CN103055048B - 一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法，将蔓荆子粉碎成粗粉，用80％乙醇提取，合并提取液，减压浓缩得浸膏I；将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用pH＝7的80％乙醇洗脱至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏II；将浸膏II分散于水中，超声溶解，将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用PH＝7的80％乙醇洗脱，至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏III；将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮；该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末，且具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用具有较强的推广与应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物提取技术领域，尤其涉及一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法。
背景技术
“肿瘤干细胞”假说是近年来提出的一种新理论，该假说认为只有很小一部分细胞具有引起肿瘤发生、维持肿瘤生长、保持肿瘤异质性和恶性表型的能力。CSCs是肿瘤的起源，它决定肿瘤的发生、发展与转移，是肿瘤临床治疗中最重要的靶细胞。因此，彻底地根除恶性肿瘤需要首先消灭CSCs。总之，CSCs理论为肿瘤的药物防治研究提供了新的途径和思路。因此，靶向CSCs的新型治疗药物的研究具有重大科学意义和潜在临床应用价值。
蔓荆子是用蔓荆植物(马鞭草科)果实制备的一种传统中药，亦作为民间药物使用，被认为是一种抗炎剂，在中国四川等地用于某些癌症的治疗。据报道称，蔓荆子粗提物以及活性成分紫花牡荆素能抑制多种肿瘤细胞的增殖和生长。一些饮食黄酮类化合物，比如姜黄素、槲皮素与表没食子儿茶素没食子酸盐和金雀异黄素等被发现可抑制CSCs自我更新。
发明内容
本发明提供了一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法，旨在从蔓荆子中提取具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用的总黄酮。
本发明的目的在于提供一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一，将蔓荆子粉碎成粗粉，60℃于干燥箱干燥1h，用80％乙醇提取，75℃回流提取3h/次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏I；
步骤二，将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，浓度为3mg/ml，pH＝3，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用pH＝7的80％乙醇洗脱至流出液无黄酮，流分合并，减压浓缩，得浸膏II；
步骤三，将浸膏II分散于水中，超声溶解，浓度为3mg/ml，pH＝3，再次将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用PH＝7的80％乙醇洗脱，至流出液无黄酮，合并流分，减压浓缩，得浸膏III；
步骤四，将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮。
进一步，在步骤一中，用80％乙醇提取时，用量为1∶5kg/L。
进一步，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末。
进一步，鉴别总黄酮的方法为：
取总黄酮5mg，用甲醇2ml溶解，滤过所得滤液作为供试品溶液；
取紫花牡荆素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇酯-甲醇(3∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％三氯化铝乙醇溶液；
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
进一步，总黄酮含量的检测方法为：
称取15.0mg芦丁对照品，用甲醇配制成100ml，分别取0.2、0.4、0.8、1.0、1.2ml稀释至10ml，即成浓度分别为3.00、6.00、12.00、15.00、18.00ug/ml的溶液；
用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制芦丁标准曲线；
取提取物11.0mg，用无水甲醇配制成50ml，取1.0ml，稀释至10ml，用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算即得。
进一步，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用。
本发明提供的从蔓荆子中提取总黄酮的方法，将蔓荆子粉碎成粗粉，用80％乙醇提取，合并提取液，减压浓缩得浸膏I；将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用pH＝7的80％乙醇洗脱至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏II；将浸膏II分散于水中，超声溶解，将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用PH＝7的80％乙醇洗脱，至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏III；将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮；该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末，且具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用，效果明显，具有较强的推广与应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的从蔓荆子中提取总黄酮的方法的实现流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
图1示出了本发明实施例提供的从蔓荆子中提取总黄酮的方法的实现流程。
该方法包括以下步骤：
步骤S101，将蔓荆子粉碎成粗粉，60℃于干燥箱干燥1h，用80％乙醇提取，75℃回流提取3h/次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏I；
步骤S102，将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，浓度为3mg/ml，pH＝3，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用pH＝7的80％乙醇洗脱至流出液无黄酮，流分合并，减压浓缩，得浸膏II；
步骤S103，将浸膏II分散于水中，超声溶解，浓度为3mg/ml，pH＝3，再次将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用PH＝7的80％乙醇洗脱，至流出液无黄酮，合并流分，减压浓缩，得浸膏III；
步骤S104，将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮。
在本发明实施例中，在步骤S101中，用80％乙醇提取时，用量为1∶5kg/L。
在本发明实施例中，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末。
在本发明实施例中，鉴别总黄酮的方法为：
取总黄酮5mg，用甲醇2ml溶解，滤过所得滤液作为供试品溶液；
取紫花牡荆素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇酯-甲醇(3∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％三氯化铝乙醇溶液；
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
在本发明实施例中，总黄酮含量的检测方法为：
称取15.0mg芦丁对照品，用甲醇配制成100ml，分别取0.2、0.4、0.8、1.0、1.2ml稀释至10ml，即成浓度分别为3.00、6.00、12.00、15.00、18.00ug/ml的溶液；
用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制芦丁标准曲线；
取提取物11.0mg，用无水甲醇配制成50ml，取1.0ml，稀释至10ml，用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算即得。
在本发明实施例中，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
【制法】取蔓荆子，粉碎成粗粉，60℃于干燥箱干燥1h；80％乙醇提取【1∶5(kg/L)】，75℃回流提取3h/次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏I；将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，浓度为3mg/ml，pH＝3，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点(黄酮类化合物基本吸附完全)。再用80％乙醇(pH＝7)洗脱至流出液无黄酮(方法同上)。流分合并，减压浓缩，得浸膏II；将浸膏II分散于水中，超声溶解，浓度为3mg/ml，pH＝3，再次将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点。再用80％乙醇(PH＝7)洗脱，至流出液无黄酮(方法同上)。合并流分，减压浓缩，得浸膏III；将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得蔓荆子总黄酮。
【性状】本品棕褐色粉末。
【鉴别】取本品5mg，用甲醇2ml溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取紫花牡荆素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(参照药典第一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇(3∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％三氯化铝乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【含量检测】总黄酮
1、芦丁标准曲线的建立
称取15.0mg芦丁对照品，用甲醇配制成100ml。分别取0.2，0.4，0.8，1.0，1.2ml稀释至10ml，即成浓度分别为3.00，6.00，12.00，15.00，18.00ug/ml的溶液。用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2、测定法
取提取物11.0mg，用无水甲醇配制成50ml。取1.0ml，稀释至10ml。用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度。从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算，即得。
本品按干燥品计算，含总黄酮量以芦丁计，不得少于45％。
1.蔓荆子总黄酮EFTF抑制鼻咽癌干细胞SP18细胞株细胞生长作用研究
平皿克隆形成法：人鼻咽癌干细胞SP18细胞株由中山大学肿瘤研究所建株[10]和惠赠。用含10％小牛血清RPMI1640培养液，置37℃，5％CO2培养箱培养，常规传代，取对数生长期细胞进行实验。体外培养人鼻咽癌干细胞细胞系SP18细胞，制备单细胞悬液，调节浓度为500个/mL。每处理组的培养体系为单细胞悬液(500个/孔)1.0mL，加入不同浓度的蔓荆子总黄酮EFTF，每种药物的终浓度分别为1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL，实验设空白对照组(加入等量培养基)和溶媒对照组(加入含等量0.1％DMSO的培养基)，每组设3个孔，接种于24孔板中，倒置显微镜下观察单细胞分散程度，置CO2培养箱中培养8天。待克隆形成，且没有融合前，每孔加入甲醇0.5mL，固定15min，吉姆萨染色10-30min。以细胞数大于50个或直径大于75μm为一个克隆，倒置显微镜下计数每孔克隆数。按下式计算细胞克隆形成抑制率。克隆形成抑制率(％)＝[1-(处理组集落均数/空白对照组集落均数)]×100％。
表1-1 EFTF对人鼻咽癌干细胞SP18细胞平皿克隆形成能力的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组比较：P＜0.05。
重复实验2次，得到类似结果。
2.EFTF显著地抑制肿瘤干细胞自我更新能力
干细胞培养液的配制：配制50ml干细胞培养基。将DMEM-F12倒入干净的50ml血清瓶中，分别加入1ml 50×B27，EGF 10μl，FGF 10μl，20％(m/v)浓度的BSA 1ml，insulin 8μl，双抗0.5ml，
配得以下浓度的干细胞培养液：
CD133阳性细胞的分选步骤：
1，样品的制备(去掉死细胞，防止非特异性结合到磁珠上)：
1)将需要分选的细胞消化成单细胞悬液，并收集至离心管中；
2)细胞计数；
3)离心细胞，600转/分，离心5分钟；
2，磁性标记(keep cells cold，Work fast)
4)弃上清液，加10ml预冷的缓冲液(PBS+0.5％BSA)重悬细胞；
5)离心细胞，600转/分，离心5分钟；
6)弃上清，每108细胞中加入300ul缓冲液(PBS+0.5％BSA)重悬，如果大于108，用相应倍数体积(如：2×108则用2倍体积)。
7)用手中指轻轻的拍打，混匀。
8)每108细胞中加入100ul FCR Blocking Reagent(即CD133抗体)；
9)每108细胞中加入100ul CD133MicroBeads(棕色)；
10)轻轻混匀，2-8℃或者4度冰箱中孵育30分钟，中间不断轻轻拍打混匀；
11)每108细胞中加入1-2ml缓冲液，600转/分离心5分钟，去掉上清。
12)每108细胞中加入500ul缓冲液重悬细胞；
3，磁性分选
13)根据总细胞数目选择合适的柱子和分离器(108个细胞或者不足108个细胞用MS柱，大于108个细胞用LS柱)，将分离柱装入分离器中。
14)用缓冲液冲洗磁珠柱一遍(MS柱：500ul；LS柱：3ml)；
15)将细胞悬液用手轻轻的晃动混匀，用移液枪吸入磁珠柱中，同时收集未被标记的细胞，此为CD133阴性细胞；
16)用下列体积的缓冲液冲洗柱3次：MS柱：100ul；LS柱：3ml；
17)将分离柱从分离器中拿出，置于新灭菌的离心管上方；
18)用下列体积的缓冲液洗脱标记的细胞：MS柱：1ml；LS柱：5ml；
19)并加压将CD133阳性细胞冲下；
20)洗下的阳性细胞液总悬液数，取20ul计数阳性细胞个数。
21)将洗脱的阳性细胞放入6孔超低粘附板中进行干细胞条件培养或者冻存。干细胞传代步骤：
1)将6孔超低粘附培养板中的干细胞及培养基一并吸出至新灭菌离心管中；
2)离心，600rmp，5min；
3)观察细胞沉淀，小心弃去上清，若沉淀已成悬液，则重新将细胞悬液移入新灭菌的小离心管重复离心；
4)用3mlPBS重悬细胞，再次离心，600rmp，5min；
5)再次弃去上清(最好用移液枪移出)；
6)加0.05％胰酶1ml，37℃培养箱中消化3min；
7)加2ml干细胞培养基终止消化，吹打均匀；
8)吸取吹打均匀的细胞悬液20ul进行细胞计数；
9)按相应的细胞梯度接种到新的6孔超低粘附培养板中
肿瘤球形成试验：肿瘤细胞成球培养，按照文献[11]描述的方法，使用干细胞培养基，通过机械和酶消化分离制备的单细胞悬液，在原代培养时，以每毫升2000个细胞的浓度，而在接下来的传代过程中，以每毫升1000个细胞的浓度接种于六孔超低粘附培养板中(Corbing，Acton，MA)。将不同浓度的EFTF添加到原代培养细胞培养基中，而第二代不加药物。培养7天后，在Nikon Eclipse TE2000-S显微镜下计数肿瘤细胞球的个数。
表2-1 EFTF对人肝癌SMMC-7721细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-2 EFTF对人肝癌SMMC-7721细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-3 EFTF对人肝癌MHCC97细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-4 EFTF对人肝癌MHCC97细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-5 EFTF对人肝癌Huh-7细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-6 EFTF对人肝癌Huh-7细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-7 EFTF对人肝癌Hep G2细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-8 DFOG对人肝癌Hep G2细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-9 DFOG对人结肠癌HCT-116细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-10 EFTF对人结肠癌HCT-116细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-11 EFTF对人结肠癌SW480细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-12 EFTF对人结肠癌SW480细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-13 EFTF对人肺癌H446细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-14 EFTF对人肺癌H446细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表15 EFTF对人卵巢癌SKOV3细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-16 EFTF对人卵巢癌SKOV3细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-17 EFTF对人卵巢癌OVCAR-3细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-18EFTF对人卵巢癌OVCAR-3细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CDl33-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-19EFTF对人卵巢癌A2780细胞系CD133+细胞原代成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
表2-20 EFTF对人卵巢癌A2780细胞系CD133+细胞二次成球能力的影响(n＝3，mean±SD)
a，示与亲本细胞(PC)和CD133阴性表达细胞(CD133-)比较：P＜0.05；b，示与溶媒组比较：P＜0.05.
重复实验2次，得到类似结果。
3.EFTF选择性抑制肿瘤干细胞增殖活性
肿瘤细胞系细胞或相应成球细胞以每孔5000个细胞接种于96孔细胞培养板中。用不同浓度EFTF孵育48h后，按照先前文献[4]描述的方法，用MTT比色法评价细胞增殖活性。结果表明，EFTF选择性抑制肿瘤干细胞(肿瘤球细胞)增殖活性。
表3-1EFTF对人肝癌SMMC-7721细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：6.6μg/mL；成球细胞：0.3μg/mL。
重复2次实验，得到类似结果。
表3-2EFTF对人肝癌MHCC97细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：13.2μg/mL；成球细胞：0.5μg/mL。
重复2次实验，得到类似结果。
表3-3EFTF对人肝癌Huh-7细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：9.9μg/mL；成球细胞：0.5μg/mL。
重复2次实验，得到类似结果。
表3-4 EFTF对人肝癌Hep G2细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：11.3μg/mL；成球细胞：0.9μg/mL。
重复2次实验，得到类似结果。
表3-5 EFTF对人结肠癌HCT-116细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：9.8μg/mL；成球细胞：0.6μg/mL。重复2次实验，得到类似结果。
表3-6 EFTF对结肠癌SW480细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：6.8μg/mL；成球细胞：0.6μg/mL。
重复2次实验，得到类似结果。
表3-7EFTF对H446细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：33.7μg/mL；成球细胞：0.7μg/mL。
重复2次实验，得到类似结果。
表3-8 EFTF对人卵巢癌SKOV3细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％ DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：14.3μg/mL；成球细胞：0.4μg/mL。
重复2次实验，得到类似结果。
表3-9 EFTF对人卵巢癌OVCAR-3细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％ DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：6.3μg/mL；成球细胞：0.6μg/mL。
重复2次实验，得到类似结果。
表3-10 EFTF对人卵巢癌A2780细胞系成球细胞增殖活性的影响(n＝3，Mean±SD)
a，示与溶媒组(0.1％DMSO)比较：P＜0.05。IC50：亲本细胞：3.1μg/mL；成球细胞：0.5μg/mL。
重复2次实验，得到类似结果。
4.肿瘤干细胞具有高致瘤性
为了证明肿瘤成球细胞具有更强的肿瘤形成能力，我们用不同细胞数目的肿瘤成球细胞接种Balb/c-nu免疫缺陷小鼠从而得到在体内成瘤的最小接种细胞数。肿瘤亲本细胞系细胞作为对照。只要1000～10000个肿瘤成球细胞就足够形成肿瘤，然而，在相应的同一模型下至少2～40×105个亲本细胞才能稳定导致肿瘤形成，此外，成瘤的时间长短亦有很大的差别。表明肿瘤球细胞具有肿瘤干细胞特性即高致瘤性。
表4-1 人肝癌SMMC-7721成球细胞和亲本细胞在Balb/c-nu免疫缺陷小鼠的肿瘤形成实验
表4-2 人肝癌MHCC97成球细胞和亲本细胞在Balb/c-nu免疫缺陷小鼠的肿瘤形成实验
表4-3 人肺癌H446成球细胞和亲本细胞在Balb/c-nu免疫缺陷小鼠的肿瘤形成实验
表4-4 人卵巢癌SKOV3成球细胞和亲本细胞在Balb/c-nu免疫缺陷小鼠的肿瘤形成实验
5.EFTF抑制原代肿瘤球形成细胞裸鼠移植瘤生长
关于小鼠所有实验都依据湖南师范大学伦理委员会和实验动物饲养和使用管理委员会批准的标准协议进行。与基质胶(BD Biosciences，San Jose，CA)(1∶1)混合第2代肿瘤球细胞(5×104/只)，注入4周龄的单一性别Balb/c-nu小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)皮下，按照文献[12]描述的方法，移植瘤体积用游标卡尺进行测量，按照公式V＝1/2(宽度2×长度)进行计算。细胞接种两周后，小鼠随机地分成4组，一组灌胃给予橄榄油作为对照，而另一组灌胃给予12.5、25.0、50.0mg/kg EFTF(溶解橄榄油中)，每天给药，持续2周。表5-1EFTF对人肝癌SMMC-7721细胞系第二代肿瘤球裸鼠皮下移植瘤生长的影响(n＝6，Mean±SD)
a，示与模型对照组比较：P＜0.05。b，示与DFOG(12.5mg/kg)组比较：P＜0.05。
表5-2EFTF对人肝癌MHCC97细胞系第二代肿瘤球裸鼠皮下移植瘤生长的影响(n＝6，Mean±SD)
a，示与模型对照组比较：P＜0.05。b，示与DFOG(12.5mg/kg)组比较：P＜0.05。
表5-3 EFTF对人肺癌H446细胞系第二代肿瘤球裸鼠皮下移植瘤生长的影响(n＝6，Mean±SD)
a，示与模型对照组比较：P＜0.05。b，示与DFOG(12.5mg/kg)组比较：P＜0.05。
表5-4 EFTF对人卵巢癌SKOV3细胞系第二代肿瘤球裸鼠皮下移植瘤生长的影响(n＝6，Mean±SD)
a，示与模型对照组比较：P＜0.05。b，示与DFOG(12.5mg/kg)组比较：P＜0.05。
6.EFTF抑制肿瘤干细胞二次裸鼠皮下成瘤
来自分离的原代移植瘤的活细胞。分为2组小鼠(每组6只)分别植入肿瘤细胞。每只二次接种Balb/c-nu小鼠左侧上肢皮下接种5×104个来自对照组小鼠肿瘤的细胞，而在对侧接种5×104个个来自给予EFTF(50.0mg/kg体重，每天1次，连续2周)的小鼠肿瘤的细胞。监测肿瘤的生长；而且每3天测1次肿瘤体积。当这两种肿瘤的较大者分别达500mm3以上时，小鼠被人道主义安乐死。
表6-1 EFTF对人肝癌SMMC-7721细胞系成球细胞裸鼠移植瘤二次体内成瘤的影响(n＝12)
表6-2 EFTF对人肝癌MHCC97细胞系成球细胞裸鼠移植瘤二次体内成瘤的影响(n＝12)
表6-3 EFTF对人肺癌H446细胞系成球细胞裸鼠移植瘤二次体内成瘤的影响(n＝12)
表6-4 EFTF对人卵巢癌SKOV3细胞系成球细胞裸鼠移植瘤二次体内成瘤的影响(n＝12)
本发明实施例提供的从蔓荆子中提取总黄酮的方法，将蔓荆子粉碎成粗粉，用80％乙醇提取，合并提取液，减压浓缩得浸膏I；将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用pH＝7的80％乙醇洗脱至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏II；将浸膏II分散于水中，超声溶解，将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用PH＝7的80％乙醇洗脱，至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏III；将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮；该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末，且具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用，效果明显，具有较强的推广与应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一，将蔓荆子粉碎成粗粉，60℃于干燥箱干燥1h，用80％乙醇提取，75℃回流提取3h/次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏I；
步骤二，将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，浓度为3mg/ml，pH＝3，将溶液过孔吸附树脂柱AB-8上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用pH＝7的80％乙醇洗脱至流出液无黄酮，流分合并，减压浓缩，得浸膏II；
步骤三，将浸膏II分散于水中，超声溶解，浓度为3mg/ml，pH＝3，再次将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱AB-8上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用PH＝7的80％乙醇洗脱，至流出液无黄酮，合并流分，减压浓缩，得浸膏III；
步骤四，将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮；
在步骤一中，用80％乙醇提取时，用量为1∶5kg/L；
该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末；
鉴别总黄酮的方法为：
取总黄酮5mg，用甲醇2ml溶解，滤过所得滤液作为供试品溶液；
取紫花牡荆素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇酯-甲醇3∶2∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％三氯化铝乙醇溶液；
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
总黄酮含量的检测方法为：
称取15.0mg芦丁对照品，用甲醇配制成100ml，分别取0.2、0.4、0.8、1.0、1.2ml稀释至10ml，即成浓度分别为3.00、6.00、12.00、15.00、18.00ug/ml的溶液；
用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制芦丁标准曲线；
取提取物11.0mg，用无水甲醇配制成50ml，取1.0ml，稀释至10ml，用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算即得；
该方法从蔓荆子中提取的总黄酮具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用。
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