KR20130119212A

KR20130119212A - 녹차 종자 유래의 ２１-ｏ-안젤로일데아사포젠올 ｅ３ 성분을 함유하는 항산화 또는 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20130119212A
Application number: KR1020120042191A
Authority: KR
Inventors: 박준성; 심진섭; 황경환; 강영규; 박준호; 염명훈; 조준철
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2012-04-23
Filing date: 2012-04-23
Publication date: 2013-10-31
Also published as: KR101921903B1

Abstract

본 발명은 녹차 종자 유래의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 성분을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 미백용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 분해 반응을 통해 종차 종자 추출물로부터 얻어진 녹차 종자 유래의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 성분을 유효성분으로 함유함으로써 우수한 항산화 및 미백 효능을 가지는 조성물에 관한 것이다.

Description

녹차 종자 유래의 ２１-Ｏ-안젤로일데아사포젠올 Ｅ３ 성분을 함유하는 항산화 또는 미백용 조성물{Composition for antioxidation or whitening containing 21-O-angeloyltheasapogenol E3 from green tea seed}

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하게 되고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부에 여러 가지 문제를 발생시킨다. 안정한 상태로 존재하던 산소가 효소, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학 반응과 같은 환경적 및 생화학적 요인 등에 의해 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O₂ ^-), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical, OH'), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중항산소(singlet oxygen, ¹O₂) 등과 같이 반응성이 큰 활성산소(reactive oxygen species: ROS)로 전환되면 인체의 세포구성 성분인 단백질, 지질 및 DNA 등을 비가역적으로 파괴할 수 있다. 이러한 활성산소의 작용은 체내 방어기구인 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라제(catalase), 퍼옥시다제(peroxidase), 글루타치온(glutathione) 등의 항산화성 효소 및 비타민 C(vitamin C, ascorbic acid), 비타민 E(tocopherol) 등과 같은 항산화 물질의 작용에 의하여 최소화될 수 있다. 그러나, 이러한 생체 방어력에 이상이 생기거나 과도한 활성산소에 노출될 경우에는 잔여 또는 과잉의 활성산소가 생체에 치명적인 산소독성을 일으키고, 세포구성 성분인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴를 유도하여 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파키슨 병과 같은 뇌질환, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병을 일으킨다고 알려져 있다(Cross 등, Ann. Intern. Med., 1987, 107, 526; Alderson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988,85, 2706).

천연 항산화제의 개발을 위하여 많은 천연물 유래의 원료들이 연구되어 왔는데, 대부분의 천연물 유래의 원료들은 단순추출물의 형태로 사용되어 왔고, 그 추출물들이 보이는 효능이 정확하게 어떤 물질에 의한 것인지 밝혀지지 않고 경험과 구전에 의해 화장료 등에 사용되고 있는 것이 현실이다.

한편, 사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다.

이중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.

이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은, 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.

또한, 레저 인구의 증가로 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.

이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체들, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고, 보다 우수한 항산화 및 미백 효과를 나타내는 물질을 찾고자 연구한 결과, 녹차 종자 추출물로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생성하는 미생물을 이용한 분해반응을 통해 얻어진 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 성분이 우수한 항산화 및 미백 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 녹차 종자 추출물로 얻은 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 성분을 함유하는 항산화 또는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 유효성분으로 함유하는 항산화용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 유효성분으로 함유하는 미백용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에서의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 DPPH 및 ROS 생성 억제 효능을 갖는 항산화 효과와 함께 멜라닌 생성을 억제하고, 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 색소 침착을 개선하는 효과에 기인한 우수한 미백 효과를 나타내며, 따라서 본 발명에 의한 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 항산화, 미백용 화장료 조성물 또는 약학 조성물 등의 피부 외용제 조성물, 또는 식품 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3(21-O-angeloyltheasaponenol E3)을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.

상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 바람직하게는 녹차 종자로부터 유래한 것이다.

본 발명에서 사용하는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 사포닌 조 추출물을 수득하는 제1 단계; 및 상기 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 분리하는 제2 단계;를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.

제1 단계: 사포닌 조 추출물의 수득

식물, 특히 녹차 종자로부터 사포닌 조 추출물을 얻는다. 이 때, 추출용매로서는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 유기용매로서는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매 또는 이들과 물의 혼합물, 바람직하게는 50% 에탄올을 사용할 수 있다.

식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 사포닌 조 추출물을 수득하기 위하여, 식물에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3 배의 물 또는 유기용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5회 교반하면서 추출하여 탈지시킨다. 탈지된 식물에 약 1 내지 8배, 바람직하게는 약 4배의 물 또는 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20℃에서 1 내지 3일간 침적시킨다. 그 다음, 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한다. 수층을 유기용매를 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 유기용매 엑기스를 얻은 다음, 이를 소량의 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등에 녹인다. 그 다음, 대량의 에틸아세테이트, 아세토니트릴(acetonitrile) 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜, 본 발명의 사포닌 조 추출물을 수득할 수 있다.

제2 단계: 21-O- 안젤로일데아사포젠올 E3 의 분리

상기 제1 단계에서 수득한 사포닌 조 추출물을 가수분해하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 분리할 수 있으며, 가수분해는 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 행할 수 있다.

상기 산으로는 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매, 바람직하게는 50% 에탄올과의 혼합용매를 사용할 수 있다.

산을 이용하여 가수분해를 행할 경우, 사포닌 조 추출물에 0.1~2N, 바람직하게는 1N 농도의 산, 또는 산과 알코올의 혼합용매를 1~10%의 양으로 가한 후, 50~100℃, 바람직하게는 80℃ 수욕조에서 0.5~8시간, 바람직하게는 1시간 동안 가열 환류시킨다.

상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기, 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매, 바람직하게는 50% 부탄올과의 혼합용매를 사용할 수 있다.

염기를 이용하여 가수분해를 행할 경우, 사포닌 조 추출물을 물 또는 물과 에탄올 혼합용매에 녹인 후, 0.1~2N, 바람직하게는 1N 농도의 염기, 또는 염기와 알코올의 혼합용매를 1~10%의 양으로 가한 후, 50~100℃, 바람직하게는 100℃ 수욕조에서 0.5~24시간, 바람직하게는 12시간 동안 가열 환류시킨다.

상기 효소는 당 결합을 분해하는 효소로서 녹차 사포닌의 당부분을 제거하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 생성하는 것을 특징으로 한다. 이 효소는 상업적으로 시판되는 것을 사용하거나 필요에 따라 제조하여 사용할 수 있으며, 특히 상기 효소를 생산하는 미생물로부터 얻을 수 있다.

또한, 상기 효소로는 더욱 바람직하게는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다아제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 상기 효소를 생산하는 미생물로는 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

효소를 이용하여 가수분해를 행할 경우, 사포닌 조 추출물을 5 내지 20배, 바람직하게는 약 10배의 산성완충용액에 용해시킨 다음, 효소를 0.001~10%의 양으로 첨가한다. 이를 약 25~37℃ 수욕상에서 약 40 내지 55시간, 바람직하게는 약 48시간 동안 교반하면서, 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80~100℃) 중에서 5 내지 15분 동안 가열하여 반응을 종료시킨다.

미생물을 이용하여 가수분해를 행할 경우, 사포닌 조 추출물을 5 내지 10배, 바람직하게는 약 10배의 이온수에 용해시킨 다음, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한다. 그 다음, 미리 배양된 미생물을 액체량 대비 5~10중량%로 접종하고, 20~30℃에서 2 내지 5일, 바람직하게는 5일 동안 배양 시킨 후, 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 배양액을 5,000~10,000rpm 으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 후 원심분리하여 침전물을 얻는다.

상기와 같이 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해 한 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1~5회 교반시킨다. 그 다음, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하고, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하며, 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 수득할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기와 같은 방법으로 제조할 수 있는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 조성물 총 중량에 대하여 (0.0001)~( 10 )중량%의 양으로 함유한다. 함량이 0.0001중량% 미만이면 상기 성분에 의한 항산화 또는 미백 효과를 얻을 수 없고, 함량이 10중량%를 초과하더라도 함량 증가에 비해 효과의 증가가 크지 않다.

본 발명의 조성물은 항산화 조성물로서 사용될 수 있으며, DPPH 및 ROS 생성 억제 효능이 우수하다.

또한, 본 발명의 조성물은 미백용 조성물로서 사용될 수 있으며, 멜라닌 생성을 억제하고, 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 색소 침착을 개선하는 효능이 우수하다.

본 발명의 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유하여 화장료 조성물 또는 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

또한, 본 발명의 조성물은 항산화 또는 피부 미백 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제형화될 수 있으며, 예를 들어 각종 식품류, 음료, 껌, 차 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 및 다양한 식품 첨가제의 형태 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 함유하는 외에는 다른 성분에 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 조성물 100ml 당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g이다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5중량%, 보다 구체적으로는 0.01~3중량%의 범위일 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 녹차 종자 추출물의 제조

녹차 종자 2㎏에 헥산 6ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 녹차 종자 1kg에 50% 에탄올 4ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500㎖로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 전체 1-부탄올층을 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 녹차 종자 추출물(사포닌 조 추출물) 300g을 수득하였다.

[실시예 2] 산 가수분해 방법에 의한 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g에 20배(v/w)의 1N HCl-50% 메탄올 용액(v/v)을 가하여, 80℃ 수욕조에서 8시간 동안 가열 환류시켜, 녹차 종자 조 사포닌에 결합된 당들을 가수분해시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 3회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 후, 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=7:1~3:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 0.55g을 수득하였다.

[실시예 3] 염기 가수분해 방법에 의한 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 건조피리딘(500㎖)에 녹이고, 여기에 소디움 메톡사이드(sodium methoxide)(powder, 10g)를 가해 유욕상에서 8시간 동안 환류 반응시켜, 녹차 종자 사포닌에 결합된 당들을 가수분해시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 3회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 후, 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 0.35g을 수득하였다.

[실시예 4] 효소분해 방법에 의한 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 10g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 2.5g(헤스페리디나제 0.5g, 나린지나제 0.5g, 셀룰라제 0.5g, β-글루쿠로니다제 0.2g, β-갈락토시다제 0.5g, 아밀로글루코시다제 0.3g; Sigma사 제조)을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 48시간 동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 녹차 사포닌이 소실되면 열수(80~100℃) 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 3회 교반시킨 후, 침전물을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 후, 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올= 8:1~4:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 1.02g을 얻었다.

[실시예 5] 미생물을 활용한 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 100㎖의 이온수에 용해 시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하여 30℃에서 5일 동안 배양 시킨 후 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실된 것을 확인하고 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 후 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 3회 교반시킨 후, 침전물을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 후, 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 0.72g을 얻었다.

[시험예 1] DPPH 생성 억제 시험(DPPH test)

유기 라디칼인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)의 환원에 의해(항산화제는 산화됨) 발생되는 흡광도의 변화를 통해 항산화능을 평가하는 방법을 사용하였다. 항산화도는 DPPH의 산화가 억제되어 흡광도가 대조군에 비해 감소되는 정도를 측정하여, 대조군의 흡광도에 비해서 50％ 이하의 흡광도를 나타내는 농도(IC₅₀)를 유효 항산화 농도로 평가하였다.

100μM(in 에탄올) DPPH 용액 190㎕를 실시예 1의 녹차 종자 추출물, 실시예 2 내지 5의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 및 대조시료를 각각 10㎕씩 혼합하여 반응액을 준비하였다. 혼합된 반응액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조시료로는 합성 항산화제로 널리 사용되고 있는 트롤록스(Trolox)를 사용하였다. 각각의 경우에 대한 DPPH 분석 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

시료	IC₅₀(ppm)
실시예 1	450.24
실시예 2	7.73
실시예 3	7.52
실시예 4	7.47
실시예 5	7.53
트롤록스	8.64

상기 표 1의 결과로부터, 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 매우 우수한 항사화능을 가지며, 공지된 항산화제인 트롤록스보다도 항산화능이 더 우수함을 알 수 있다.

[시험예 2] 형광물질을 이용한 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 생성 억제능 시험

시험에 사용한 세포주는 인간 각질형성세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로 형광측정용 96공 블랙 플레이트에 각 공당 2.0x10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10％) 배지를 사용하여 37℃, 5％ CO₂ 조건에서 1 일간 배양한 후 시험시료를 처리하였다. 시험시료로는 실시예 1의 녹차 종자 추출물, 실시예 2 내지 5의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 및 대조시료를 50ppm씩 사용하였고, 대조시료로는 합성 항산화제로 널리 사용되고 있는 트롤록스(Trolox)를 사용하였다. 그 후 배지로 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 무혈청 DMEM(FBS free)을 사용하여, 37℃, 5％ CO₂ 조건에서 1 일간 배양하였다.

시험시료를 넣고 24 시간 배양한 후, HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA(2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, Inc)를 100㎕ 가한 후, 37℃, 5％ CO₂ 조건에서 20분간 배양하고 HCSS로 세척하였다. 이 후 시료로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 다음, 초기에 ROS로 산화된 DCF (dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485 nm, Em=530nm)로 형광 강도를 측정하였다. 이 후 UVB(30mJ/cm²)를 조사하고 처리 직후 및 처리 3시간 후의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485nm, Em=530nm)로 형광 강도를 측정하였다.

DMSO를 사용한 사용한 경우를 대조군으로 하여 이를 기준으로 각 시험물질의 ROS 생성억제능을 구하였으며(대조군의 ％), 실험 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

시료(50ppm)	생성 억제능(%)
대조군 (DMSO)	00
실시예 1	25
실시예 2	61.7
실시예 3	61.5
실시예 4	61.2
실시예 5	62.1
트롤록스	51.7

상기 표 2의 결과로부터, 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 ROS 생성 억제능을 우수하며, 공지된 항산화제인 트롤록스보다도 ROS 생성 억제능이 더 우수함을 알 수 있다.

[시험예 3] 쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM에 10% 우태반 혈청, 100nM 2-O-테트라데카노일포르볼(tetradecanoyphorbol)-13-아테이트, 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 10⁵세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양하였으며, 이틀째부터 3일 연속으로 각 시험시료를 10ppm씩 첨가하였다. 시험시료로는 실시예 1의 녹차 종자 추출물, 실시예 2 내지 5의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 및 대조시료를 사용하였고, 대조시료로는 공지된 미백제인 하이크로퀴논을 사용하여 양성대조군으로 하였으며, 시험시료를 처리하지 않은 것을 음성대조군으로 하였다. 시험시료의 첨가 후 37℃, 5％ CO₂ 조건에서 1일간 배양한 다음, 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 결과를 하기 수학식 1에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다(Dooley의 방법).

시험물질	멜라닌 생성 억제율(%)
비처리군(음성대조군)	00.0
실시예 1	75.3
실시예 2	75.2
실시예 3	75.7
실시예 4	74.9
실시예 5	75.1
하이드로 퀴논(양성대조군)	41.1

상기 표 3의 결과로부터, 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 우수한 멜라닌 생성 억제율을 보이며, 공지된 미백제인 하이드로퀴논보다도 더 우수한 멜라닌 생성 억제율을 보임을 확인할 수 있다.

[시험예 4] 인체 피부에 대한 미백 효과 시험

상기 실시예 4의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3에 대한 인체 피부에 대한 미백 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 건강한 12 명의 남자를 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5㎝의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5~2 배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다.

자외선 조사 후, 실시예 4의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 1%(용매는 1,3-부틸렌그리콜:에탄올 = 7:3), 하이드로 퀴논 1%, 및 용매(vehicle)(음성 대조군) 1%를 각각 도포하였으며, 한 곳은 아무것도 바르지 않은 상태에서, 10주 동안 상태변화를 관찰하였다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다.

그 다음 상기 각 시험물질의 도포 개시시점과 도포 완료시점에서의 피부색의 차이(△L*)를 하기 수학식 2에 따라 계산하고, 이를 하기 표 4에 나타내었다. 한편, 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 △L*의 비교로 판정하며, △L* 값이 2정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

시험물질	피부색 밝기 정도(△L*)
실시예 4	1.80± 0.21
하이드로 퀴논(양성 대조군)	1.90± 0.11
용매(Vehicle)(음성 대조군)	0.50± 0.15

상기 표 4의 결과로부터, 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 피부색을 밝게 하였으며, 공지된 미백제인 하이드로퀴논과 유사한 정도의 피부색 밝기 정도를 보임을 확인할 수 있다. 이는 본 발명에서 사용되는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3이 자외선에 의해 생성된 색소 침착을 개선하여 피부색을 밝게 하기 때문인 것으로 판단할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표현되는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 유효성분으로 함유하는 항산화용 피부 외용제 조성물.
[화학식 1]
하기 화학식 1로 표현되는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 피부 외용제 조성물.
[화학식 1]
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량%의 양으로 함유되는 피부 외용제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 녹차 종자 유래의 것인 피부 외용제 조성물.
제4항에 있어서, 상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 녹차 종자 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 분해시켜 얻어진 피부 외용제 조성물.