KR20130079220A

KR20130079220A - 콩뿌리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR20130079220A
Application number: KR1020120151679A
Authority: KR
Inventors: 강영규; 박준성; 황경환; 심진섭; 염명훈; 조준철
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2012-01-02
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2013-07-10
Also published as: KR102063686B1

Abstract

본 발명은 콩의 생육 단계 중 특정 단계의 콩 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은, 항산화능이 우수하고, 항노화능이 우수할 뿐 아니라, 피부 보습 효과 및 피부 미백 효과를 가지면서, 천연 유래의 성분을 함유하여 피부 자극감이 없어서 유용하다.

Description

콩뿌리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물{SKIN EXTERNAL COMPOSITION CONTAINING EXTRACT OF SOYBEAN ROOT}

본 발명은 콩의 생육 단계 중 특정 단계의 콩 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하게 되고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가되며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙하게 되고, 피부트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.

노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산, 및 당단백질의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타나게 되고, 자유 라디칼 및 활성 유해 산소에 의한 산화적 스트레스를 받게 된다. 또한 노화가 진행되거나 자외선에 의해서, 피부를 구성하는 대부분의 세포에서는 염증을 일으킨다고 알려져 있는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생성하는 효소인 사이클로옥시게나제-2(Cox-2, cyclooxygenase)의 생합성이 증가하고, 이들 염증성 인자에 의해 피부조직을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP, Matrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의한 NO(nitric oxide)생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 즉 자연적으로 진행되는 내인성 노화에 따른 세포 활성의 감소 및 미세염증에 의해 기질물질의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해 및 변성이 가속화되어 피부기질이 파괴되고 얇아지면서 피부 노화의 제반 증상들이 나타나게 된다. 따라서, 이러한 노화의 현상들을 방지하고, 개선시킬 수 있는 활성성분에 대하여 많은 연구가 행해지고 있는 것이 현실이다.

한편, 체내 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질 및 광화학반응 등의 각종 물리적, 화학적 및 환경적 요인 등에 의하여 생성되는 활성산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당 및 DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로써 세포노화 또는 암을 비롯한 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 이들 활성산소에 의한 지질과산화의 결과로 생성되는 지질 과산화물을 비롯한 여러 가지 체내 과산화물도 세포에 대한 산화적 파괴를 일으켜 각종 기능장애를 야기함으로써 여러 가지 질병의 원인이 되기도 한다. 따라서, 이와 같은 자유 라디칼을 소거할 수 있는 화합물(free radical scavengers) 또는 과산화물 생성 억제물질과 같은 항산화제들이 이들 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료제로서 기대되고 있다.

이에 본 발명자들은 콩뿌리 추출물을 피부에 적용하였을 때, 피부의 항산화 및 항노화 기능 뿐만 아니라 미백 및 보습기능 역시 증진시킬 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 공개특허 특1998-077876호

본 발명의 목적은 피부 건강을 증진시키는 천연 유래의 피부 외용제 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콩뿌리 추출물을 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은, 항산화능이 우수하고, 항노화능이 우수할 뿐 아니라, 피부 보습 효과 및 피부 미백 효과를 가지면서, 천연 유래의 성분을 함유하여 피부 자극감이 없어서 유용하다.

도 1은 생장 시기에 따른 콩뿌리 추출물 내의 쿠메스트롤 함량을 나타낸 것이다.
도 2 는 유도 인자를 처리하여 재배한 V4 시기의 콩뿌리 추출물과 이를 처리하지 않고 재배한 V4 시기의 콩뿌리 추출물에 존재하는 쿠메스트롤의 함량을 비교한 것이다.

본 발명은 일 관점에서 콩뿌리 추출물을 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 명세서의 콩뿌리 추출물의 추출과정에 있어서 예를 들면, 세척하고 건조된 세말화된 콩뿌리 가루를 물 또는 유기용매에 넣고 추출하여 침적시킨 후 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 콩뿌리 추출물을 얻을 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들 유기용매와 물의 혼합용매에서 선택될 수 있으며, 원료의 안전성을 고려할 때 바람직하게는 물 또는 30~70% 농도의 에탄올을 사용한다. 상기에서 용매를 이용하여 추출물을 얻은 이후 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무 건조 또는 동결 건조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법이라면 제한없이 사용하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 콩뿌리 추출물은 콩의 생육단계 중 V3 내지 V4 단계의 콩으로부터 추출될 수 있다.

본 명세서에서, 콩의 생육 단계는 다음과 같다.

VE 시기: 종자를 심은 후 1~2주 후 상태, 토양으로 부터 떡잎이 올라옴

VC 시기: 떡잎이 활짝 피며, 그 위로 한마디가 자라나고 외엽이 생성됨

V1 시기: 첫번째 외엽으로 부터 한마디가 생성 되어 3개의 잎이 생성됨

V2 시기: V1 Stage에서 한마디가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨

V3 시기: V2 Stage에서 한다미가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨

V4 시기: V3 Stage에서 한다미가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨

R2 시기: 콩꽃이 활짝 핀 상태

R4 시기: 콩깍지 생성이 완료된 상태

R5 시기: 콩깍지 안에 콩이 생성되어 지는 상태

R6 시기: 콩깍지 안에 녹색의 콩이 생성 완료된 상태

R7 시기: 콩깍지와 콩이 노란색으로 변해 가는 상태

R8 시기: 잎 떨어지면서 콩깍지와 콩이 완전히 노란색으로 변한 상태

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 콩은 상기와 같은 콩의 생육 단계에 있어서, 유도인자를 처리한 콩을 포함한다. 유도인자를 처리한 콩은 쿠메스트롤 함량이 증가하게 되어 본 발명이 목적하는 효과 즉, 항산화능, 항노화능, 피부 보습 효과 및 피부 미백 효과에 있어서 더 우수한 효과를 보일 수 있다.

본 명세서에서 상기 유도인자는 콩의 생육 과정 중에 처리되어 콩뿌리의 쿠메스트롤의 함량을 증진할 수 있는 인자를 의미한다. 구체적으로, 누룩균 (Aspergillus oryzae) 또는 키토산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유도인자는 콩이 자라는 토양에 처리하거나, 콩뿌리에 직접 처리하거나 또는 주사 등에 의해 투입할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 유도인자가 콩에 흡수되어 콩뿌리의 쿠메스트롤의 함량을 증진시킬 수 있는 경로라면 제한없이 적용가능하다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 콩뿌리 추출물은 쿠메스트롤 (coumestrol)을 추출물 전체 중량에 대하여 0.2 중량%이상 포함할 수 있다. 본 명세서의 콩뿌리 추출물은 유도인자를 처리한 콩을 추출한 물질이어서, 쿠메스트롤을 상기 범위로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 콩뿌리 추출물은 쿠메스트롤을 0.24중량% 이상, 0.28중량% 이상, 0.32중량% 이상, 0.36중량% 이상, 0.4중량% 이상, 0.44중량% 이상 또는 0.48중량% 이상으로 함유할 수 있다.

본 발명의 일 관점에 있어서, 상기 콩은 콩의 생육 단계 중 V4 단계까지 유도인자를 처리한 콩을 포함한다. VE 시기부터 V4시기까지 정기적으로 유도인자를 투입하면 쿠메스트롤의 함량을 현저하게 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 유도인자는 누룩균 (Aspergillus oryzae) 및 키토산으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 콩뿌리 추출물은 쿠메스트롤 (coumestrol)을 추출물 전체 중량에 대하여 0.12중량% 이상 함유할 수 있다. 본 명세서의 콩뿌리 추출물은 V3 내지 V4 단계의 콩을 추출한 물질이어서, 쿠메스트롤을 상기 범위로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 콩뿌리 추출물은 쿠메스트롤을 0.13중량% 이상, 0.14중량% 이상, 0.15중량% 이상, 0.16중량% 이상, 0.17중량% 이상, 0.18중량% 이상 또는 0.19중량% 이상으로 함유할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 콩뿌리 추출물은 쿠메스트롤 (coumestrol)을 추출물 전체 중량에 대하여 0.12 내지 0.2중량%로 함유할 수 있다. 쿠메스트롤 (coumestrol)이 0.12중량% 미만으로 함유되면, 본 발명의 효능이 충분히 발휘되지 않으며, 0.2중량%를 초과하여 함유되는 경우, 다른 유효성분의 함량비가 지나치게 줄어드는 것으로 확인되었다. 상기와 같은 관점에 있어서, 본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물은 0.125 내지 0.195중량%, 0.13 내지 0.19중량%, 0.135 내지 0.185중량%, 0.14 내지 0.18중량% 또는 0.145 내지 0.175중량%의 콩뿌리 추출물을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 콩은 서리태 (Seoritae, Glycin max MERR), 서목태 (Seomoktae, Rhynchosia Nolubilis), 흑태 (Black soybean, Glycine max(L.) Merr.), 청태 (blue bean, Glycime max MERR ), 황태 (yellow bean, Glycime max MERR), 울타리콩 (field bean, Vicia faba), 강낭콩 (kidney bean, Phaseolus vulgaris), 얼룩강낭콩 (pinto bean, Phaseolus vulgaris L.), 적두 (small red bean, Vigna angularis), 거두 (small black bean, Phaseolus angularis W.F. WIGHT. ), 콩나물콩 (sprouting bean, Glycine max (L.) Merr.) 및 대두 (soybean, Glycine max)로 구성된 군으로쿠터 선택되는 하나 이상의 콩을 포함할 수 있고, 상기 콩은 구체적으로 대두 (Glycine max)일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 조성물 총 중랑에 대하여 0.001~10중량%의 콩뿌리 추출물을 포함할 수 있다. 이는 추출물의 함량이 0.001중량% 미만이면 항산화, 항노화, 미백 및 보습 효과가 미미하고, 10중량%를 초과하면 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않기 때문이다. 상기와 같은 관점에 있어서, 본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대하여, 0.005~9.5중량%, 0.01~9중량%, 0.03~8.5중량%, 0.05~8중량%, 0.07~7.5중량%, 0.09~7중량%, 0.1~6.5중량%, 0.3~6중량%, 0.5~5.5중량% 또는 0.7~5중량%의 콩뿌리 추출물을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)의 산화를 억제시키는 항산화용인 피부 외용제 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 콜라게나제의 발현을 억제하는 항노화용인 피부 외용제 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌의 생성을 억제하는 미백용인 피부 외용제 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 피부장벽기능 강화 또는 각질형성세포의 분화를 유도하는 보습용인 피부 외용제 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물을 포함한다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물을 화장료의 형태로 제형화할 경우, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스 또는 팩 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용제 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 제형은 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 점적제, 좌제(坐劑), 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 100mg/kg/일, 보다 구체적으로는 5 mg/kg/일 내지 50 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

콩뿌리 추출물의 제조

생장 시기별 (VE~R8 시기, 총 12시기)로 채취한 각각의 콩뿌리를 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화하였다. 상기 콩뿌리 가루 100g을 70% 에탄올 수용액 1리터에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 12시간 끓여서 추출한 후, 300 메쉬 여과포로 여과하였다. 그 후, 상기 여과액을 4-15℃도에서 7일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번 여과지로 여과시켰다. 상기 추출액을 3 리터 분액 깔때기에 넣고 에칠아세테이트 1리터를 가한 후, 흔들어서 섞어준 다음 두 층으로 완전히 분리되면 상층(에틸아세테이트 층)을 취한다. 하층(물층)을 다시 분액 깔대기로 두 번 더 추출한다. 각각의 분리된 상층을 모두 합한 뒤 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 50℃로 감압 농축하고 건조하였다.

생장 시기별 콩뿌리 추출물 내의 쿠메스트롤 함량 분석

상기 실시예 1에서 얻어진 각각의 생장 시기별 콩뿌리 추출물에서 쿠메스트롤 (coumestrol) 함량의 정량 분석을 위하여 HPLC를 이용하였다. 쿠메스트롤은 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 본 실시예에서는 Indofine Chemical 사에서 구매한 쿠메스트롤 을 사용하였다.

생장 시기에 따른 콩뿌리 추출물 내의 쿠메스트롤 함량은 도 1과 같다.

콩의 생육 기간 중 유도 인자 처리를 통해 얻은 콩뿌리 추출물 내의 쿠메스트롤 함량 분석

콩의 생육 기간 중 V4 시기까지 누룩균 (Aspergillus oryzae) 을 토양 및 콩에 처리하여 재배 하였다. 누룩균 (Aspergillus oryzae) 건조균체는 ㈜메디오젠에서 구입하였다. 콩에 처리하기 하루 전에, 설탕 10g을 1L의 물에 녹인 후, 누룩균 (Aspergillus oryzae) 건조균체 10g을 잘 섞었다. 그 후, 진탕항온기에서 30도의 온도로 12시간동안 배양하였다. 배양 후, 물조루를 이용하여 콩대 및 콩대 주변 토양에 잘 스며들도록 뿌려주었다. 이 때, 대조군은 동량의 정제수를 뿌려주었다. 누룩균 (Aspergillus oryzae)의 처리는 5일 간격으로 하였다. V4 시기에 채취한 콩뿌리를 실시예1과 같은 방법으로 추출하여 콩뿌리 추출물을 얻었고, 실시예 2의 방법으로 콩뿌리 추출물 내의 쿠메스트롤 함량을 분석한 결과는 도 2와 같았다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 유도 인자를 처리함으로써 콩뿌리 추출물내의 쿠메스트롤 함량을 약 1.6배 가량 증가 시킬 수 있었다.

항산화능 시험

상기 실시예 1에서 제조한 VE/V2/V4/R4/R8 단계 각각의 콩뿌리 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위하여, 유기 라디칼인 DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질; 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)의 환원에 의해 발생하는 흡광도의 변화를 통해 DPPH 산화 억제 효능을 비교하였다.

100μM(in 에탄올) DPPH 용액 190㎕와 상기에서 수득한 실시예 1의 VE/V2/V4/R4/R8 시기의 콩뿌리 추출물 및 합성 항산화제인 트롤록스 (양성대조군)를 각각 10㎕씩 넣어 반응액을 만들고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 분석 결과는 하기 표 1에 나타내었으며, IC₅₀은 첨가한 시료에 의해 흡광도가 50％ 감소했을 때의 시료 농도를 의미한다.

시험물질	IC₅₀(ppm)	V4 시기 콩뿌리 추출물과 유사 효능을 나타내기 위한 농도 비
트롤록스(양성대조군)	46
VE 시기 콩뿌리 추출물	95	5.2배
V2 시기 콩뿌리 추출물	72	3.4배
V4 시기 콩뿌리 추출물	49	1배
R4 시기 콩뿌리 추출물	77	2.5배
R8 시기 콩뿌리 추출물	91	3.9배

상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, VE/V2/V4/R4/R8 각각의 단계에서 얻어진 콩뿌리 추출물 중에서 V4 단계의 콩뿌리 추출물에서 가장 우수한 항산화능을 나타냄을 알 수 있었다. 아울러, V4 단계의 콩뿌리 추출물은 트롤록스와 유사한 효능 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

항노화능 시험

상기 실시예 1에서 제조한 VE/V2/V4/R4/R8 단계 각각의 콩뿌리 추출물의 콜라게나제 (collagenase) 생성 억제능을 토코페롤(비교예 1) 및 EGCG(비교예 2)와 비교하여 측정하였다. 토코페롤 및 EGCG는 피부의 표피 세포를 재생시켜 피부의 노화를 방지하는 기능이 있는 것으로 알려진 물질이다.

2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어 있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/웰(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 다음, 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 실시예 1의 VE/V2/V4/R4/R8 시기의 콩뿌리 추출물 100㎍/ml농도, 토코페롤 및 EGCG 각각을 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다.

콜라게나제 측정기구 (미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 채취한 세포배양액의 콜라게나제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게나제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다.

3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후, 발색 유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응 (발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띠게 되는데, 반응의 진행 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타남을 확인하였다.

노란색을 띠는 96-웰 플레이트 (96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하였고, 하기 수학식 1에 의해 콜라게나제의 합성 정도를 계산하였다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군의 채취된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다. 즉, 비처리군에서의 콜라게나제의 발현 정도를 100으로 하고, 이에 대비하여 시험물질을 처리한 군에서의 콜라게나제의 발현 정도를 구하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

시험물질	콜라게나제 발현 정도(%)	V4시기 콩뿌리추출물과 유사효능을 나타내기 위한 농도 비
비처리군	100	-
토코페롤(비교예 1)	76	-
EGCG(비교예 2)	59	-
VE 시기 콩뿌리 추출물	84	4.9배
V2 시기 콩뿌리 추출물	77	3.2배
V4 시기 콩뿌리 추출물	55	1배
R4 시기 콩뿌리 추출물	72	2.7배
R8 시기 콩뿌리 추출물	81	4.1배

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, V4 시기 콩뿌리 추출물은 시험관내(in vitro)에서 콜라게나제의 발현을 효과적으로 억제하였으며, 항산화 물질로 알려져 있는 토코페롤보다도 콜라게나제의 발현 억제능이 우수함을 확인할 수 있었다.

미백 효능 시험

상기 실시예 1에서 제조한 VE/V2/V4/R4/R8 시기의 콩뿌리 추출물의 멜라닌 생성 억제능을 하이드로퀴논 (양성 대조군)과 비교하여 측정하였다.

C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM에 10% 우태반 혈청, 100nM 12-O-테트라데카노일포르볼(tetradecanoylphorbol)-13-아세테이트, 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양한 다음, 이틀째부터 3일 연속으로 각 시기의 콩뿌리 추출물 및 하이드로퀴논을 10ppm씩 가하여 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고, PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 다음, 하기 수학식 2에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다(Dooley의 방법).

시험물질	멜라닌 생성 억제율 (%)	V4 시기 콩뿌리 추출물과 유사 효능을 나타내기 위한 농도 비
비처리군	100
하이드로퀴논(양성 대조군)	48.5
VE 시기 콩뿌리 추출물	82.3	5.6배
V2 시기 콩뿌리 추출물	64.8	2.7배
V4 시기 콩뿌리 추출물	47.8	1배
R4 시기 콩뿌리 추출물	62.1	2.4배
R8 시기 콩뿌리 추출물	81.3	5.2배

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 VE/V2/V4/R4/R8 시기의 콩뿌리 추출물 중에서 쿠메스트롤 함량이 가장 우수한 V4 시기 콩뿌리 추출물은 공지된 미백 물질인 하이드로퀴논과 유사한 정도의 멜라닌 생성 억제율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

피부 보습 시험

일차 배양한 인간의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 후, VE/V2/V4/R4/R8 시기의 콩뿌리 추출물 각각을 10 mg/ml 농도로 배양액에 첨가하여, 세포가 바닥 면적의 80~90% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이 세포를 수확하여 PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 뒤, 2% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)와 20mM 농도의 DTT (Dithiothreitol)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액 (Tris-HCl, pH 7.4) 1㎖를 가하여 3분간 소니케이션 (sonication)하고 난 후, 10분간 끓였다. 그 후, 이를 1200rpm으로 30분간 원심 분리하고 침전물을 분리하여 PBS 1㎖에 현탁시킨 후, 340nm에서 흡광도를 측정하였다.

이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액 일부를 취하여 단백질 함량을 측정하여, 세포 분화 정도의 평가시 기준으로 삼았다. 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘 농도에 시험물질을 첨가하여 실시한 시험 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

시험물질	사용농도	각질형성세포에서의 분화능 (%)	V4시기 콩뿌리 추출물과 유사 효능을 나타내기 위한 농도비
대조군	Low Ca²⁺(0.03 mM)	100
대조군	High Ca²⁺(1.2 mM)	206
VE 시기 콩뿌리 추출물	10 mg/ml	118	5.8배
V2 시기 콩뿌리 추출물	10 mg/ml	134	3.9배
V4 시기 콩뿌리 추출물	10 mg/ml	182	1배
R4 시기 콩뿌리 추출물	10 mg/ml	156	3.1배
R8 시기 콩뿌리 추출물	10 mg/ml	129	4.7배

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 각질형성세포 분화 시 생성되는 CE (Cornified Envelop)의 양을 측정하여 세포분화 촉진효과를 비교한 결과, 본 발명에 의한 VE/V2/V4/R4/R8 시기의 콩뿌리 추출물 중에서 쿠메스트롤 함량이 가장 우수한 V4 시기 콩뿌리 추출물은 각질형성세포에서 분화를 촉진하는 것을 알 수 있었다.

자극감 시험

공지된 미백 물질인 코직산과 본 발명에서 유효성분으로 사용되는 콩뿌리추출물의 사용성을 비교하기 위하여, 따가움, 화끈거림 등의 자극감에 민감한 패널 15명을 대상으로 따가움, 화끈거림 등 자극감의 정도를 실험하였다.

피험자에게 코직산(kojic acid, YM chemical 통해 구입)과 상기 실시예 1에서 얻은 V4 시기 콩뿌리 추출물을 각각 0.5㎖씩 좌우를 무작위로 바꾸어 적용하여 문지르고 0.1점 단위로 하여 0~3.0 사이의 점수를 매기도록 하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

<평가기준>

0 ~ 0.4: 자극 없음

0.5 ~ 1.0: 약간 자극이 있음

1.1 ~ 2.0: 보통 정도의 자극이 있음

2.1 ~ 3.0: 자극이 심함

구분	코직산	V4 시기 콩뿌리 추출물
따가움	0.81	0.24
화끈거림	0.39	0.22
평균	0.60	0.23

상기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 코직산의 경우는 따가움, 화끈거림이 어느 정도 있어 보통 약간 느낄 수 있는 정도의 자극감이 있는 것으로 나타났다. 반면, 본 발명에서 사용되는 V4 시기 콩뿌리 추출물은 화끈거림과 따가움 모두 거의 느낄 수 없을 정도여서 대체로 자극이 없는 것으로 나타냈다.

이하, 상기 피부 외용제 조성물의 제형예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제형예 1 로션

배합성분	중량%
콩뿌리 추출물	3.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.10
시트르산	0.05
백굴채 엑기스	0.20
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	to 100

제형예 2 크림

배합성분	중량%
콩뿌리 추출물	1.00
폴리에틸렌글리콜모노스테아레이트	2.00
자기유화형 모노스테아르산글리세린	5.00
세틸알코올	4.00
스쿠알렌	6.00
트리2-에틸헥산글리세릴	6.00
스핑고당지질	1.00
1,3-부틸렌글리콜	7.00
정제수	to 100

제형예 3 팩

배합성분	중량%
콩뿌리 추출물	5.00
폴리비닐알코올	13.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
라우로일히드록시프롤린	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글리콜	3.00
에탄올	5.00
정제수	to 100

제형예 4 미용액

배합성분	중량%
콩뿌리 추출물	2.00
히드록시에틸렌셀룰로오스 (2% 수용액)	12.00
크산탄검 (2% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글리콜	6.00
진한 글리세린	4.00
히알루론산나트륨 (1% 수용액)	5.00
정제수	to 100

제형예 5 연고

배합 성분	함량(중량%)
콩뿌리 추출물	0.1
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
밀납	4.0
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

콩뿌리 추출물을 포함하는 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서,
상기 콩뿌리 추출물은 쿠메스트롤 (coumestrol)을 추출물 전체 중량에 대하여 0.12 중량%이상 함유하고 있는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 콩은 콩의 생육단계 중 V3 내지 V4 단계의 콩인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 콩뿌리 추출물은 쿠메스트롤 (coumestrol)을 추출물 전체 중량에 대하여 0. 2 중량%이상 함유하고 있는, 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 콩은 콩의 생육 단계 중 유도인자를 처리한 것인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 콩은 콩의 생육 단계 중 V4 단계까지 유도인자를 처리한 것인, 조성물.
제5항에 있어서,
상기 유도인자는 누룩균 (Aspergillus oryzae) 및 키토산으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 콩은 대두인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 조성물 총 중랑에 대하여 0.001~10중량%의 콩뿌리 추출물을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 항산화용인, 조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)의 산화를 억제하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 항노화용인, 조성물.
제12항에 있어서,
상기 조성물은 콜라게나제 (collagenase)의 발현을 억제하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 미백용인, 조성물.
제14항에 있어서,
상기 조성물은 멜라닌의 생성을 억제하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 보습용인, 조성물.
제16항에 있어서,
상기 조성물은 피부장벽기능의 강화 또는 각질형성세포의 분화를 유도하는, 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인, 조성물.