CN111084739B - 包含豆科植物培养根的酶处理提取物的用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物,其含有作为有效成分的豆科植物培养根的酶处理提取物,所述酶处理提取物为在所述豆科植物培养根的提取物中添加有酶或生成该酶的微生物的物质。具体地,根据本发明的组合物,通过含有作为有效成分的包含高含量的对豆科植物培养根的提取物进行酶处理而获得的香豆雌酚的豆科植物培养根的酶处理提取物,从而可表现出优异的增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的效果。
Description
技术领域
本发明涉及用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物,其包含豆科植物培养根的酶处理提取物,尤其,涉及通过对豆科植物培养根的提取物进行酶处理来增加香豆雌酚的含量,从而表现出优异的增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的效果的组合物。
背景技术
因老化而导致的皮肤功能的下降,以及视觉美感的降低是人类的皮肤变化中最具代表性的变化。由于皮肤老化所导致的最终的皮肤外观上的表现包括皱纹的形成、皮肤弹性的降低、老年斑的形成等,而皱纹形成、弹性降低被认为是最典型的现象。
近年来,已经针对皮肤上皱纹形成与弹性降低的原因进行了许多生理研究,为了防止这种情况,目前采用的方法有,例如通过保湿剂来维持角质层中的水分、保护皮肤免受紫外线或环境的影响、促进新细胞活性等。已知,通常用于抑制皮肤老化的酶、脂溶性及水溶性抗氧化剂、自由基清除剂等具有预防因皮肤衰老所导致的皱纹形成、弹性降低的作用,而最近被受关注的抗衰老物质维生素A、α羟基酸等具有通过增强真皮中的胶原蛋白的合成来缓解已形成的皱纹并增强弹性的治愈作用。但是,在配制化妆品时,这些抗氧化剂、自由基清除剂、维生素A、α羟基酸等存在稳定性及皮肤稳定性等不佳的局限性。
因此,近年来为了解决这些问题,使用天然材料来制备化妆品已成为化妆品领域的焦点。
同时,香豆雌酚(coumestrol)是目前所知的最强效的植物雌激素,该物质主要被发现存在于豆科(leguminosae),菊科(compositae)植物的种子、根以及叶中,作为异黄酮(isoflavonoid)的一种,通常被分类为香豆草醚(coumestan)类化合物。当植物的外部受到损伤时,损伤区域会分泌高浓度的香豆雌酚,通过其抗氧化、抗炎及抗毒素作用以达到抗菌、抗真菌及抗病毒的效果,从而起到预防感染的作用,因此,香豆雌酚广受关注。而出现这种现象是因为,各种细菌及真菌、病毒等的感染会诱导包括的香豆雌酚在内的多种芳香族化合物(aromatic compounds)的合成。已知,香豆雌酚的这些抗生作用来自于具有作为抗氧化剂的化学基本骨架的酚类结构,因此可抑制自由基(free radicals)氧化剂的流入,以阻止体内过氧化化合物的生成。此外,在各种天然香豆草醚类衍生物中,只有香豆雌酚具有雌激素的效果。然而,由于只有部分植物中含有极微量的香豆雌酚,所以目前商用的天然香豆雌酚的市售价格较高。因此,虽然一直试图进行有关于通过合成来获得香豆雌酚的研究,但由于稠合有多个芳环的化学结构相当复杂,目前还没有公开过相关的容易实施的合成方法,尽管已经有了几种合成方法的相关报告,但是每种合成方法均存在诸多问题,因此难以实现商业化。此外,相对于通过化学合成制备的成分,大众对从天然物质中萃取的成分在安全性方面具有更好的印象,所以有必要研究可通过天然物质进行大量生产的方法。
[现有技术文献]
[专利文献]
(专利文献1)韩国专利公开号第10-1502687号;
(专利文献2)韩国专利公开号第10-0706279号。
发明内容
技术问题
在一个方面,本发明在于提供一种香豆雌酚的含量有增加的豆科植物培养根的酶处理提取物。
在一个方面,本发明在于提供一种用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物,其含有作为有效成分的包含高含量的香豆雌酚的豆科植物培养根的酶处理提取物。
技术方案
为了实现上述目的,在一个方面,本发明提供一种用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物,其含有作为有效成分的豆科植物培养根的酶处理提取物,所述酶处理提取物为在所述豆科植物培养根的提取物中添加有酶或生成该酶的微生物的物质。
在另一方面,本发明提供豆科植物培养根的酶处理提取物在制备用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物中的用途,所述酶处理提取物为在所述豆科植物培养根的提取物中添加有酶或生成该酶的微生物的物质。
在又一方面,本发明提供一种用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的豆科植物培养根的酶处理提取物,所述酶处理提取物为在所述豆科植物培养根的提取物中添加有酶或生成该酶的微生物的物质。
有益效果
根据本发明的组合物,其通过含有作为有效成分的豆科植物培养根的酶处理提取物而表现出优异的增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的效果,其中所述豆科植物培养根的酶处理提取物包含高含量的香豆雌酚,且所述香豆雌酚是对所述豆科植物培养根的提取物进行酶处理而获得。
附图说明
图1示出了酶反应前和反应后的豆培养根提取物中香豆素(Coumestrin)和香豆雌酚的HPLC色谱(高效液相色谱)确认结果。
图2示出了酶反应前和反应后的豆培养根提取物的胶原蛋白生成量的测量结果。
具体实施方式
在本说明书中,外植培养(explantation)也被称为外植或者体外培养,其主要指通过分离动植物中的部分并在体外对所分离的部分进行培养的技术。主要包括,在体外存活一段时间,再进行一段时间的培养而逐渐发生某些可见的变化。常规的组织培养也属于一种体外培养方法。此外,根据本发明一个方面的器内培养也属于体外培养,亦可称之为无菌培养或植物干细胞培养等。
在本说明书中,外植培养技术包括,通过提取选自原生质体、细胞、组织、器官、胚、种子、培养根以及植物的一部分中的一种或以上并使用含有养分的培养基等的人工培养器在器内(in-vitro)进行无菌培养,以使愈伤组织(callus)或单细胞群再生为具有有机体或完整功能的植物。
在本说明书中,“酶制剂(enzyme preparation)”是指,一种包括单一或多种活性酶以及辅助剂、添加剂等的制剂,其可以为市售的产品,亦或是在实验室中易于制备的物质。根据本说明书的一个实施例,公开了一种酶制剂,其为包含作为源自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的果胶酶(pectinase)中的一种的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase),且所述酶制剂可优选为果胶酶Ultra SP-L(ectinex Ultra SP-L,Novozyme公司,丹麦)。
以下,将详述本发明。
在一个方面,本发明可涉及一种用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物,其含有作为有效成分的豆科植物培养根的酶处理提取物,所述酶处理提取物为在所述豆科植物培养根的提取物中添加有酶或生成该酶的微生物的物质。
在另一方面,本发明可涉及豆科植物培养根的酶处理提取物在制备用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物中的用途,所述酶处理提取物为在所述豆科植物培养根的提取物中添加有酶或生成该酶的微生物的物质。
在又一方面,本发明可以涉及一种用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的豆科植物培养根的酶处理提取物,所述酶处理提取物为在所述豆科植物培养根的提取物中添加有酶或生成该酶的微生物的物质。
在一个实施例中,所述豆科植物可以是豆。在另一个实施例中,所述豆可以是选自大豆、扁豆、青仁黑豆、小黑豆(鼠目太豆)、黑豆、青豆、黄豆、红芸豆、芸豆、花芸豆、赤豆、黑赤豆、神话豆以及豆芽豆中的一种以上的豆,可优选为选自大豆、扁豆、青仁黑豆、小黑豆(鼠目太豆)、黑豆、青豆、黄豆、红芸豆、赤豆、黑赤豆以及神话豆中的一种以上的豆。所述豆的品种不受限制,但在一个方面,其品种可以为酱类和豆腐用、豆芽用、佐饭用、或幼豆用的品种。用作酱类和豆腐用的品种有大丰(Daepung,,品种保护申请:申请-2003-152)、湖酱(Hojang,品种保护申请:申请-2003-155)、状元(Jangwon,品种保护申请:申请-2001-34)、大潢(Daehwang,品种保护申请:申请-2000-19)、小谭(Sodamkong,品种保护申请:申请-1999-19)、松鹤(Songha,品种保护申请:申请-1999-22)、大元(Daewonkong,品种名称登录编号:第01-0003-38号)、真品(Jinpumkong,品种保护申请:申请-1998-204)、蛋白(Danbaegkong,品种保护申请:申请-1998-201)、豆油(Duyoukong,品种保护申请:申请-1998-151)、新八达(Shinpaldalkong,品种保护申请:申请-1998-199)、太光(Taekwangkong,品种保护申请:申请-1998-198)、万里(Mallikong,品种名称登录编号:第01-0003-11号)、长寿(Jangsukong,品种名称登录编号:第01-0003-9号),无限(Muhankong,品种名称登录编号:第01-0003-7号)、白云(Baegunkong,品种保护申请:申请-1998-193)、新粒(Saealkong,品种保护申请:申请-1998-143)、黄金(品种名称登录编号:第01-0003-1号)以及长叶(品种名称登录编号:第01-0003-41号)等。用作豆芽豆的品种有神话(Shinhwa,品种名称登录编号:第01-0003-134号)、小圆(Sowon,品种保护申请:申请-2000-16)、安平(Antiyeong,品种保护申请:申请-2003-151))、西南(Sunam,品种保护申请:申请-2003-153)、多彩(Daechae,品种保护申请:申请-2003-148)、小绿(品种保护申请:申请-2002-116)、小湖(Sohokong,品种保护申请:申请-2001-36)、疏明(Somyeongkong,品种保护申请:申请-1998-18)、多元(Daewon,品种保护申请:申请-1998-209)、丰产(Pungsannamul,品种保护申请:申请-1998-140),益山(Iksannamul,品种保护申请:申请-1998-139)、小白(品种名称登录编号:第01-0003-31号)、光安(Kwangankong,品种保护申请:申请-1998-202)、短叶和银河(Eunhakong,品种名称登录编号:第01-0003-6号)等。用作佐饭用品种有青磁(Cheongjakong,品种保护申请:申请-2001-38)、黑青(Heugcheong,品种保护申请:申请-2000-27)、褐味(品种保护申请:申请-2000-25)、鲜黑(Seonheukkong,品种保护申请:申请-1999-20)、黑豆以及一品黑豆(品种保护申请:申请-1998-158)等。用作幼豆品种有Daeol(/>品种保护申请:申请-2003-149)、新绿(Shinrok,品种保护申请:申请-2001-35)、Shineul/>黑乙/>夕凉/>幼豆、华严幼豆(品种名称登录编号:第01-0003-21)以及大乙/>等。在本发明的另一方面,所述豆优选为能够发芽并且抗害虫能力强的品种。这样的豆包括,例如神话、小圆、安平、西南、多彩、小绿、小湖、疏明、多元、丰产、益山、小白、光安、短叶和银河等。然而,根据本发明的一个方面的豆不限于上述豆品种。
根据本发明的一个方面的扁豆,也被称为半野生大豆nabdegi豆 nabjjolegi豆/>Napdre豆/>等。
在一个实施例中,所述酶可为果胶酶(pectinase)或多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)。
在另一个实施例中,所述酶可以以含有所述酶的酶制剂的形式进行添加,此时,基于酶制剂的总重量,所述酶制剂中的酶的含量可以为0.5至10重量%。
此外,在一个实施例中,所述微生物可以是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)。由于所述酶或酶制剂源自所述棘孢曲霉,因此通过使用所述微生物进行处理或发酵,可以获得相同于使用所述酶或酶制剂时的效果。
在一个实施例中,基于100重量份的所述豆科植物培养根的提取物,所述酶的添加量可以为0.8至8重量份。例如,基于100重量份的所述豆科植物培养根的提取物,所述酶的添加量可以为0.8重量份或以上、0.9重量份或以上、1重量份或以上、1.2重量份或以上、1.5重量份或以上、2重量份或以上、2.5重量份或以上、3重量份或以上、3.5重量份或以上、4重量份或以上、4.5重量份或以上、5重量份或以上、5.5重量份或以上、6重量份或以上、6.5重量份或以上、7重量份或以上、或7.5重量份或以上,或者可以为8重量份或以下、7.5重量份或以下、7重量份或以下、6.5重量份或以下、6重量份或以下、5.5重量份或以下、5重量份或以下、4.5重量份或以下、4重量份或以下、3.5重量份或以下、3重量份或以下、2.5重量份或以下、2重量份或以下、1.8重量份或以下、1.5重量份或以下、1.2重量份或以下、或1重量份或以下。
在另一个实施例中,基于所述豆科植物培养根的提取物的总重量,所述酶制剂的添加量可以为50重量%或以上、60重量%或以上、70重量%或以上、80重量%或以上、90重量%或以上、100重量%或以上、或者110重量%或以上,或者可以为120重量%或以下、110重量%或以下、100重量%或以下、90重量%或以下、80重量%或以下、70重量%或以下、或者60重量%或以下。优选地,基于所述豆科植物培养根的提取物的总重量,所述酶制剂的添加量可以为90至110重量%。
在一个实施例中,所述酶制剂的酶可以是能在植物组织中分解果胶的酶。具体地,所述酶制剂可以包含属于源自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的果胶酶(pectinase)中一种的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)作为酶制剂的酶,而在另一个实施例中,所述酶制剂还可以包含果胶反排除酶(pectintranseliminase)、果胶酯酶(pectinesterase)、半纤维素酶(hemicellulase)以及纤维素酶(cellulases)作为酶制剂的酶。在又一个实施例中,所述酶制剂可为pectinex ultra SPL(Novozyme公司,丹麦)。
在一个实施例中,基于所述酶制剂的总重量,多聚半乳糖醛酸酶的含量可以为0.1重量%或以上、0.5重量%或以上、0.8重量%或以上、1重量%或以上、1.2重量%或以上、1.4重量%或以上、1.6重量%或以上、1.8重量%或以上、2重量%或以上、2.2重量%或以上、2.6重量%或以上、2.8重量%或以上、3重量%或以上、3.2重量%或以上、3.4重量%或以上、3.6重量%或以上、3.8重量%或以上、4重量%或以上、4.2重量%或以上、4.4重量%或以上、4.6重量%或以上、4.8重量%或以上、5重量%或以上、5.2重量%或以上、5.4重量%或以上、5.6重量%或以上、6重量%以上、6.5重量%或以上、或者7重量%或以上,或者可以为8重量%或以下、7.5重量%或以下、7重量%或以下、6.5重量%或以下、6重量%或以下、5.8重量%或以下、5.6重量%或以下、5.4重量%或以下、5.2重量%或以下、5重量%或以下、4.8重量%或以下、4.6重量%或以下、4.4重量%或以下、4.2重量%或以下、和4重量%或以下、3.8重量%或以下、3.6重量%或以下、3.4重量%或以下、3.2重量%或以下、3重量%或以下、2.8重量%或以下、2.6重量%或以下、2.4重量%或以下、2.2重量%或以下、2重量%或以下、1.8重量%或以下、1.6重量%或以下、1.4重量%或以下、1.2重量%或以下、1重量%或以下、0.8重量%或以下、0.6重量%或以下、0.4重量%或以下、或者0.2重量%或以下。所述酶制剂中的多聚半乳糖醛酸酶的含量可优选为1至5重量%。
在一个实施例中,以酶活性(Enzymatic Activity)为基准,所述酶制剂中的多聚半乳糖醛酸酶的含量可以为2000units/mL或以上、2200units/mL或以上、2400units/mL或以上、2600units/mL或以上、2800units/mL或以上、3000units/mL或以上、3200units/mL或以上、3400units/mL或以上、3600units/mL或以上、3800个单位/mL或以上、4000units/mL或以上、4200units/mL或以上、4400units/mL或以上、4600units/mL或以上、或者4800units/mL或以上。此外,所述酶制剂中的多聚半乳糖醛酸酶的含量可以为5000units/mL或以下、4800units/mL或以下、4600units/mL或以下、4400units/mL或以下、4200units/mL或以下、4000units/mL或以下、3800units/mL或以下、3600units/mL或以下、3400units/mL或以下、3200units/mL或以下、3000units/mL或以下、2500units/mL或以下、或者2400units/mL或以下。优选地,所述酶制剂中包含的多聚半乳糖醛酸酶的含量可以为3800units/mL或以上。
在一个实施例中,以酶活性为基准,基于1g的所述豆科植物培养根的提取物,所述酶的添加量可以为2000至5000units。例如,以酶活性为基准,基于1g的所述豆科植物培养根的提取物,所述酶的添加量可以为2000units或以上、2200units或以上、2400units或以上、2600units或以上、2800units或以上、3000units或以上、3200units或以上、3400units或以上、3600units或以上、3800个units或以上、4000units或以上、4200units或以上、4400units或以上、4600units或以上、或者4800units或以上,或者可以为5000units或以下、4800units或以下、4600units或以下、4400units或以下、4200units或以下、4000units或以下、3800units或以下、3600units或以下、3400units或以下、3200units或以下、3000units或以下、2500units或以下、或者2400units或以下。优选地,以酶活性为基准,基于1g的所述豆科植物培养根的提取物,所述酶的添加量可以为3500至4200units。
在一个方面,所述酶或酶制剂的功能和作用在于通过去除所述豆科植物培养根提取物的香豆素(Coumestrin)中的糖,以使香豆素转化为香豆雌酚,从而使豆科植物培养根的品质保持稳定,且通过用于大量生产的外植培养与这些酶制剂的技术特征相结合,可显著提高并稳定地维持香豆雌酚的产量。
在一个实施例中,所述酶处理提取物为沉淀物,该沉淀物是通过将所述豆科植物培养根的提取物中添加酶或生成其的微生物所获得的反应物置于40至50℃、60至100rpm的条件下保持38至58小时后离心分离而获得。在一个方面,所述温度可以为40℃或以上、42℃或以上、44℃或以上、46℃或以上、48℃或以上,或者可以为50℃或以下、48℃或以下、46℃或以下、44℃或以下、或者42℃或以下。在一个方面,所述rpm可以为60或以上、70或以上、80或以上、90或以上、或者95或以上,或者可以为100或以下、95或以下、90或以下、85或以下、80或以下、75或以下、或者65或以下。在一个方面,所述时间可以为38小时或以上、40小时或以上、42小时或以上、44小时或以上、46小时或以上、48小时或以上、50小时或以上、52小时或以上、54小时或以上、或56小时或以上,或者可以为58小时或以下、56小时或以下、54小时或以下、52小时或以下、50小时或以下、48小时或以下、46小时或以下、44小时或以下、42小时或以下、或40小时或以下。
在一个实施例中,所述反应物可以为通过在所述豆科植物培养根的提取物中添加酶或微生物而获得的物质,所述反应物的浓度可以为0.5重量%或以上、1重量%或以上、1.5重量%或以上、2重量%或以上、2.5重量%或以上、3重量%或以上、5重量%或以上、或8重量%或以上、或者可以为10重量%或以下、8重量%或以下、5重量%或以下、3重量%或以下、2.5重量%或以下、2重量%或以下、1.5重量%或以下、1重量%或以下、或0.8重量%或以下。
在一个实施例中,所述豆科植物培养根的提取物可以为,将水、C1至C6低级醇、或它们的混合物作为溶剂,从所述豆科植物培养根中提取的物质。
在一个实施例中,所述混合物中的醇的浓度可以为60至100%(w/v)。例如,所述醇的浓度可以为60%(w/v)或以上、70%(w/v)或以上、75%(w/v)或以上、80%(w/v)或以上、85%(w/v的)或以上、90%(w/v)或以上、或95%(w/v)或以上,或者可以为100%(w/v)或以下、95%(w/v)或以下、90%(w/v)或以下、85%(w/v)或以下、80%(w/v)或以下、75%(w/v)或以下、70%(w/v)或更低、或65%(w/v)或以下。
在一个实施例中,所述低级醇可以为乙醇。
在另一个实施例中,所述豆科植物培养根的提取物可以为,通过将豆科植物培养根进行干燥后使用所述溶剂从干燥的培养根中提取的物质。
更具体地,所述豆科植物培养根的提取物可以为,将所述培养根经干燥得到的培养根与提取溶剂的重量比设定为1:10~1:70并提取所得的物质。例如、所述重量比可以为1:10或以上、1:15或以上、1:20或以上、1:25或以上、1:30或以上、1:35或以上、1:40或以上、1:45或以上、1:50或以上、1:55或以上、1:60或以上、或1:65或以上。此外,所述重量比可以为1:70或以下、1:65或以下、1:60或以下、1:58或以下、1:55或以下、1:52或以下、1:50或以下、1:48或以下、1:45或以下、1:42或以下、1:40或以下、1:38或以下、1:36或以下、1:35或以下、1:30或以下、1:25或以下、1:20或以下、或1:15或以下。
在一个实施例中,所述提取时间可以为20至28小时。具体地,所述提取时间可以为20小时或以上、22小时或以上、24小时或以上、25小时或以上、或26小时或以上,或者可以为28小时或以下、26小时或以下、25小时或以下、24小时或以下、22小时或以下、或21小时或以下。
在一个实施例中,所述豆科植物培养根的提取物可以为,通过将豆科植物培养根置于生物反应器内的培养基中,并在保持所述生物反应器内恒定的空气供应量的条件下经增殖的培养根的提取物。
在一个实施例中,所述生物反应器可以为搅拌式反应器(Stirred TankReactor)、鼓泡式反应器(Bubble Column Reactor)、空气提升式反应器(Air LiftReactor)、流化床反应器(Fludized Bed Reactor)、固定/填充床反应器(Fixed/PackedBed Reactor)、塔式发酵罐(Tower Fermenter),优选地,可以为球型气泡生物反应器(BulbType bubble bioreactor)。
在一个实施例中,所述培养基中的硝酸铵(NH4NO3)的浓度可以为650mg/L或以上、660mg/L或以上、700mg/L或以上、740mg/L或以上、760mg/L或以上、800mg/L或以上、825mg/L或以上、850mg/L或以上、900mg/L或以上、1000mg/L或以上、1200mg/L或以上、或1400mg/L或以上,或者可以为1500mg/L或以下、1400mg/L或以下、1200mg/L或以下、1000mg/L或以下、990mg/L或以下、900mg/L或以下、850mg/L或以下、825mg/L或以下、800mg/L或以下、760mg/L或以下、740mg/L或以下、700mg/L或以下、或660mg/L或以下。
在一个实施例中,所述培养基中的氯化钙(CaCl2·2H2O)的浓度可以为175mg/L或以上、176mg/L或以上、190mg/L或以上、200mg/L或以上、220mg/L或以上、240mg/L或以上、260mg/L或以上、264mg/L或以上、270mg/L或以上、300mg/L或以上、350mg/L或以上、或380mg/L或以上,或者可以为400mg/L或以下、380mg/L或以下、350mg/L或以下、300mg/L或以下、280mg/L或以下、270mg/L或以下、264mg/L或以下、260mg/L或以下、240mg/L或以下、220mg/L或以下、200mg/L或以下、190mg/L或以下、或176mg/L或以下。
在一个实施例中,所述培养基中的硫酸镁(MgSO4·7H2O)的浓度可以为145mg/L或以上、148mg/L或以上、150mg/L或以上、160mg/L或以上、180mg/L或以上、185mg/L或以上、190mg/L或以上、200mg/L或以上、215mg/L或以上、222mg/L或以上、240mg/L或以上、280mg/L或以上、或300mg/L或以上,或者可以为320mg/L或以下、300mg/L或以下、280mg/L或以下、240mg/L或以下、222mg/L或以下、215mg/L或以下、200mg/L或以下、190mg/L或以下、185mg/L或以下、180mg/L或以下、160mg/L或以下、150mg/L或以下、或148mg/L或以下。
在一个实施例中,所述培养基中的磷酸钾(KH2PO4)的浓度可以为65mg/L或以上、68mg/L或以上、70mg/L或以上、75mg/L或以上、80mg/L或以上、85mg/L或以上、90mg/L或以上、95mg/L或以上、100mg/L或以上、102mg/L或以上、120mg/L或以上、或140mg/L或以上,或者可以为150mg/L或以下、140mg/L或以下、120mg/L或以下、110mg/L或以下、102mg/L或以下、100mg/L或以下、95mg/L或以下、90mg/L或以下、85mg/L或以下、80mg/L或以下、75mg/L或以下、70mg/L或以下、或68mg/L或以下。
在一个实施例中,所述培养基中的硝酸钾(KNO3)的浓度可以为750mg/L或以上、760mg/L或以上、800mg/L或以上、850mg/L或以上、900mg/L或以上、950mg/L或以上、1000mg/L或以上、1140mg/L或以上、1200mg/L或以上、1400mg/L或以上,或者可以为1500mg/L或以下、1400mg/L或以下、1300mg/L或以下、1140mg/L或以下、1000mg/L或以下、980mg/L或以下、950mg/L或以下、900mg/L或以下、850mg/L或以下、800mg/L或以下、或760mg/L或以下。
在另一个实施例中,所述培养基中可以添加有IBA(indole-3-butyric acid,吲哚-3-丁酸)以及碳源。此时,所述碳源为选自葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、乳糖、棉子糖、直链淀粉、淀粉、山梨糖醇、甘露醇、以及甘油中的一种或多种物质。
在一个实施例中,所述培养基可以为MS培养基(Murashige and Skoog medium)。在一个方面,所述培养基内的成分种类可以与MS培养基内的成分种类相同,所述成分的浓度可以为MS培养基内成分浓度的40%或以上、45%或以上、50%或以上、55%或以上、或58%或以上,或者可以为60%或以下、55%或以下、50%或以下、或45%或以下。
在一个实施例中,当将所述培养根置于所述培养基时,所述培养基的pH值可以为4.8至6.8。具体地,所述pH值可以为4.8或以上、5或以上、5.2或以上、5.4或以上、5.6或以上、5.8或以上、6.0或以上、6.2或以上、6.4或以上、或6.6或以上。此外、所述pH值可以为6.8或以下、6.6或以下、6.4或以下、6.2或以下、6.0或以下、5.8或以下、5.6或以下、5.4或以下、5.2或以下、5.0或以下。
在一个实施例中,当将所述培养根置于所述培养基时,所述培养根的接种密度可以为2至6g/L。具体地,所述密度可以为2g/L或以上、3g/L或以上、4g/L或以上、或者5g/L或以上。此外、所述密度可以为6g/L或以下、5g/L或以下、4g/L或以下、或3g/L或以下。
在一个实施例中,所述增殖可以在19至25℃的黑暗条件下进行3至5周。具体地,所述温度可以为19℃或以上、20℃或以上、21℃或以上、22℃或以上、23℃或以上、或24℃或以上。此外,所述温度可以为25℃或以下、24℃或以下、23℃或以下、22℃或以下、21℃或以下、或20℃或以下。此外,所述增殖时间可以进行3周或以上、或4周或以上,或者可以进行5周或以下、或4周或以下。
在一个实施例中,所述空气供应量可以为0.05至0.4vvm(每分钟空气体积与培养基体积之比,通气比)。具体地,所述生物反应器内,可将空气供应量稳定地维持在0.05vvm或以上、0.08vvm或以上、0.1vvm或以上、0.12vvm或以上、0.14vvm或以上、0.16vvm或以上、0.18vvm或以上、0.2vvm或以上、0.22vvm或以上、0.24vvm或以上、0.26vvm或以上、0.28vvm或以上、0.3vvm或以上、0.32vvm或以上、0.34vvm或以上、0.36vvm或以上、或0.38vvm或以上。此外,所述空气供应量可以为0.4vvm或以下、0.38vvm或以下、0.36vvm或以下、0.34vvm或以下、0.32vvm或以下、0.3vvm或以下、0.28vvm或以下、0.26vvm或以下、0.24vvm或以下、0.22vvm或以下、0.2vvm或以下、0.18vvm或以下、0.16vvm或以下、0.14vvm或以下、0.12vvm或以下、0.1vvm或以下、0.08vvm或以下、或0.06vvm或以下。
如上所述,本发明的豆科植物培养根的酶处理提取物无需使用生长促进剂、肥料、农药等,而可以通过使用环保且稳定地大量收获的豆科植物培养组织,以发挥出环保且稳定的效果。
在一个实施例中,基于1g的所述酶处理提取物,所述酶处理提取物内香豆雌酚的含量可以为20至200mg。例如,基于1g的所述酶处理提取物,所述含量可以为20mg或以上、40mg或以上、60mg或以上、80mg或以上、100mg或以上、110mg或以上、120mg或以上、130mg或以上、140mg或以上、142mg或以上、143mg或以上、144mg或以上、144.27mg或以上、145mg或以上、145.5mg上述、146mg或以上、146.4mg或以上、147mg或以上、147.5mg上或以上、148mg或以上、148.5mg或以上、148.53mg或以上、149mg或以上、150mg或以上、155mg或以上、160mg或以上、170mg或以上、180mg或以上、或者190mg或以上,或者可以为200mg或以下、190mg或以下、180mg或以下、170mg或以下、160mg或以下、155mg或以下、150mg或以下、149mg或以下、148.6mg或以下、148.53mg或以下、148.5mg或以下、148mg或以下、147.5mg或以下、147mg或以下、146.4mg或以下、146mg或以下、145.5mg或以下、145mg或以下、144.5mg或以下、144.27mg或以下、144mg或以下、143mg或以下、142mg或以下、140mg或以下、130mg或以下、120mg或以下、110mg或以下、100mg或以下、80mg或以下、60mg或以下、或者40mg或以下。优选地,基于1g的所述酶处理提取物,所述香豆雌酚的含量可以为140至150mg。与未经使用酶制剂处理(基于1g提取物小于或等于1.7至1.9mg)的露地栽培的普通豆根部提取物相比,所述含量显著增加了约100倍。此外,与使用传统的MS培养基(Murashige and Skoog medium)的情况相比,所述含量约高出3倍或以上。
在一个实施例中,所述豆科植物培养根的酶处理提取物的含量可以占所述组合物总重量的0.1至100μg/ml。具体地,所述豆科植物培养根的酶处理提取物的含量可以占所述组合物总重量的0.1μg/ml或以上、0.5μg/ml或以上、1μg/ml或以上、5μg/ml或以上、10μg/ml或以上、15μg/ml或以上、20μg/ml或以上、25μg/ml或以上、30μg/ml或以上、35μg/ml或以上、40μg/ml或以上、45μg/ml或以上、50μg/ml或以上、55μg/ml或以上、60μg/ml或以上、65μg/ml或以上、70μg/ml或以上、75μg/ml或以上、80μg/ml或以上、85μg/ml或以上、90μg/ml或以上、或者95μg/ml或以上,或者可以是100μg/ml或以下、95μg/ml或以下、90μg/ml或以下、85μg/ml或以下、80μg/ml或以下、75μg/ml或以下、70μg/ml或以下、65μg/ml或以下、60μg/ml或以下、55μg/ml或以下、50μg/ml或以下、45μg/ml或以下、40μg/ml或以下、35μg/ml或以下、30μg/ml或以下、25μg/ml或以下、20μg/ml或以下、15μg/ml或以下、10μg/ml或以下、5μg/ml或以下、1μg/ml或以下、或0.5μg/ml或以下。可优选为1至10μg/ml。
在一个实施例中,所述组合物可以是化妆品组合物,所述化妆品组合物在剂型上不受特别限制,可以根据需要进行适当的选择。例如,可制备成选自润肤水、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、滋润乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华、面膜、香皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、身体乳和沐浴露中的一种或多种,并且不限于此。
根据本发明的化妆品组合物的剂型,还包含通常所使用的载体成分,并且除了包含所述豆科植物培养根的酶处理提取物之外,还可以进一步包含功能性添加剂以及化妆品组合物中通常所含有的成分。所述功能性添加剂可包括选自水溶性维生素、油溶性维生素、高分子肽、高分子多糖、鞘脂和海藻提取物中的成分。
在根据本发明的另一种化妆品组合物中,除了上述功能性添加剂之外,还可以根据需要配合化妆品组合物中通常所含有的成分。除此之外,所包含的配合成分例如有有机成分、保湿剂、润肤剂、界面活性剂、有机和无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调节剂、乙醇、色素、香料、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、纯净水等。
上述成分的配合量不受特别限制,本领域的技术人员在不损害本发明的目的和效果的范围内可容易地进行选定。
在一个实施例中,所述组合物可以为食品组合物,所述食品组合物的剂型没有特别限制,例如,可以制备成片剂、颗粒剂、丸剂、粉末、如饮料的液体、焦糖、凝胶、棒、茶叶袋等。除包含有效成分外,每种剂型的食品组合物还可包含相应领域中通常所使用的成分,本领域技术人员可以毫无困难地根据剂型或使用的目的选择这些成分进行配制,并且当与其它原料同时使用时可以获得协同效应。所述食品可为功能性保健食品。
所述组合物可以通过,例如,简单摄取、饮用、注射给药、喷雾给药或挤压给药等多种方法给药。
在根据本发明的一个方面的食品组合物中,所述有效成分的剂量确定属于本领域技术人员的水平范围内,根据给药对象的年龄、健康状态、并发症等多种因素可有所不同。
根据本发明的一个方面的食品组合物,例如可以为口香糖、焦糖产品、糖果类、冰淇淋类、饼干类等的各种食品;软饮料、矿泉水、酒精饮料等的饮料制品;包含维生素或矿物质等的功能性保健食品。
除了上述以外,根据本发明的一个方面的食品组合物可以包括各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、合成增味剂和天然增味剂等增味剂、着色剂及风味剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外,根据本发明的一个方面的食品组合物可以包括用于生产天然果汁和果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例并不重要,但在通常情况下,基于100重量份的根据本发明的一个方面的组合物,这些添加剂的含量为0重量份至约60重量份。在另一方面,本发明可以涉及一种用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物的制备方法,其包括:(1)将豆科植物培养根置于生物反应器内的培养基中,并在保持所述生物反应器内恒定的空气供应量的条件下进行增殖的步骤;(2)从经步骤(1)的培养根中获取提取物的步骤;以及(3)在所述提取物中添加酶制剂、酶或生成该酶的微生物的步骤。
在一个实施例中,在步骤(1)之前,所述方法可以包括在培养基中使豆科植物发芽的步骤。在另一个实施例中,在步骤(1)之前,所述方法还可以包括从豆科植物的植物体中诱导出豆科植物培养根的步骤。
另外,关于所述方法中的步骤(1)至(3)的主要成分的相关内容,与上述的本发明的用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的、包含作为有效成分的豆科植物培养根的酶处理提取物的组合物的详细说明内容相同,所以在此省略。
以下,将通过实施例和实验实施例对本发明的内容进行更详细地描述。以下所示的实施例和实验实施例仅是用于帮助理解本发明的内容,并不限制本发明的权力范围。本领域技术人员所做出的通常的公知的改变、替换及插入等属于本发明的保护范围。
[实施例1]豆种子的发芽及器内对植物体的诱导
将神话豆种子用2重量%的次氯酸钠(Sodium Hypochlorite)水溶液进行20分钟的表面杀菌后,用无菌水洗涤3次。然后,通过使用添加有30g/L蔗糖的0.5MS培养基(Murashige and Skoog Medium,Haarlem公司,荷兰),在保持25±1℃的光照条件下,在器内对植物体进行诱导两周。
[实施例2]豆培养根的诱导及增殖
在添加有4mg/L的IBA(吲哚-3-丁酸,indole-3-butyric acid;Sigma-Aldrich公司;Merck KGaA,Darmstadt,德国)、4mg/L的NAA(萘乙酸,Naphthalene Acetic Acid;Duchefa公司,荷兰)与30g/L蔗糖的1MS培养基中,在保持22±1℃的黑暗条件下,对经器内发芽的植物体幼根进行为期2周的培养根诱导。然后,在空气容积为3L的球型气泡生物反应器(易于市面购买)中,通过使用添加有4mg/L的IBA(吲哚-3-丁酸,indole-3-butyricacid;Sigma-Aldrich公司;Merck KGaA,Darmstadt,德国)与30g/L蔗糖的2L的0.5MS培养基(Murashige and Skoog medium,Duchefa公司,荷兰),对培养根进行为期4周的增殖。所述0.5MS培养基是指,将培养基中所使用的无机物等原料的浓度成为普通MS培养基的1/2的培养基。在此,通过用1N氢氧化钠将所使用的培养基的pH值调节至5.8,然后在121℃及1.2个大气压的条件下进行灭菌35分钟,而后通过将所述培养根切成1-1.5cm后,以活重为基准,以4g/L接种密度接种于所述培养基中,然后在维持22±1℃的黑暗条件下进行培养。在整个培养期间,使用空气流量计(air flow meters,RMA series;Dwyer Instruments,Inc.,美国)使空气供应量恒定地保持在0.1vvm,并且将供应到生物反应器中的空气依次通过用于冷凝压缩空气以保持一定温度的空气压缩机、用于除去杂质的过滤器及空气干燥器等后,通过使用无油的空气压缩机将空气供应到生物反应器内部。
[实施例3]提取物的制备及酶处理
1.提取物的制备
将从所述实施例1和2中获取并经干燥的豆培养根浸渍于80%(w/v)乙醇水溶液中且将培养根与乙醇水溶液的重量比维持在1∶30,并在室温下进行24小时的提取。通过使用滤纸过滤提取物,然后对溶剂进行蒸发干燥处理,以获得粉末状提取物。
2.酶处理
通过用相同于所述实施例3的1中所获的豆培养根提取物粉末的重量的液状果胶酶酶制剂(pectinex Ultra SP-L,ectinex Ultra SP-L,Novozyme公司,丹麦),对所述提取物粉末进行处理,然后通过使用蒸馏水,制备浓度为2重量%(2重量%的酶制剂与提取物粉末的混合物,以及98重量%的蒸馏水)的反应物(所述酶制剂中包含1至5重量%的作为果胶酶的多聚半乳糖醛酸酶,并以酶活性为基准,所包含的多聚半乳糖醛酸酶为3800units/mL或以上)。在45℃、80rpm的条件下,使所述反应物维持并反应48小时,然后通过离心分离机回收沉淀物。对所回收的沉淀物,即豆培养根的酶处理提取物,进行冷冻干燥,并制成粉末。
[实验实施例1]香豆雌酚分析实验
通过使用0.45μm过滤器,对酶处理前(所述实施例3.1的提取物)以及酶处理后(所述实施例3.2的沉淀物)的提取物进行过滤后,向装有UV检测器的高效液相色谱仪(HPLC,High Performance Liquid Chromatography)中分别注入10μL,以对豆培养根提取物中香豆雌酚的含量进行分析。通过使用色谱柱Mightysil RP-18GP 250-4.6(5μm,KANTOCHEMICALS公司,日本),在342nm波长下测量提取物中香豆雌酚的含量。测量结果示于表1和图1。
下表1比较了酶处理前和酶处理后的豆培养物根提取物中香豆雌酚的含量。在表1中,提取率是指,将豆培养根的投入量与根据所述实施例3.1的提取物的重量比值、以及豆培养根的投入量与根据所述实施例3.2的沉淀物的重量比值转换为百分率(%)的数值。
【表1】
此外,图1示出了酶反应前和酶反应后的豆培养根提取物中香豆素(Coumestrin)和香豆雌酚的HPLC色谱(高效液相色谱)确认结果。
从以上表1和图1的结果可知,通过酶处理去除提取物中香豆素的糖来使之转化为香豆雌酚,并且与通过常规方法获得的量相比,香豆雌酚的转化量有显著增加。此外,不同于在露地或野外栽培的普通的豆(源自种子、植物体)的提取物,当使用生物反应器时,可以常年生产品质均衡的豆培养根提取物,因此可确定,将这种外植培养技术与酶反应相结合时,可稳定持续地生产这种含有高含量香豆雌酚的豆培养根提取物。
[实验实施例2]胶原蛋白生成量的测量实验
通过使用I型前胶原C-肽(PIP)ELISA试剂盒(Procollagen Type I C-peptide(PIP)ELISA kit)来测量每个样品的胶原蛋白生成量,以确认酶处理前和处理后的豆培养根提取物中的胶原蛋白(collagen-I)的生成量。
具体地,将正常人真皮成纤维细胞(normal human dermal fibroblast,HDF)(购自韩国细胞株银行),以1x104 cells/well的浓度分株于40mm陪替氏平皿(Petri plate)中后,在37℃下培养24小时。然后,在所述细胞中分别处理黄豆苷元(daidzein)、香豆雌酚(coumestrol)、1μg/ml以及5μg/ml的酶处理前的豆培养根提取物(实施例3.1的提取物)、1μg/ml以及5μg/ml的酶处理后的豆培养根提取物(实施例3.2的沉淀物),在37℃下培养72小时后,分别收集各上清液,并使用I型前胶原C-肽(PIP)ELISA试剂盒(Takara公司)测量胶原蛋白-1的生成量。其结果示于图2。
从图2的结果可知,与未处理的对照组(2.3ng/ml)、作为异黄酮的一种的黄豆苷元(2.5ng/ml)、以及香豆雌酚(2.3ng/ml)相比,进行酶处理前的豆培养根提取物中的胶原蛋白的生成量(在1μg/ml和5μg/ml浓度中分别为2.5ng/ml和3.1ng/ml)更高或维持同等水平。反之,根据本发明的进行酶处理后的豆培养根提取物的胶原蛋白的生成量(在1μg/ml和5μg/ml浓度中分别为2.7ng/ml和3.9ng/ml)不仅高于对照组(未处理)、作为异黄酮的一种的黄豆苷元以及香豆雌酚,还高于进行酶处理前的豆培养根提取物。
总而言之,根据本发明的作为组合物的有效成分的实施例3.2的沉淀物(豆培养根的酶处理提取物),由于含有高含量的香豆雌酚从而表现出极好的生成胶原蛋白的效果,因此具有增强皮肤弹性、预防或改善皮肤皱纹的效果。
Claims (19)
1.一种豆科植物培养根的酶处理提取物在制备用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物中的用途,所述酶处理提取物为在所述豆科植物培养根的提取物中添加有酶或生成该酶的微生物的物质,所述酶为果胶酶或多聚半乳糖醛酸酶,所述微生物为棘孢曲霉,
基于1g的所述酶处理提取物,所述酶处理提取物中的香豆雌酚的含量为20至200mg。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,基于100重量份的所述豆科植物培养根的提取物,所述酶的添加量为0.8至8重量份。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,基于1g的所述豆科植物培养根的提取物,以酶活性为基准,所述酶的添加量为2000至5000units。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述酶处理提取物为沉淀物,该沉淀物是通过将所述豆科植物培养根的提取物中添加酶或生成其的微生物所获得的反应物置于40至50℃、60至100rpm的条件下保持38至58小时后离心分离而获得。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述豆科植物为选自大豆、扁豆、青仁黑豆、小黑豆、黑豆、青豆、黄豆、红芸豆、赤豆、黑赤豆或神话豆中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述豆科植物培养根的提取物为,通过用水、C1-C6低级醇、或它们的混合物作为溶剂,从所述豆科植物培养根中提取出的物质。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述混合物中的醇浓度为60至100%w/v。
8.根据权利要求7所述的用途,其特征在于,所述低级醇为乙醇。
9.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述提取时间为20至28小时。
10.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述豆科植物培养根的提取物为,通过将豆科植物培养根置于生物反应器内的培养基中并保持所述生物反应器内恒定的空气供应量的条件下,经增殖的培养根的提取物。
11.根据权利要求10所述的用途,其特征在于,所述生物反应器为球型气泡生物反应器。
12.根据权利要求10所述的用途,其特征在于,所述培养基中,硝酸铵(NH4NO3)的浓度为650至1500mg/L,氯化钙的浓度为175至400mg/L,硫酸镁的浓度为145至320mg/L,磷酸钾(KH2PO4)的浓度为65至150mg/L,硝酸钾(KNO3)的浓度为750至1500mg/L。
13.根据权利要求10所述的用途,其特征在于,所述培养基中添加有IBA(吲哚-3-丁酸)和碳源。
14.根据权利要求10所述的用途,其特征在于,所述培养基为MS培养基。
15.根据权利要求10所述的用途,其特征在于,将所述培养根置于所述培养基时,所述培养基的pH值为4.8至6.8,所述培养根的接种密度为2至6g/L。
16.根据权利要求10所述的用途,其特征在于,所述增殖是在19至25℃的黑暗条件下,进行3至5周。
17.根据权利要求10所述的用途,其特征在于,所述空气供应量为0.05至0.4vvm。
18.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述豆科植物培养根的酶处理提取物的含量占所述组合物总重量的0.1至100μg/ml。
19.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述组合物为化妆品组合物或食品组合物。
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