1일당 1.0 내지 3.0 ㎖로 이를 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 사용하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 상기 녹차 유래의 캄페롤은 독성 및 부작용은 거의 없으므 로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 녹차 씨 추출물의 제조

녹차 씨 2 ㎏에 각각 헥산 6 ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 녹차 씨 1 kg에 80 % 메탄올 4 ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15 ℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1 ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500 ㎖로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 총 1-부탄올층을 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 녹차 씨 추출물 250 g을 수득하였다.

[실시예 2] 녹차 잎 추출물의 제조

녹차 잎 2 ㎏에 헥산 6 ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 녹차 잎 1 kg 에 80 % 메탄올 4 ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15 ℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1 ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500 ㎖로 3회 추출하였다. 이 로부터 얻은 총 1-부탄올층을 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 녹차 잎 추출물 150 g을 수득하였다.

[실시예 3] 산 가수분해 방법에 의한 캄페롤의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 10 g에 20배(v/w)의 1 N HCl-50 % 메탄올 용액(v/v)을 가하여, 80 ℃ 수욕조에서 8시간 동안 가열 환류시켜, 카멜리아시드 A와 카멜리아시드 B에 결합된 당들을 가수분해시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반시킨 후(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 이후 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1 ~ 4:1)로 분리하여 캄페롤 0.95 g을 수득하였다.

[실시예 4] 염기 가수분해 방법에 의한 캄페롤의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 10 g을 건조피리딘(500 ㎖)에 녹이고, 여기에 소디움 메톡사이드(sodium methoxide)(powder, 10 g)를 가해 수욕조에서 8시간동안 가열 환류시켜, 카멜리아시드 A와 카멜리아시드 B에 결합된 당들을 가수분해시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반시킨 후(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 이후 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬 럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1 ~ 4:1)로 분리하여 캄페롤 0.25 g을 수득하였다.

[실시예 5] 효소분해 방법에 의한 캄페롤의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 10 g을 100 ㎖의 0.1 M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 2.5 g(헤스페리디나제 0.5 g, 나린지나제 0.5 g, 셀룰라제 0.5 g, β-글루쿠로니다제 0.2 g, β-갈락토시다제 0.5 g, 아밀로글루코시다제 0.3 g ; Sigma사 제조)을 첨가하여 37 ℃ 수욕상에서 48 시간동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 기질(camelliaside A와 camelliaside B)이 완전히 소실되면 열수(80 ∼ 100 ℃) 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 교반시킨 다음(3회), 침전물을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 이후 상기 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올= 8:1∼4:1)로 분리하여 캄페롤 1.02 g을 얻었다.

[실시예 6] 미생물을 이용한 캄페롤의 제조

상기 실시예 2에서 수득한 녹차 잎 추출물 10 g을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121 ℃에서 30분간 멸균하여 30 ℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10 %로 접종하여 30 ℃에서 5일 동안 배양시킨 후, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시키고, 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 후 원심분리하여 침전물로써 반응액을 얻은 다음, 상기 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반시킨 후(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 이후 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1 ~ 4:1)로 분리하여 캄페롤 0.62 g을 수득하였다.

[실시예 7 내지 13] 효소분해 방법에 의한 효소분해 반응 시간별 생성물인 캄페롤(함량별)의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 100 g을 1000 ㎖의 0.1 M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 6 g [헤스페리디나제(hesperidinase) 1 g, 나린지나제(naringinase) 1 g, 셀룰라제(cellulase) 1 g, β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 1 g, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 1 g, 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase) 1 g ; 시그마(Sigma)사 제조]을 첨가하여 37 ℃ 중탕에서 48 시간동안 교반시키면서, 반응 시작 후 2, 4, 8, 16, 24, 36, 48 시간(각각 실시예 6 내지 12에 해당)에 각각 100 ㎖ 씩 취한 후 열수(80 ∼ 100 ℃) 중에서 10 분간 가열하여 반응을 종료시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반시킨 다음(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압농축하여 효소분해 반응 시간별 생성물인 캄페롤(함량별)을 수 득하였다. 상기 실시예 7 내지 13에서 수득한 생성물의 양은 각각 샘플링 시간 별로 0.43, 0.54, 0.57, 0.66, 0.69, 0.84, 1.05 g 이였다. 이를 하기 표 1에 나타내었다.

실시예	효소분해 반응 시간	생성물의 양(g)
실시예 7	2	0.43
실시예 8	4	0.54
실시예 9	8	0.57
실시예 10	16	0.66
실시예 11	24	0.69
실시예 12	36	0.84
실시예 13	48	1.05

[실험예 1] 효소분해 반응 시간별 생성물의 캄페롤 함량 측정

상기 실시예 7 내지 13에서 수득한 효소분해 반응 시간별 생성물의 캄페롤 함량을 HPLC(Waters 사)를 활용하여 측정하였다.

먼저, 캄페롤 표준품(sigma 사)을 50 ~ 500 ppm 농도로 만들고 HPLC를 활용하여 분석하고 피크 면적 대비 캄페롤 농도의 검량 곡선을 제작하였다. 이를 활용하여 상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물의 효소분해 반응 시간에 따른 생성물의 캄페롤 함량을 측정하였고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

실시예	효소분해 반응 시간	캄페롤 함량(%, w/w)
실시예 7	2	5 ~ 8
실시예 8	4	12 ~ 17
실시예 9	8	22 ~ 25
실시예 10	16	30 ~ 35
실시예 11	24	40 ~ 48
실시예 12	36	73 ~ 80
실시예 13	48	90 이상

그 결과 상기 표 2에서 보여 지는 것처럼, 상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물의 효소분해 반응 시간이 증가할수록 생성물 중의 캄페롤 함량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.

[실험예 2] 지질 과산화 억제 효과 측정

상기 실시예 7 내지 13으로 부터 얻은 효소분해 반응 시간별 생성물(캄페롤)의 지질 과산화 억제 효과를 토코페롤 및 EGCG(epigallocathechin-3-gallate)와 비교하여 측정하였다.

먼저, 푸세니그 박사(Dr. N.E. Fusenig, Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ), Heidelberg, Germany)로부터 구입한 인간 각질세포 HaCaT 세포주를 60 mm 디쉬당 1.0 × 10⁶ 개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(FBS 10%) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후 상기 실시예 7 내지 13의 각 효소분해 반응 시간별 생성물을 각각 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리(실시예 7 내지 13의 각 효소 분해 반응 시간별 생성물 처리군)하였고, 양성대조군으로 사용한 토코페롤 및 EGCG도 각각 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리하였고(각각 토코페롤 처리군 및 EGCG 처리군), 다음날 상기 각 처리군에 4mM의 t-BHP(t-butyl hydroperoxide)를 함께 처리하였다. 또한, 상기 처리군과 비교하기 위하여 t-BHP 만을 단독으로 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리하였다(t-BHP 처리군). 그 다음 상기 각 처리군들을 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간동안 배양한 후 세포를 수득하였다. 상기 세포는 냉동/해동 공정을 반복하는 방법(freeze/thawing)으로 용해(lysis)하였으며, 이하의 실험은 본 발명에서 사용한 하기 분석 키트(assay kit)에 나와 있는 방법에 준하여 시행하였다.

본 발명에서는 칼바이오켐 지질 과산화 분석 키트(Calbiochem Lipid peroxidation assay kit; Cat. No. 437634)를 시약으로 사용하였고, 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA) 및 4-하이드록시알케날(hydoxyalkenals; i.e. 4-hydroxy-2(E)-nonenal, 4-HNE)과 같은 장쇄 불포화지방산과 연관된 에스테르의 과산화물이 상기 각 처리군 존재 하에서 N-메틸-2-페닐인돌(N-methyl-2-phenylindole)과 반응하여 586nm에서 안정한 화합물을 형성하는 원리를 이용하여 지질 과산화(lipid peroxidation)를 측정하였다(하기 반응식 1 참조). 이때 상기 시험물질 중 t-BHP를 처리하면 MDA 나 HNE 생성 정도가 증가하게 되는데, 항산화 물질인 토코페롤이나 EGCG 등을 처리하면 MDA 나 HNE 등의 생성 증가를 억제하게 된다. 이를 토대로 상기 실시예 7 내지 13의 각 효소분해 반응 시간별 생성물의 지질 과산화 억제 효과를 MDA, HNE 생성정도로 비교하여 보았다. 이때 각 처리군의 MDA HNE 생성 정도는 t-BHP 및 각 시험물질 모두를 처리하지 아니한 비처리군을 100으로 하여 대비한 것이다.

처리군	효소분해 반응 시간	MDA, HNE 생성정도 (%)
실시예 7	2	331
실시예 8	4	326
실시예 9	8	305
실시예 10	16	286
실시예 11	24	275
실시예 12	36	253
실시예 13	48	216
비처리군		100
t-BHP		350
토코페롤		230
EGCG		250

그 결과 상기 표 3에서 보여 지는 것처럼, 상기 실시예 7 내지 13의 효소분해 반응 시간별 생성물인 각 캄페롤은 과산화물인 MDA, HNE 생성정도를 낮추는 것을 알 수 있었고, 또한 효소분해 반응 시간이 증가할수록 MDA, HNE 생성정도가 더 감소하는 것을 알 수 있었다. 특히, 상기 실시예 13의 효소 분해 반응 생성물(효소분해 반응 48시간 생성물)은 항산화 효과가 알려져 있는 토코페롤 및 EGCG 보다 더 높은 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 이를 통해, 캄페롤의 효소분해 반응 시간이 증가할수록 지질 과산화 억제능이 더 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.

[실험예 3] 콜라겐 생합성 촉진 효과의 측정

상기 실시예 7 내지 13으로부터 얻은 효소분해 반응 시간별 생성물(캄페롤)의 콜라겐 생합성 촉진 효과를 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 측정하였다.

먼저, 인간섬유아세포(fibroblast)(PromoCell, Germany)를 24 공(well)에 1 공 당 10⁵개씩 파종(seeding)하여 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이를 24시간 동안 무혈청 DMEM 배지로 배양한 후 무혈청 배지에 녹여진 실시예 7 내지 13의 각 효소 분해 반응 시간별 생성물, 토코페롤 및 EGCG(양성 대조군)를 각각 10^-4 몰농도로 처리하고 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이들의 상층액을 떠내어 프로콜라겐 형(I) 엘라이자(ELISA) 키트(procollagen type(I))를 이용하여 프로콜라겐(procollagen)의 증감여부를 보았다. 그 결과는 표 4에 나타내었으며, 여기서 합성능은 비처리군을 100으로 하여 대비한 것이다.

처리군	효소분해 반응 시간	합성능 (%)
실시예 7	2	98
실시예 8	4	105
실시예 9	8	111
실시예 10	16	117
실시예 11	24	120
실시예 12	36	125
실시예 13	48	134
비처리군		100
토코페롤(양성대조군)		113
EGCG(양성대조군)		120

그 결과 상기 표 4에서 보여 지는 것처럼, 상기 실시예 7 내지 13의 효소분해 반응 시간별 생성물인 각 캄페롤은 대부분 콜라겐 생합성을 증가시킴을 알 수 있었고, 상기 효소분해 반응 시간이 증가할수록 콜라겐 생합성 효과가 더 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 특히, 상기 실시예 13의 효소 분해 반응 생성물(효소분해 반응 48시간 생성물)은 양성대조군인 토코페롤 및 EGCG 보다 더 높은 콜라겐 생합성 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

[실험예 4] 스쿠알렌 모노퍼옥시드로부터 유도된 주름의 개선 효과 측정

상기 실험예 2의 지질 과산화 억제 효과 실험에서 가장 좋은 효능을 보인 실시예 13의 효소분해 반응 48시간의 생성물(캄페롤 함량 90% 이상의 효소분해 반응 생성물로 이하, '고순도 캄페롤'이라 함)을 활용하여 스쿠알렌 모노퍼옥시드로부터 유도된 주름의 개선 효과를 측정하였다. 이 때, 스쿠알렌 모노퍼옥시드는 스쿠알렌에 UV를 조사한 후 메탄올로 추출하여 준비하였다.

먼저, 캄페롤 함량 90% 이상인 고순도 캄페롤의 주름 개선 효과를 평가하기 위하여 6주령의 암컷(Female) SHR-1 헤어리스 마우스(Charles River, Japan) 30 마리를 준비하여 10 마리씩 2개의 시험군과 1개의 대조군으로 나누어 스쿠알렌 모노퍼옥시드를 일주일에 2회 4주 동안 처리하여 주름을 형성시켰으며, 스쿠알렌 모노퍼옥시드 처리 후 30분, 1일 2회 씩 4주간 고순도 캄페롤 1% 용액(용매로는 폴리에틸렌글리콜 400(PEG400))을 0.5 ㎖씩 도포하여 처리하면서 주름 형성 억제 정도를 측정하였다. 주름 형성 억제 정도의 육안 평가를 위해 레플리카(replica)를 채취하여 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, Normal은 무처리 대조군이고, SqOOH+PEG400은 스쿠알렌 모노퍼옥시드와 PEG400을 처리한 시험군이고, SqOOH+PEG400+고순도 캄페롤은 스쿠알렌 모노퍼옥시드와 PEG400, 및 실시예 12의 고순도 캄페롤을 처리한 시험군이다.

그 결과 도 1에 나타낸 것처럼, 캄페롤 함량 90% 이상의 고순도 캄페롤을 처리한 경우, 스쿠알렌 모노퍼옥시드에 의해 유도된 주름에 대한 주름 개선 효과가 아주 뛰어남을 확인 할 수 있었다.

[실험예 5] 콜라게나아제 발현 억제 효능 측정

상기 실시예 3 내지 6으로 부터 얻은 캄페롤의 콜라게나아제 발현 억제 효능(생성 저해능)을 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 하기와 같이 측정하였다.

먼저, 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 다음, 시험물질로 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 실시예 3 내지 6의 캄페롤, 토코페롤 및 EGCG(양성대조군)를 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다.

이 후, 채취한 세포배양액을 상업적으로 이용가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다.

먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채위된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하였고, 하기 수학식 1에 의해 콜라게나아제의 발현 정도를 계산하였다. 이때 상기 시험물질을 처리하지 않은 군(비처리군)의 채위된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군의 흡광도로 하였다.

콜라게나아제 발현 정도(%)= A/B × 100

A: 상기 시험물질 처리 세포군의 흡광도

B: 대조군의 흡광도

한편, 상기 인간의 섬유아세포에서 상기 시험물질들의 콜라게나아제 발현 억제 효능을 측정한 결과를 콜라게나아제 발현 정도로 하기 표 5에 나타내었으며, 이는 비처리군의 콜라게나아제 발현 정도를 100으로 하여 대비한 것이다.

시험물질	콜라게나아제 발현 정도(%)
비처리군	100
토코페롤(양성대조군)	75
EGCG(양성대조군)	60
실시예 3	68
실시예 4	64
실시예 5	66
실시예 6	66

그 결과, 상기 표 5에 보여지는 것처럼, 상기 실시예 3 내지 6에서 얻어진 캄페롤이 콜라게나아제 발현을 효과적으로 억제함을 확인 할 수 있었으며, 특히 양성대조군인 토코페롤 보다 더 높은 콜라게나아제 발현 억제 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

[실험예 6] 엘라스타아제 발현 억제 효능 측정

상기 실시예 3 내지 6으로 부터 얻은 캄페롤의 엘라스타아제 발현 억제 효능(생성 저해능)을 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 하기와 같이 측정하였다.

먼저, 시험은 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 배지로 24시간 배양하고, 시험물질로 무혈청 배지에 녹여진 상기 실시예 3 내지 6의 캄페롤, 토코페롤 및 EGCG(양성대조군)를 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다.

이 후, 채위한 세포배양액을 상업적으로 이용 가능한 엘라스타아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 엘라스타아제 생성 정도를 측정하였다.

먼저 1차 엘라스타아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채위된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 엘라스틴 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 엘라스타아제의 발현 정도를 계산하였다. 이때 상기 시험물질을 처리하지 않은 군(비처리군)의 채위된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군의 흡광도로 하였다.

엘라스타아제 발현 정도(%) = A/B × 100

A: 상기 시험물질 처리 세포군의 흡광도

B: 대조군의 흡광도

한편, 상기 인간의 섬유아세포에서 상기 시험물질들의 엘라스타아제 발현 억제 효능을 측정한 결과를 하기 표 6에 나타내었고, 이는 비처리군의 발현 정도를 100으로 하여 대비한 것이다.

물질	엘라스타아제 발현 정도(%)
비처리군	100
토코페롤(양성대조군)	88
EGCG(양성대조군)	68
실시예 3	70
실시예 4	69
실시예 5	71
실시예 6	70

그 결과, 상기 표 6에 보여지는 것처럼, 상기 실시예 3 내지 6에서 얻어진 캄페롤이 엘라스타아제 발현을 효과적으로 억제함을 확인 할 수 있었으며, 특히 양성대조군인 토코페롤 보다 더 높은 엘라스타아제 발현 억제 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

[실시예 7] 피부 탄력 향상 효능 확인

상기 실시예 3 내지 6에서 얻은 캄페롤의 피부 탄력 향상 효능 확인을 위하여 하기 표 7의 성분 및 함량으로 제형예 1 및 비교예 1의 화장료 조성물로서 화장수를 제조 하였다.

성 분	함량
	제형예 1	비교예 1
세테아릴글루코사이드	1.5	1.5
세틸옥타노에이트	3.0	3.0
메칠파라벤	0.15	0.15
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	0.02	0.02
실시예 3에서 얻은 캄페롤	10	-
정제수	To 100	To 100

상기 제형예 1 및 비교예 1에서 제조된 화장수에 대하여 피부 탄력 향상 효과를 비교하기 위하여, 30∼40대 여성 280명을 대상으로 20명을 1개군으로 하여 14개군으로 나누어 측정하였다. 실험 방법은 다음과 같다.

먼저, 각 군에 제형예 1 및 비교예 1에서 제조된 화장수를 주고 매일 1회 12주간 눈가에 일정량을 도포하게 하였다. 이때, 피검자의 눈가의 왼쪽에는 상기 제형예 1의 화장수를, 오른쪽에는 비교예 1의 화장수를 도포하게 하였다. 12주 뒤 피부탄력을 측정할 수 있는 큐토미터(cutometer; SEM474, Courage+Khazaka electronic GmbH. Germany)를 이용하여 각 군의 피부 탄력을 측정하고 그 평균을 구하였다. 그 실험 결과는 표 8에 나타내었다.

구 분	피부탄력향상도(%)
비교예 1	18
제형예 1	55

상기 표 8에서 보여진 바와 같이, 캄페롤을 포함하는 제형예 1의 화장료 조성물의 피부 탄력 향상도가 비교예 1에 비해 3배 이상 높게 확인 되었다. 따라서, 본 발명의 캄페롤을 포함하는 화장료 조성물은 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인 할 수 있다.

하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 비누 제조

실시예 3의 캄페롤..........................1.00 (%)

유지........................................적당량

수산화나트륨................................적당량

염화나트륨..................................적당량

향료........................................소 량

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비에 의해 비누를 제조하였다.

제제예 2. 로션 제조

실시예 4의 캄페롤...........................3.00 (%)

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염.............1.00

수용성 콜라겐 (1 % 수용액)..................1.00

시트르산나트륨..............................0.10

시트르산....................................0.05

감초 엑기스.................................0.20

1,3-부틸렌글리콜............................3.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)에 의해 로션을 제조하였다.

제제예 3. 크림 제조

실시예 5의 캄페롤..........................1.00(%)

폴리에틸렌글리콜모노스테알레이트............2.00

자기유화형모노스테아르산글리세린............5.00

세틸알코올..................................4.00

스쿠알렌....................................6.00

트리2-에틸헥산산글리세릴....................6.00

스핑고당지질................................1.00

1.3-부틸렌글리콜............................7.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 크림을 제조하였다.

제제예 4. 팩 제조

실시예 6의 캄페롤..........................5.00(%)

폴리비닐알코올..............................13.00

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염..............1.00

라우로일히드록시프롤린.......................1.00

수용성 콜라겐 (1 % 수용액)...................2.00

1,3-부틸렌글리콜.............................3.00

에탄올.......................................5.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 팩을 제조하였다.

제제예 5. 미용액 제조

실시예 13의 캄페롤...........................2.00(%)

히드록시에틸렌셀룰로오스(2 % 수용액).........12.00

크산탄검(2 % 수용액)..........................2.00

1,3-부틸렌글리콜...............................6.00

진한 글리세린..................................4.00

히알루론산나트륨 (1 % 수용액)..................5.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 미용액을 제조하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 분해 반응을 통해 얻어진 녹차 유래의 캄페롤은 항노화 효과와 함께 지질 과산화 억제 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과를 통해 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 지질 산화물인 스쿠알렌 모노퍼옥시드로부터 유도된 주름을 개선하는 효과를 나타내며, 엘라스타아제 및 콜라게나아제의 발현 억제 효과를 통해, 이 두 가지 활성의 복합 상승 작용으로 피부 탄력을 향상시키는 효과를 나타내므로, 이를 포함하는 피부 외용제 조성물은 항노화용, 주름 개선용, 및 피부 탄력 향상용 화장료 조성물 또는 약학 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (17)

1. 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 분해시켜 얻어진 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항노화용 피부 외용제 조성물.
2. 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 분해시켜 얻어진 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
3. 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 분해시켜 얻어진 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 탄력 향상용 피부 외용제 조성물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 효소를 이용하여 46 내지 50 시간 동안 분해시켜 얻어진 것임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 캄페롤 함량이 90%이상인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산은 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 캄페롤 배당체에서 당 부분을 제거하여 캄페롤을 분리하는 엑소(exo) 당결합 분해 효소인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 엑소 당결합 분해 효소는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(Xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 구성되는 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
10. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소를 생산하는 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
11. 제 2항에 있어서, 상기 주름은 자외선에 의해 생성된 지질 과산화물인 스쿠알렌 모노퍼옥시드로부터 유도되는 주름인 것을 특징으로 하는 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
12. 제 2항에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 지질 과산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
13. 제 2항에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 콜라겐 생합성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
14. 제 3항에 있어서, 상기 녹차 유래의 캄페롤은 엘라스타아제 및 콜라게나아제 발현 억제를 통해 두 가지 활성의 복합 상승 작용으로 피부 탄력을 향상시키는 것을 특징으로 하는 피부 탄력 향상용 피부 외용제 조성물.
15. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화 장료 조성물임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
16. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 약학 조성물임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
17. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 녹차 유래의 캄페롤을 조성물 총중량에 대해 0.0001∼10중량％의 양으로 함유함을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.

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