CN115624567A

CN115624567A - 一种抗癌组合物、抗癌药物及其应用

Info

Publication number: CN115624567A
Application number: CN202211277359.4A
Authority: CN
Inventors: 董竞成; 唐照; 陈文晶; 杨芳勇
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2022-10-19
Filing date: 2022-10-19
Publication date: 2023-01-20

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗癌组合物、抗癌药物及其应用。本发明提供的抗癌组合物包括顺铂和减毒增效剂，其中减毒增效剂能够抑制LLC、H1299、A549和A549/DDP细胞的增殖，明显促进其凋亡，增加cleaved caspace‑3蛋白的表达，抑制LLC和A549荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长能力，与顺铂联合使用后，能够增强对肿瘤的抑制作用。

Description

一种抗癌组合物、抗癌药物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗癌组合物、抗癌药物及其应用。

背景技术

肺癌是人类最常见的癌症之一，据2021年GLOBOCAN发布的最新全球癌症统计报告(2020年版)显示，肺癌仍然位居全球范围内恶性肿瘤致死病因之首，2020年因肺癌死亡的总人数接近180万，占比约18％，比排列其后的结直肠癌和肝癌致死人数之和还多。在2020年的新发癌症数中，肺癌新发220多万(11.4％)，位居第二，仅略低于乳腺癌(226万多，11.7％)。

顺铂(Cisplatin)作为应用最广泛的铂类化合物，其抗瘤谱广、疗效显著，在临床上广泛使用顺铂治疗肺癌等多种实体瘤，但临床上顺铂经常产生耐药性，顺铂的耐药性强弱与癌症的类型有很大关系，小细胞肺癌对顺铂非常敏感，而非小细胞肺癌对顺铂容易产生抵抗。目前认为肺癌细胞对顺铂的耐药是多种影响因素共同作用的结果，其机制尚未完全明确，不仅给患者带来巨大的经济损失，还给患者和家属带来巨大的精神折磨。

淫羊藿次苷Ⅱ是存在于中药淫羊藿中的一种黄酮类单体。文献报道淫羊藿次苷Ⅱ具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤、调控脂质代谢等作用，目前并未有关于淫羊藿次苷Ⅱ与顺铂联合应用治疗肺癌的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗癌组合物、抗癌药物及其应用，解决癌症患者在治疗过程中容易对顺铂产生耐药性的问题，提高顺铂对癌症的治疗效果。

本发明提供了一种抗癌组合物，包括顺铂和减毒增效剂。

优选的，所述减毒增效剂包括淫羊藿次苷Ⅱ。

优选的，所述淫羊藿次苷Ⅱ和顺铂的摩尔浓度比为(10～40)：(1～150)。

本发明还提供了所述药物组合物在制备抗癌药物中的应用。

优选的，所述药物组合物中的淫羊藿次苷Ⅱ和顺铂同时给药。

优选的，所述抗癌药物包括抗肺癌药物。

优选的，所述肺癌包括非小细胞肺癌。

优选的，所述非小细胞包括LLC、H1299和A549。

本发明还提供了一种抗癌药物，包括上述技术方案所述的抗癌组合物和药学上可接受的载体。

优选的，所述抗癌组合物的质量百分含量＞98％。

本发明提供了一种抗癌组合物，包括顺铂和减毒增效剂。本发明将减毒增效剂和顺铂组合使用，减毒增效剂能够增强顺铂抑制肺癌细胞株LLC、H1299和A549的增殖，诱导细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspace-3的表达，加速LLC、H1299和A549凋亡，增强顺铂对肿瘤细胞的抑制作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为淫羊藿次苷Ⅱ在体外对肺癌细胞株LLC存活率的影响；

图2为淫羊藿次苷Ⅱ在体外对肺癌细胞株H1299存活率的影响；

图3为淫羊藿次苷Ⅱ在体外对肺癌细胞株A549存活率的影响；

图4为淫羊藿次苷Ⅱ在体外对肺癌细胞株A549/DDP存活率的影响；

图5为淫羊藿次苷Ⅱ在体外对四种肺癌细胞株LLC、H1299、A549、A549/DDP细胞凋亡情况的影响；

图6为淫羊藿次苷Ⅱ在体外对四种肺癌细胞株LLC、H1299、A549、A549/DDPCleaved caspace-3蛋白表达量的影响；

图7为淫羊藿次苷Ⅱ或联合顺铂对C57BL/6小鼠体重的影响；

图8为淫羊藿次苷Ⅱ或联合顺铂对LLC细胞(C57BL/6小鼠)皮下移植瘤的作用；

图9为C57BL/6小鼠不同组织HE染色结果；

图10为淫羊藿次苷Ⅱ或联合顺铂对LLC细胞(C57BL/6小鼠)皮下移植瘤中VEGFA和CD31蛋白表达量的影响(Westernblot)；

图11为淫羊藿次苷Ⅱ或联合顺铂对LLC细胞(C57BL/6小鼠)皮下移植瘤中VEGFA和CD31蛋白表达量的影响(免疫组化)；

图12为淫羊藿次苷Ⅱ或联合顺铂对BALB/c裸鼠体重的影响；

图13为BALB/c裸鼠不同组织HE染色结果；

图14为淫羊藿次苷Ⅱ或联合顺铂对A549细胞(BALB/c裸鼠)移植瘤中VEGFA和CD31蛋白表达量的影响(Westernblot)；

图15为淫羊藿次苷Ⅱ或联合顺铂对A549细胞(BALB/c裸鼠)移植瘤中VEGFA和CD31蛋白表达量的影响(免疫组化)；

图16为淫羊藿次苷Ⅱ或联合顺铂对A549细胞(BALB/c裸鼠)移植瘤的作用。

具体实施方式

本发明提供了一种抗癌组合物，包括顺铂和减毒增效剂。

在本发明中，所述减毒增效剂优选包括淫羊藿次苷Ⅱ。本发明所述淫羊藿次苷Ⅱ和顺铂的摩尔浓度比优选为(10～40)：(1～150)，进一步优选为(15～30)：(10～100)，更优选为(20～25)：(50～80)。本发明所述淫羊藿次苷Ⅱ本身抑制LLC、H1299、A549和A549/DDP细胞的增殖，明显促进其凋亡，增加cleaved caspace-3蛋白的表达，抑制LLC和A549荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长，并且按照设定的质量比将淫羊藿次苷Ⅱ与顺铂组合使用后，能够增强顺铂抑制肺癌细胞株LLC、H1299和A549的增殖，诱导细胞凋亡相关蛋白Cleavedcaspace-3的表达，加速LLC、H1299和A549凋亡，抑制LLC和A549荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长，增强顺铂对肿瘤细胞的抑制作用。本发明所述淫羊藿次苷Ⅱ的结构式如下：

本发明还提供了上述药物组合物在制备抗癌药物中的应用。本发明以所述药物中淫羊藿次苷II的质量计，所述药物的使用剂量优选为160～410mg/50kg/天/人。本发明对所述淫羊藿次苷II的来源没有严格要求，可购买获得或者自行制备，保证淫羊藿次苷II的纯度＞98％即可。本发明具体实施过程中，所述淫羊藿次苷II优选购自上海融禾医药科技发展有限公司。

在本发明中，所述药物组合物中的淫羊藿次苷Ⅱ和顺铂优选同时给药。本发明所述抗癌药物优选包括抗肺癌药物；所述肺癌优选包括非小细胞肺癌。实施例中为对所述肺癌进行清楚说明，选用细胞系LLC、H1299和A549，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。

本发明还提供了一种抗癌药物，有效成分包括上述抗癌组合物和药学上可接受的载体。本发明所述淫羊藿次苷II单独具备抑制LLC、H1299、A549和A549/DDP细胞的增殖，明显促进其凋亡，增加cleaved caspace-3蛋白的表达，抑制LLC和A549荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长的能力，与顺铂按照一定比例组合使用后，能够增强顺铂抑制肺癌细胞株LLC、H1299和A549的增殖，诱导细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspace-3的表达，加速LLC、H1299和A549凋亡，抑制LLC和A549荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长，增强顺铂对肿瘤细胞的抑制作用。

在本发明中，所述抗癌组合物的质量百分含量优选为＞98％。本发明对所述载体的种类和用量不作特殊限定，根据不同剂型要求常规添加即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1体外实验

1.实验试剂和材料

淫羊藿次苷II(上海融禾医药科技发展有限公司，纯度＞98％)，LLC细胞(中国科学院上海细胞库)，H1299细胞(中国科学院上海细胞库)，A549细胞(中国科学院上海细胞库)，A549/DDP细胞(中国科学院北京细胞库)。

2.淫羊藿次苷II细胞毒性试验

将淫羊藿次苷II(IS)用DMSO和0.9％NaCl溶解，配制成高浓度储备液，利用DMEM培养基稀释成0μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、12.5μmol/L、15μmol/L、17.5μmol/L、20μmol/L、25μmol/L和30μmol/L备用；

将LLC、H1299、A549和A549/DDP细胞分别以1000～4000个/孔的密度接种在96孔板中；细胞经24小时贴壁后，将不同浓度的淫羊藿次苷II分别加入到LLC、H1299、A549、A549/DDP细胞上，分别在24、48、72小时后，每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4小时。弃去液体，每孔加入150μL DMSO(设置至少5个重复孔)。振荡混匀，酶标仪检测490nm处光吸收值，用软件计算IC₅₀值，并利用如下公式计算对应癌细胞的增殖抑制率：

增殖抑制率＝〔1-(加药组OD平均值-调零孔OD平均值)/(空白对照组OD平均值-调零孔OD平均值)〕×100％。

IC₅₀值检测结果以及增殖抑制率计算结果如下表1和图1～4。

表1淫羊藿次苷Ⅱ对四种肺癌细胞的IC₅₀值

根据表1和图1～4可以看出，淫羊藿次苷Ⅱ在体外对四种肺癌细胞株(LLC、H1299、A549、A549/DDP)细胞增殖均显示了较强的抑制作用，以30μmol/L的浓度最为显著。

3.细胞凋亡实验

将LLC细胞以2000个/孔的密度接种在6孔板中；H1299、A549和A549/DDP细胞分别以4000个/孔的密度接种在6孔板中，将每种细胞平均分为空白对照组(control)组，淫羊藿次苷II(IS)组，顺铂(DDP)组，淫羊藿次苷II+顺铂(DDP+IS)组，每组至少重复3次，细胞培养24h后，按照表2方式干扰细胞48h，收集细胞培养液，离心得到漂浮的细胞，贴壁的细胞用胰酶消化后收集起来，漂浮和贴壁的细胞合在一起，共同孵育AnnexinV、PI抗体，室温20分钟，上流式细胞仪检测，检测结果表3和图5所示。

表2不同细胞干预方式

注：表中浓度为有效干扰浓度，各实验组别IS和DPP分别利用DMSO溶解后，利用DMEM培养基稀释，得到稀释液，其中稀释液中DMSO的浓度低于1‰。

表3淫羊藿次苷Ⅱ单独和联合顺铂对四种肺癌细胞细胞凋亡的作用

根据表3和图5可以看出，采用AnnexinV和PI双染的流式细胞术检测结果表明，淫羊藿次苷Ⅱ单独诱导LLC、H1299、A549、A549/DDP细胞的凋亡，与顺铂联合使用后，能显著增强顺铂的凋亡作用。

4.Cleaved caspace-3蛋白表达的检测

同步骤3，区别在于淫羊藿次苷II、顺铂、淫羊藿次苷II+顺铂干预细胞时间为24小时，药物作用24小时后收集细胞，抽提蛋白，定量后行SDS-PAGE电泳分离，待电泳完毕后转印至硝酸纤维素膜，在室温下封闭，加入Cleaved caspace-3一抗，4℃过夜，加入HRP标记二抗，室温反应1小时，增强化学发光法显色，曝光显影，结果如图6所示。

根据图6可以看出，淫羊藿次苷Ⅱ可以单独增加细胞凋亡相关蛋白Cleavedcaspace-3的表达，与顺铂联合使用后，能增强顺铂诱导的Cleaved caspace-3的表达。

实施例2体内实验

1.实验试剂和材料

淫羊藿次苷II(上海融禾医药科技发展有限公司，纯度＞98％)，LLC细胞(中国科学院上海细胞库)，A549细胞(中国科学院上海细胞库)、SPF级C57BL/6雄性小鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)、BALB/c裸鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)不含酚红和血清的DMEM培养基(美国Hyclone公司)。

2.淫羊藿次苷Ⅱ对LLC细胞皮下移植瘤的作用

2.1取状态良好的LLC细胞，消化洗涤后用不含酚红和血清的DMEM培养基定容，接种于5～6周龄的雄性C57BL/6小鼠右侧腋下，每只小鼠接受注射的细胞数约为4×10⁵个。隔天观察小鼠接种部位，6天后在注射接种的部位可以用手触及到绿豆大小较结实的肿块，则表明模型构造成功。

(1)造模成功后，将小鼠随机分成4组：肿瘤模型组(control)组，淫羊藿次苷II(IS)组，顺铂(DDP)组，淫羊藿次苷II干预(DDP+IS)组，每组10只，按照表3给药干预方式进行处理。

表3动物实验分组及给药干预方式

按照表3的方式给药持续2周，从造模开始，每两天称量一次小鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径，根据公式计算出肿瘤体积。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(V)＝0.5×(a×b²)，a和b分别代表肿瘤的最长径和最短径，结果如图7～8所示，根据图7～8可以看出，C57BL/6小鼠接受顺铂治疗后，体重明显下降。与肿瘤模型组相比，淫羊藿次苷II(IS)组，且表现出轻微上升趋势，表明淫羊藿次苷II对小鼠的体重没有损害作用。顺铂组和联合用药组小鼠不论是带瘤体重还是去瘤体重，都较对照组明显下降。在顺铂的基础上加用淫羊藿次苷II后，小鼠体重没有进一步的下降，甚至有增加的趋势；淫羊藿次苷Ⅱ能够单独抑制C57BL/6小鼠LLC移植瘤的生长，与顺铂联合使用后，淫羊藿次苷Ⅱ能够增强顺铂对肿瘤的抑制作用，显著降低小鼠的肿瘤体积和重量。

(2)处死步骤(1)小鼠，取小鼠的心脏、肝脏和肾脏，参照武汉赛维尔生物科技有限公司HE染色检测试剂盒说明书，进行HE染色，观察不同给药对小鼠这三种内脏组织的影响，结果如图9所示。根据图9可以看出，按照40m/kg的剂量单独给淫羊藿次苷II的C57BL/6小鼠未见明显的组织学改变。与单用顺铂组C57BL/6小鼠的组织进行比较，联合用药的C57BL/6小鼠没有见到进一步的病理学损伤，说明淫羊藿次苷II 40mg/kg对C57BL/6小鼠具有安全性，该剂量联合顺铂没有进一步的毒性作用。

(3)淫羊藿次苷Ⅱ对肿瘤组织中VEGFA和CD31的作用

处死小鼠后，取肿瘤组织，进行Westernblot和免疫组织化学染色(委托赛维尔武汉赛维尔生物科技有限公司进行)，检测肿瘤组织中VEGFA和CD31的蛋白水平，观察不同给药对肿瘤中VEGFA和CD31蛋白表达的影响，结果如图10和11所示。根据图10和图11可以看出淫羊藿次苷II和顺铂联用后，能够增强抗血管生成因子VEGFA和CD31的作用。

2.2同步骤2.1，区别在于将C57BL/6小鼠替换为BALB/c裸鼠，体重变化情况如图12，HE染色结果如图13，对肿瘤组织中VEGFA和CD31的作用如图。

根据图12可以看出，BALB/c裸鼠接受顺铂治疗后，体重明显下降。与肿瘤模型组相比，淫羊藿次苷II组小鼠的体重没有统计学差异，且表现出轻微上升趋势，表明淫羊藿次苷II对荷瘤小鼠的体重没有损害作用。

根据图13可以看出，按照40m/kg的剂量单独给淫羊藿次苷II的BALB/c裸鼠未见明显的组织学改变。与单用顺铂组BALB/c裸鼠的组织进行比较，联合用药的BALB/c裸鼠没有见到进一步的病理学损伤，说明淫羊藿次苷II 40mg/kg对BALB/c裸鼠具有安全性，该剂量联合顺铂没有进一步的毒性作用。

根据图14～15可以看出，淫羊藿次苷II和顺铂联用后，能够增强顺铂对血管生成因子VEGFA和CD31的抑制作用。

3.淫羊藿次苷Ⅱ对A549细胞裸鼠移植瘤的作用

取状态良好的A549细胞，消化洗涤后用不含酚红和血清的DMEM培养基定容，接种于5～6周龄的雄性C57BL/6小鼠右侧腋下，每只小鼠接受注射的细胞数约为6×10⁶个。隔天观察接种部位，含细胞的DMEM会逐渐被吸收，10天后可触及到绿豆大小较硬实的皮下肿块，按之不消退，表明造模成功。

造模成功后，按照步骤2表3的方式进行给药干预，

将小鼠随机分成6组：肿瘤模型组(control)组，淫羊藿次苷II(IS)组，顺铂(DDP)组，淫羊藿次苷II干预(DDP+IS)组，每组10只，按照表3给药干预方式进行处理，每三天采集一次小鼠体重和瘤径，计算出肿瘤体积。肿瘤体积＝0.5×(a×b²)，a和b分别代表肿瘤的最长径和最短径，给药14天后处死小鼠。结果如图16所示，根据图16可以看出，淫羊藿次苷Ⅱ能够单独抑制C57BL/6小鼠A549移植瘤的生长，与顺铂联合使用后，淫羊藿次苷Ⅱ能够增强顺铂对肿瘤的抑制作用，显著降低小鼠的肿瘤体积和重量。

本发明淫羊藿次苷Ⅱ能够抑制LLC、H1299、A549和A549/DDP细胞的增殖，明显促进其凋亡，增加cleaved caspace-3蛋白的表达，抑制LLC和A549荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长的能力，与顺铂联合使用后，能够增强顺铂对肿瘤的抑制作用。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种抗癌组合物，其特征在于，包括顺铂和减毒增效剂。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述减毒增效剂包括淫羊藿次苷Ⅱ。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述淫羊藿次苷Ⅱ和顺铂的摩尔浓度比为(10～40)：(1～150)。

4.权利要求1～3任一项所述药物组合物在制备抗癌药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中的淫羊藿次苷Ⅱ和顺铂同时给药。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物包括抗肺癌药物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肺癌包括非小细胞肺癌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述非小细胞包括LLC、H1299和A549中的一种或多种。

9.一种抗癌药物，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的抗癌组合物和药学上可接受的载体。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述抗癌组合物的质量百分含量＞98％。