CN103239464A

CN103239464A - 淫羊藿次苷ii在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的用途

Info

Publication number: CN103239464A
Application number: CN201210032186XA
Authority: CN
Inventors: 徐金华; 董竞成; 吴金峰; 段晓虹; 秦海红; 朱小华
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2032-02-14
Also published as: CN103239464B

Abstract

本发明属生物医药领域，涉及淫羊藿次苷II在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的用途。经实验结果表明，淫羊藿次苷II可显著增强紫杉醇对肿瘤细胞增殖的抑制作用和紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡以及抑制TLR4通路增加化疗药的敏感性，可作为肿瘤化疗药物的增敏剂，应用于肿瘤化疗过程，从而明显促进不同肿瘤细胞对化疗药物的药物敏感性，因而能减少化疗药物的剂量，并减轻化疗药物对人体正常细胞的毒副作用。所述淫羊藿次苷II可作为活性成分，与药物学上可接受的载体联用，制成具有肿瘤化疗增敏作用的药物组合物，用于多种肿瘤包括但不限于黑色素瘤、皮肤鳞癌等的化疗增敏。

Description

淫羊藿次苷II在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的用途

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及中药有效成分淫羊藿次苷II新的药用用途，具体涉及淫羊藿次苷II在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的用途。

背景技术

化疗是目前临床治疗肿瘤及某些自身免疫性疾病的主要手段之一。在肿瘤治疗中，高浓度的化学药物(有时称为细胞毒药物)通常对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，但对正常组织器官的毒副作用较大，患者普遍有明显的恶心呕吐等副作用，导致患者不能耐受；而低浓度的化疗药物虽然患者耐受性较好，但对肿瘤细胞的杀伤作用往往不足。肿瘤化疗增敏剂是一种能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，减少化疗药物用量进而减低其毒副作用的药物。为减少化疗药物的毒副作用，提高疗效和避免耐药性的产生，临床实践中常选择不同的化疗增敏剂联合使用。

研究与实践显示，紫杉醇为目前公认的一种化疗药物；有研究发现，紫杉醇可激活肿瘤细胞表面的TLR4通路，引起下游抗凋亡基因的表达，从而引起化疗疗效降低，甚至是耐药。

从天然药物中筛选化疗增敏活性成分是治疗肿瘤的新方向，淫羊藿次苷II少量存在于淫羊藿药材中，其化学结构式如下：

淫羊藿次苷II

中国专利CN200780034447.9公开了“淫羊藿次苷II在制备皮肤增白药物中的应用”。然而，迄今为止，尚未见有关淫羊藿次苷II对肿瘤化疗药物具有增敏作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供中药有效成分淫羊藿次苷II新的药用用途，具体涉及淫羊藿次苷II在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的用途。

本发明中，所述的淫羊藿次苷II具有如下化学结构：

本发明通过抑制肿瘤细胞增殖试验，检测淫羊藿次苷II对肿瘤化疗药的增敏作用。

本发明采用WST-8检测淫羊藿次苷II增强紫杉醇对人黑色素瘤细胞株(A375)和人皮肤鳞癌细胞株(A431)增殖的抑制作用，结果显示，单独应用淫羊藿次苷II(10μM)孵育24h后A375细胞的存活率约为87％，单独应用紫杉醇(10nM)孵育24h后A375细胞的存活率约为87％，而联合用淫羊藿次苷II与紫杉醇孵育24h后A375细胞的存活率下降为55％，P＜0.01；结果还显示，单独应用淫羊藿次苷II(10μM)孵育24h后A431细胞的存活率约为76％，单独应用紫杉醇(10nM)孵育24h后A431细胞的存活率约为75％，而淫羊藿次苷II与紫杉醇联合孵育24h后A431细胞的存活率下降为53％，P＜0.01；结果证实，淫羊藿次苷II可显著增强紫杉醇对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明采用PI单标的流式细胞术检测淫羊藿次苷II增强紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡，结果显示，单独应用淫羊藿次苷II(10μM)孵育24h后A375细胞的凋亡峰(subG1)不明显，单独应用紫杉醇(10nM)孵育24h后A375细胞的凋亡峰(subG1)不明显，而淫羊藿次苷II与紫杉醇联合孵育24h后A375细胞的凋亡峰(subG1)明显升高；结果表明，淫羊藿次苷II可显著增强紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡。

本发明进行了淫羊藿次苷II抑制紫杉醇诱导的肿瘤细胞TLR4表达实验，结果显示，单独应用紫杉醇诱导A375细胞TLR4表达增加(培养基对照组为14.6％，单独紫杉醇组为36.3％)，而采用淫羊藿次苷II可有效降低紫杉醇引起的TLR4表达增加(28％)；结果表明，肿瘤细胞TLR4通路的活化与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关，作为活性成分的淫羊藿次苷II对化疗增敏的通路包括但不局限于抑制TLR4通路，此外，TLR4参与了肿瘤化疗的耐药；抑制TLR4通路可增加化疗药的敏感性，逆转化疗耐药。

上述实验结果表明，单独使用淫羊藿次苷II(10μM)对人黑色素瘤细胞株A375和人皮肤鳞癌细胞株A431株细胞增殖均无明显抑制作用，而联合应用淫羊藿次苷II(10μM)和化疗药物紫杉醇(10nM)可显著增强紫杉醇对所述肿瘤细胞株的化学治疗的疗效，淫羊藿次苷II的所述作用与抑制TLR4通路有关。所述的淫羊藿次苷II能为化疗增敏、增效、减毒发挥巨大作用，

根据本发明所揭示的淫羊藿次苷II作为肿瘤化疗药物的增敏剂的用途以及可显著增强紫杉醇对肿瘤细胞增殖的抑制作用和可显著增强紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡以及抑制TLR4通路增加化疗药的敏感性的作用，可以将淫羊藿次苷II应用与肿瘤化疗过程，从而明显促进不同肿瘤细胞对化疗药物的药物敏感性，因而能减少化疗药物的剂量，并减轻化疗药物对人体正常细胞的毒副作用。

本发明所述的淫羊藿次苷II可作为活性成分，与药物学上可接受的载体联用，制成治疗肿瘤化学药的增敏剂或具有肿瘤化疗增敏作用的药物组合物；

本发明所述的肿瘤包括但不限于黑色素瘤、皮肤鳞癌等。

附图说明

图1显示了淫羊藿次苷II增强紫杉醇对A375和A431肿瘤细胞增殖的抑制作用，

其中，IS为淫羊藿次苷II缩写，TA为紫杉醇缩写，药物干预时间为24h，检测方法为WST-8法，在490nm处检测各孔OD值；细胞存活率＝〔(加药组OD平均值-调零孔OD平均值)/(空白对照组OD平均值-调零孔OD平均值)〕×100％；与单纯应用紫杉醇组相比，**P＜0.01。

图2显示了淫羊藿次苷II增强紫杉醇诱导的A375肿瘤细胞凋亡，

其中，Medium为培养基对照，IS为淫羊藿次苷II缩写，TA为紫杉醇缩写，药物干预时间为24h，PI单标流式细胞术检测；Sub-G1代表凋亡峰。

图3显示了淫羊藿次苷II抑制紫杉醇诱导的A375肿瘤细胞TLR4蛋白表达，

其中，Unstain为未标记抗体，Medium为培养基对照，IS为淫羊藿次苷II缩写，TA为紫杉醇缩写，药物干预时间为24h；流式细胞术检测PE标记TLR4。

具体实施方式

实施例1

一、材料与方法

1.细胞株：

人黑色素瘤细胞株(A375)和人皮肤鳞癌细胞株(A431)均购自ATCC。上述细胞株用含有10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数为5％CO₂、完全饱和湿度条件下常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱合状态时，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化传代，2～3d传代1次，实验选用对数生长期细胞。

2.细胞增殖的检测：

分别调整A375和A431细胞株细胞悬液浓度为1×10⁵/mL，加入96孔培养板内，每孔100μL，置37℃5％CO₂孵箱培养24h。吸除旧培养基，以新的含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。以终浓度为10μM的淫羊藿次苷II预培养1小时，随后与终浓度为10nM的紫杉醇共孵育，并设空白对照组、单纯淫羊藿次苷II组、单纯紫杉醇组和调零组，每组均设3复孔。培养24h后，每孔加入10μL WST-8溶液，继续培养2h。在490nm处检测各孔的吸光值。细胞存活率＝〔(加药组OD平均值-调零孔OD平均值)/(空白对照组OD平均值-调零孔OD平均值)〕×100％。

3.细胞凋亡的检测

调整A375细胞悬液浓度为5×10⁵/mL，将细胞接种于6孔板，每孔1ml。待细胞生长达融合状态后，吸弃原培养基，以新的含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。以终浓度为10μM的淫羊藿次苷II预培养1小时，随后与终浓度为10nM的紫杉醇共孵育，并设空白对照组、单纯淫羊藿次苷II组和单纯紫杉醇组。药物作用24h后，把细胞上清吸至离心管内，细胞经胰酶消化后，移至与细胞上清相同的离心管内，1000rpm4℃离心5min，弃上清，用PBS洗1遍，弃上清，每管加10μLRNase，37℃孵育20min，随后加入10μL PI混匀后流式细胞仪上机检测。

4.TLR4蛋白表达的检测

调整A375细胞悬液浓度为1×10⁶/mL，将细胞接种于6孔板，每孔1ml。待细胞生长达融合状态后，吸弃原培养基，以新的含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。以终浓度为10μM的淫羊藿次苷II预培养1小时，随后与终浓度为10nM的紫杉醇共孵育，并设空白对照组和单纯紫杉醇组。药物作用24h后，把细胞上清吸至离心管内，细胞经胰酶消化后，移至与细胞上清相同的离心管内，1000rpm 4℃离心5min，弃上清，用PBS洗1遍，弃上清，加5μLPE标记的TLR4，室温孵育30min，随后PBS洗两遍，流式细胞仪上机检测。

二、实验结果

1.淫羊藿次苷II增强紫杉醇对肿瘤细胞增殖的抑制作用

采用检测细胞增殖与毒性的WST-8方法检测淫羊藿次苷II增强紫杉醇对肿瘤细胞增殖的抑制作用，实验结果显示，单独应用淫羊藿次苷II(10μM)孵育24h后A375细胞的存活率约为87％，单独应用紫杉醇(10nM)孵育24h后A375细胞的存活率约为87％，而淫羊藿次苷II与紫杉醇联合孵育24h后A375细胞的存活率下降为55％，P＜0.01；实验结果还显示，单独应用淫羊藿次苷II(10μM)孵育24h后A431细胞的存活率约为76％，单独应用紫杉醇(10nM)孵育24h后A431细胞的存活率约为75％，而淫羊藿次苷II与紫杉醇联合孵育24h后A431细胞的存活率下降为53％，P＜0.01；结果表明，淫羊藿次苷II可显著增强紫杉醇对肿瘤细胞增殖的抑制作用(如图1所示)。

2.淫羊藿次苷II增强紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡

采用PI单标的流式细胞术检测，结果显示，单独应用淫羊藿次苷II(10μM)孵育24h后A375细胞的凋亡峰(subG1)不明显，单独应用紫杉醇(10nM)孵育24h后A375细胞的凋亡峰(subG1)也不明显，而淫羊藿次苷II与紫杉醇联合孵育24h后A375细胞的凋亡峰(subG1)明显升高；结果表明，淫羊藿次苷II可显著增强紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡(如图2所示)。

3.淫羊藿次苷II抑制紫杉醇诱导的肿瘤细胞TLR4表达

基于若干肿瘤细胞表面表达TLR4，本实施例检测淫羊藿次苷II抑制紫杉醇诱导的肿瘤细胞TLR4表达情况，实验结果显示，单独应用紫杉醇可诱导A375细胞TLR4表达增加(培养基对照组为14.6％，单独紫杉醇组为36.3％)，而采用淫羊藿次苷II有效降低紫杉醇引起的TLR4表达增加(28％)；结果表明，肿瘤细胞TLR4通路的活化与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关，此外，TLR4参与了肿瘤化疗的耐药；抑制TLR4通路能增加化疗药的敏感性，逆转化疗耐药(如图3所示)。

Claims

1.淫羊藿次苷II在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的用途，其中，所述的淫羊藿次苷II具有如下化学结构：

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤化疗药物为紫杉醇。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为黑色素瘤或皮肤鳞癌。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤化疗药物增敏剂是黑色素瘤化疗药物增敏剂。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤化疗药物增敏剂是皮肤鳞癌化疗药物增敏剂。

6.一种包括肿瘤化疗增敏剂的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤化疗药物增敏剂以淫羊藿次苷II为活性成分。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤为黑色素瘤或皮肤鳞癌。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的淫羊藿次苷II通过增强紫杉醇对肿瘤细胞增殖的抑制和诱导的肿瘤细胞凋亡以及抑制TLR4通路对肿瘤化疗药物增敏。